Создание оптических сенсоров на основе ДНК-аптамеров для детектирования биологических объектовНИР

The development of DNA-aptamer-based optical sensors for the detection of biological objects

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 8 августа 2021 г.-30 июня 2022 г. Создание оптических сенсоров на основе ДНК-аптамеров для детектирования биологических объектов
Результаты этапа:
2 1 июля 2022 г.-30 июня 2023 г. Создание оптических сенсоров на основе ДНК-аптамеров для детектирования биологических объектов
Результаты этапа: Разработано несколько прототипов аптасенсоров определения респираторных вирусов: 1) на основе коллоидных наночастиц с фильтрацией через мембрану 2) твердотельный вариант - использование наноостровковых поверхностей и столбиков, полученных литографией 3) мембранный вариант - с использованием мембраны с SERS-активным слоем, через которую проходят белки и низкомолекулярные примеси, но остаются вирусы и сорбированные на их поверхности аптамеры. Первый вариант был успешно реализован в виде сенсора для определения вируса гриппа А. Сенсор работал следующим образом: наночастицы функционализировали аптамером RHA0385, инкубировали с R687, затем инкубировали с раствором вируса гриппа А. Для улучшения характеристик сенсора была использована фильтрация через трековую мембрану, и затем снимали SERS-спектры. В присутствие вируса гриппа А сигнал от краски снижался, что соответствует разрушению комплекса аптамер-R687 и удалению краски от поверхности наночастиц. Предел обнаружения составляет 10^3 VP/мл. Однако, этот вариант пока не удалось реализовать в виде мультиплексного анализа, поскольку не были найдены аналогичные пары аптамер – Рамановская метка, которые бы разрушались в присутствие аналита. Второй протестированный вариант - наностолбики, полученные литографией. Для этого типа SERS-подложек был использован подход с иммобилизацией на поверхности металла аптамеров с конъюгированным Рамановским красителем. Функционализация наностолбиков, полученных методом литографии дважды меченными аптамерами позволяет определять вирусы гриппа А, RSV, аденовирусы типов 3 и 5. Предел обнаружения сенсоров оценен как 600 VP/мл для вируса гриппа А, 70 VP/мл для аденовирусов типов 3 и 5, 3·10^4 VP/мл для RSV. Пределы обнаружения сопоставимы с ПЦР с обратной транскрипцией (600-1200 VP/мл для вируса гриппа А), при этом возможно создание мультиплексного сенсора с несколькими зонами, функционализированными разными аптамерами. 4 SERS-зоны были выгравированы на одной подложке, разделенные несмачиваемым полимером, что позволило функционализировать их разными аптамерами независимо. Именно этот вариант был использован для создания мультиплексного сенсора. Зоны литографической SERS-подложки инкубировали с одним из аптамеров к вирусу гриппа А / SARS-CoV-2 / RSV / к аденовирусу типов 3 и 5, затем SERS-подложки инкубировали со смесями 2-3 вирусов. Отношение SERS к SEL использовалось в качестве основного параметра для оценки из-за его воспроизводимости от образца к образцу. Этот параметр уменьшался в присутствии вируса-мишени в случаях RBD-1C с SARS-CoV-2, RHA0385 с вирусом гриппа A и H8 с RSV. Аналитический сигнал увеличивался при образовании комплекса ADV-20 с аденовирусом 5-го типа. Граничные значения отношения SERS к SEL были оценены как самые высокие/самые низкие значения в образцах без целевого вируса. Различия между вирусоположительными и вирусотрицательными образцами были статистически значимыми со значениями p-value около 0,99. Разработанный сенсор успешно различил все предложенные смеси вирусов. Аптасенсор имеет минимальную кросс-специфичность, в текущем варианте он обеспечивает только качественную оценку наличия вирусов. Принципиально возможна полуколичественная оценка, что было продемонстрировано для одиночны сенсоров. Дальнейшая оптимизация сенсоров может обеспечить это важное свойство тестовой системы. Третий вариант - с использованием мембраны с SERS-активным слоем, через которую проходят белки и низкомолекулярные примеси, но остаются вирусы и сорбированные на их поверхности аптамеры. Трековые мембраны, покрытые наночастицами Ag/Cr, были функционализированы SH-RHA0385-Cy3 аптамера к вирусу гриппа А. Через мембрану образцы с разным количеством вирусов гриппа А и контрольных биологических жидкостей. В присутствии вируса гриппа А увеличивался ГКР сигнал и флуоресценция. Одна из причин кратного увеличения сигнала – образование агрегатов из вирусов и наночастиц. Интенсивность спектров сначала увеличивается с увеличением концентрации вируса, а затем несколько снижается. Предел обнаружения сенсора – 10 вирусных частиц на мл (VP/мл) вируса гриппа А или 2 VP/мл в образце. Это значение даже ниже, чем предел обнаружения метода ПЦР с обратной транскрипцией (∼10^3 VP/мл). Предложенный принцип работает на вирусах гриппа А и В, a также RSV, и гипотетически может быть использован для создания мультисенсора. Хотя трековые мембраны давали наименьший предел обнаружения, однако, попытки нанести на одну мембрану 3-4 зоны с разными аптамерами пока не увенчались успехом. В связи с этим работающий мультиплексный сенсор на этом принципе не был разработан. Результаты проекта представлены в ряде публикаций: https://scientificrussia.ru/articles/novyj-krasitel-pomog-bystro-i-tocno-vyavit-virus-grippa-i-mikrobnoe-zagraznenie http://www.chem.msu.ru/rus/advances/2022-10-20-virus/ https://poisknews.ru/wp-content/uploads/2022/08/poisk_34-35_20220826.pdf

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".