|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Изучение механизмов направленного импорта молекул транспортных РНК в митохондрии дрожжей и человекаНИР
Studying the mechanisms of tRNA targeted import into yeast and human mitochondria
- Руководитель НИР: Балева М.В.
- Участники НИР: Дербикова К.С., Чичерин И.В.
- Подразделение: Биологический факультет
- Срок исполнения: 1 февраля 2016 г. - 31 декабря 2016 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 16-34-00978мол_а
- Номер ЦИТИС: 115042240026
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Физико-химические основы биологии и биотехнологии
- ПН России: Науки о жизни
- Направление технологического прорыва России: Медицинские технологии и лекарственные средства
-
Рубрики ГРНТИ:
- 34.15.15 Пространственная структура и свойства биополимеров
-
Ключевые слова:
импорт рнк в митохондрии, енолаза, рнк
-
Описание:
Импорт макромолекул в митохондрии – явление, широко распространенное в живой природе: оно было обнаружено у простейших, грибов, млекопитающих и растений. Несмотря на то, что механизм доставки белков в митохондрии изучен довольно подробно, импорт молекул нуклеиновых кислот продолжает оставаться неясным и малоизученным. У дрожжей Saccharomyces cerevisiae для доставки внутрь митохондрий тРНК (только одна тРНК, так называемая тРЛ1, может быть импортирована) привлекается один из ферментов гликолиза - енолаза (Eno2p). Показано, что енолаза не только связывает тРНК, но и индуцирует структурные перестройки молекулы. Более того, данные изучения доставки молекул тРЛ1 и синтетических молекул на их основе в клетках человека показывают схожесть механизмов импорта, используемых дрожжевой и человеческой клетками, что предполагает участие енолаз человека в данном процессе. Предполагаемый проект направлен на изучения характера комплекса, образующегося в результате взаимодействия молекул тРЛ1 и енолазы. Даже при малой эффективности процесса в живой клетке (около 5%), импорт тРЛ1 в изолированные митохондрии в присутствии идентифицированных факторов импорта составляет лишь доли процента, что может являться свидетельством наличия дополнительных белков, принимающих участие в доставки тРНК в митохондриальный матрикс
-
Планируемые результаты:
1. Константы диссоциации комплексa рекомбинантного дрожжевого белка Eno2p, полученного в нативных условиях, с тРЛ1 (транскриптом и нативной РНК). 2. На основании данных SAXS анализа предложена модель пространственной организации комплекса рекомбинантного белка Eno2p и транскрипта тРЛ1. 3. Список возможных белковых факторов импорта, прямо или опосредованно взаимодействующие с тРЛ1. Мы полагаем, что полученные в ходе выполнения проекта результаты позволят нам новые данные о молекулярных механизмах импорта тРНК в митохондрии дрожжей, знания о которых можно применить к человеческой системе и развитию генной терапии для лечения митохондриальных заболеваний
-
Основные результаты:
1. Константы диссоциации комплексa рекомбинантного дрожжевого белка Eno2p, полученного в нативных условиях, с тРЛ1 (транскриптом и нативной РНК). 2. На основании данных SAXS анализа предложена модель пространственной организации комплекса рекомбинантного белка Eno2p и транскрипта тРЛ1. 3. Список возможных белковых факторов импорта, прямо или опосредованно взаимодействующие с тРЛ1. Мы полагаем, что полученные в ходе выполнения проекта результаты позволят нам новые данные о молекулярных механизмах импорта тРНК в митохондрии дрожжей, знания о которых можно применить к человеческой системе и развитию генной терапии для лечения митохондриальных заболеваний
- Добавил в систему: Балева Мария Вячеславовна
Источник финансирования НИР
| грант РФФИ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 1 февраля 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Изучение механизмов направленного импорта молекул транспортных РНК в митохондрии дрожжей и человека |
| Результаты этапа: Импорт РНК в митохондрии играет важную роль для обеспечения нормального функционирования не только митохондрий, но всей клетки в целом. Механизмы, используемые для специфической доставки РНК внутрь митохондрий, не до конца ясны и является актуальной темой исследований на протяжении последних 30 лет. Для пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae был показан импорт одной из цитоплазматичских тРНК, тРНКLysCUU (тРЛ1). Импорт тРЛ1 является высокоспецифичным процессом, так как вторая лизиновая тРНК, тРНКLysUUU (тРЛ2), присутствует только в цитозоле. Импорт тРЛ1 в дрожжах осуществляется с помощью цитоплазматических белковых факторов, одним из которых является вторая изоформа гликолитического фермента енолазы – Eno2p. Рекомбинантная енолаза, выделеная в денатурирующих условиях, связывает тРЛ1 (Kd app = 2,5 мкM) и способствует связыванию тРЛ1 следующим белком, фактором импорта, preMSK1, снижая константу диссоциации комплекса тРЛ1-preMSK1 (со 180 nM до 40 nM). Выделение белка в денатурирующих условиях предполагает его денатурацию с последующей ренативацией. Чтобы избежать влияния эффектов неправильной ренатурации белка на его свойсваб была оптимизирована процедура очистки енолазы в нативных условиях. Аффинность выделенного белка к импортируемой тРЛ1 была проверена методом задержки в геле. Нативная енолаза связывает тРЛ1 (Kd app = 2 mkM). Кроме того, енолаза, выделенная в нативных условиях способна направлять импорт тРЛ1 in vitro. Данный результаты свидетельствуют в пользу того, что между енолазой и тРЛ1 образуется комплекс, структура которого была изучена с помощью метода малоуглового рассеивания рентгеновского излучения. Так как данный метод нуждается в большом количестве исходного материла, Были оптимизироваys условия транскрипции тРЛ1. Так как тРЛ1 начинается с последовательности GCCUU, которая не является благоприятной с точки зрения начала транскрипции. С целью увелечения количества получаемого транскрипта был получен генно-инженерный конструкт, несущий ген тРЛ1, фланкированный двумя рибозимами HMH и HdV, а также были оптимизированы условия транскрипции тРК1. По результатам анализа комплекса тРЛ1-енолаза оба компонента комплекса претерпевают значительные изменения, связанные в первую очередь с их фолдингом. Так тРЛ1 принимает конформацию отличную от классической. Енолаза входит в состав комплекса как мономер c «отогнутым» N-доменом. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".