Разработка отечественного инновационного тераностического препарата на основе изотопов тербия для проведения радиоиммунной терапии злокачественных новообразований различного гистологического типа (Химический факультет)НИР

Development of a domestic innovative theranostic drug based on terbium isotopes for radioimmune therapy of malignant neoplasms of various histological types

Источник финансирования НИР

Хоздоговор, средства организации государственного сектора (608)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 30 ноября 2021 г.-30 декабря 2021 г. Разработка отечественного инновационного тераностического препарата на основе изотопов тербия для проведения радиоиммунной терапии злокачественных новообразований различного гистологического типа
Результаты этапа: Разработана и утверждена программа курсов дополнительного образования по основам радиофармацевтической химии. В рамках данного курса рассматриваются методы, используемые при получении и выделении радионуклидов, разработке, синтезе и контроле качества радиофармацевтических препаратов, а также рассмотрены моменты радиационной безопасности и надлежащей производственной практики при получении и использовании радиофармпрепаратов.
2 1 января 2022 г.-30 декабря 2022 г. Разработка отечественного инновационного тераностического препарата на основе изотопов тербия для проведения радиоиммунной терапии злокачественных новообразований различного гистологического типа
Результаты этапа: Раздел 1. Проведение курса лекций по методам ядерной медицины в рамках дополнительного образования Разработаны программы курсов дополнительного образования: Методы ядерной медицины, утвержденная учебная программа прилагается к этому отчету (Приложение А). В ходе реализации второго этапа проекта обучение по разработанным образовательным программам велось на базе ФГБОУ ВО "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова". В учебный план была внесена дополнительная профессиональная программа повышения квалификации «Методы ядерной медицины». По данной программе прошли обучение 15 слушателей. В результате обучения были сформированы следующие компетенции: 1. Умение контролировать качество физических и технических аспектов проведения радионуклидной диагностики, радионуклидной терапии и контактной лучевой терапии; 2. Готовность к практической работе с облученными мишенями и изотопными генераторами; 3. Владение навыками выделения радионуклидов и методами их анализа; 4. Способность и готовность проводить синтез РФП; 5. Владение методами контроля качества РФП. В процессе обучения использовались следующие технологии: проблемно-ориентированные лекции, лекции-демонстрации, интерактивные лекции. Лекции читались ведущими учеными Московского университета и приглашенными российскими и зарубежными учеными с мировым именем, специализирующимися в области ядерной медицины. По итогам обучения была проведена итоговая аттестация экзамен и выдана справка об обучении. Все запланированные работы этого раздела были выполнены в полном объеме, полученные результаты соответствуют заявленным. К отчету прилагаются Ведомость студентов, прошедших обучение, и Справка об обучении № … от ….2022. Раздел 2. Получение 161Tb. Фотоядерное получение 161Tb Медицинский радионуклид 161Tb получали с помощью фотоядерной реакции облучением фотонами мишени из оксида диспрозия природного состава (χ(156Dy) = 0,056%, χ(158Dy) = 0,095%, χ(160Dy) = 2,329%, χ(161Dy) = 18,889%, χ(162Dy) = 25,475%, χ(163Dy) = 24,896%, χ(164Dy) = 28,26%) в НИИЯФ МГУ. Длительность облучения составляла 6 ч. Материал мишени отделяли от алюминиевой подложки, взвешивали и растворяли в 5,6 M HNO3. Раствор упаривали практически досуха и доводили до 2 мл 0,5 М HNO3. Колонка высотой 25 см и внутренним диаметром 4 мм была заполнена сорбентом LN Resin (размер зерен 100–150 мкм, производства TrisKem International), предварительно уравновешенным в 0,5 М HNO3. Для каждого эксперимента брали 1 г сухой смолы. Всего было проведено два эксперимента с аликвотами растворенной мишени, содержащими разные массы стабильного диспрозия (№ 1 – 2 мг и № 2 – 20 мг), для установления оптимального диапазона емкости сорбента. Сначала элюировали 0,5 М HNO3, затем кислотность меняли на 3 М HNO3. Фракции собирали по 5 мл и контролировали содержание радионуклидов методом гамма-спектрометрии по линиям 25,65 кэВ (161Tb) и 326,16 кэВ (157Dy). Фракции № 5–9 из эксперимента № 2, содержащие большую часть 161Tb объединяли, упаривали почти досуха и доводили до 1 мл 0,5 М HNO3. Затем процедуру разделения повторяли (эксперимент № 3). Объединенную фракцию 161Tb из эксперимента 3 упаривали до 5 мл и измеряли гамма-спектр с длительной экспозицией. Калибровка по эффективности выполнялась с использованием ОСГИ 152Eu, 137Cs и 241Am. Для установления выходов ядерных реакций была облучена мишень №3, содержащая 175,5 мг по металлическому диспрозию. На рис. 1 представлен гамма-спектр облученной мишени. Основными радионуклидами, присутствующими в мишени, оказались 161Tb, 155Dy и 157Dy (Таблица 1). Рис. 1. Гамма-спектр облученной мишени. ** - 370 и 376 кэВ - пики суммирования гамма и рентгеновских квантов: 326 кэВ (157Dy), 44 кэВ (X-ray) и 49 кэВ (161Tb). Таблица 1. Радионуклиды, идентифицированные в мишени, их активности и выходы Радионуклид T1/2 Пути образования Гамма-линии, кэВ (%) Активность на EOB, Бк Выход, кБк·мкА-1·ч-1·см2·гDy2O3-1 155Dy 9.9 h 156Dy(γ,n) 158Dy(γ,3n) 226.918 (68.7); 184.564 (3.39); 905.8 (2.46); 999.7 (2.45); 664.173 (2.25); 1155.47 (2.10); 498.617 (1.76); 1166.22 (1.70) 940±170 25±4 157Dy 8.14 h 158Dy(γ,n) 160Dy(γ,3n) 326.336 (93); 182.424 (1.33); 265.469 (0.17) 8800±500 249±15 155Tb 5.32 d 155Dy→155Tb 156Dy(γ,p) 158Dy(γ,p2n) 105.318 (25.1) 44.9±5.9 1.6±0.3* 160Tb 72.3 d 161Dy(γ,p) 162Dy(γ,pn) 163Dy(γ,p2n) 879.378 (30.1); 298.578 (26.1); 966.166 (25.1) 48.5±3.2 1.0±0.1 161Tb 6.89 d 162Dy(γ,p) 163Dy(γ,pn) 164Dy(γ,p2n) 25.651 (23.2); 74.567 (10.2) 668±15 14.4±0.3 163Tb 19.5 m 164Dy(γ,p) 351.2 (26); 389.8 (24); 494.5 (22.5); 421.9 (11.5); 533.0 (9.5); 316.4 (8.3); 250.8 (6.7); 347.8 (6.2); 338.5 (4.5) 7000±900 2200±300 * Активность 155Tb рассчитана на 40 часов после EOB, когда накопление 155Tb из 155Dy проходит через максимум, исходя из выхода 155Dy Выделение 161Tb Для разделения Dy и Tb был выбран сорбент на основе Ln Resin (Triskem int), традиционно используемый для разделения лантанидов. Прочность связи с сорбентом увеличивается с увеличением атомного номера и уменьшением ионного радиуса металла РЗЭ. В случае фотоядерного получения радиоизотопов РЗЭ это дополнительно усложняет разделение, так как более тяжелый элемент присутствует в виде макрокомпонента. Коэффициенты емкости k’ для РЗЭ в азотнокислых средах представлены на рис. 2 154. Из приведенной зависимости факторов удерживания для различных лантанидов видно, что k’(Tb) и k’(Dy) очень близки, и оптимальная для разделения концентрация азотной кислоты лежит в пределах между 0,5 и 1,5 М. Рис. 2. Фактор удерживания k’ различных лантанидов на LN resin в зависимости от концентрации азотной кислоты. Возможность разделения проверяли при двух разных массах, загружаемых на колонку: 2 и 20 мг в пересчете на металлический диспрозий. В первом разделении использовали раствор, содержащий 2 мг диспрозия (рис.3). Рис. 3. Хроматограмма выделения 161Tb при загрузке 2 мг мишенного материала (при пересчете на металлический Dy). Было показано, что при загрузке 2 мг диспрозия разделение проходит успешно. Однако добиться разделения за один этап при загрузке большей массы диспрозия (20 мг) невозможно (рис.4). Рис. 4. Хроматограмма выделения 161Tb при загрузке 20 мг мишенного материала (при пересчете на металлический Dy). Как видно из полученных хроматограмм, с увеличением массы РЗЭ до 20 мг хроматографическое поведение как макро-, так и микрокомпонентов резко меняется и разделения диспрозия и тербия не происходит, что может быть связанно с максимальной емкостью самой смолы. После второго разделения были собраны фракции, содержащие основную часть тербия и не более 2 мг диспрозия (фракции с 30 по 50 мл, выделены синим). Эти фракции были объединены и подвергнуты повторному разделению (рис.5). Рис. 5. Хроматограмма повторного разделения фракций, содержащих 161Tb. Повторное разделение также было успешным, поэтому фракции, содержащие тербий, были объединены, упарены до объема 5 мл и измерены на гамма-спектрометре (рис. 6). Как видно из представленного спектра, пики, соответствующие 155Dy (226 кэВ) и 157Dy (326 кэВ), отсутствуют. Появление пиков 155Tb может быть связано с его накоплением в результате распада 155Dy в исходном растворе. После измерения раствор тербия был упарен и переведен в 0,1 М HCl для проведения экспериментов по мечению. Исходная активность 161Tb в мишени составила 380 Бк, что недостаточно для проведения экспериментов in vivo. Увеличения активности можно достичь при использовании мишени, обогащенной по изотопу 162Dy. Рис. 6. Гамма-спектр раствора 161Tb: общий вид, синим выделен увеличенный фрагмент (сверху); увеличенный фрагмент (снизу). * - пики, относящиеся к природному фону.
3 1 января 2023 г.-29 декабря 2023 г. Разработка отечественного инновационного тераностического препарата на основе изотопов тербия для проведения радиоиммунной терапии злокачественных новообразований различного гистологического типа
Результаты этапа: Раздел 1. Чтение курса лекций по методам ядерной медицины в рамках дополнительного образования Разработана программа курсов дополнительного образования: Методы ядерной медицины, утвержденная учебная программа прилагается к этому отчету (Приложение А). В ходе реализации третьего этапа проекта обучение по разработанной программе курсов дополнительного образования «Методы ядерной медицины» велось на базе ФГБОУ ВО "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова". В учебный план была внесена дополнительная профессиональная программа повышения квалификации «Методы ядерной медицины». По данной программе прошли обучение 26 слушателей в период с 20 по 31 июля 2023 года. В результате обучения были сформированы следующие компетенции: 1. Умение контролировать качество физических и технических аспектов проведения радионуклидной диагностики, радионуклидной терапии и контактной лучевой терапии; 2. Готовность к практической работе с облученными мишенями и изотопными генераторами; 3. Владение навыками выделения радионуклидов и методами их анализа; 4. Способность и готовность проводить синтез РФП; 5. Владение методами контроля качества РФП. В процессе обучения использовались следующие технологии: проблемно-ориентированные лекции, лекции-демонстрации, интерактивные лекции. Лекции читались ведущими учеными Московского университета и приглашенными российскими учеными с мировым именем, специализирующимися в области ядерной медицины. По итогам обучения была проведена итоговая аттестация экзамен и выданы удостоверения о повышении квалификации. Все запланированные работы этого раздела были выполнены в полном объеме, полученные результаты соответствуют заявленным. К отчету прилагается Макет программы повышения квалификации, протокол приемной комиссии, приказ о зачислении слушателей, протокол аттестационной комиссии, приказ о выдаче документов о дополнительном образовании. Раздел 2. [161Tb]Tb-DOTA-тифетрилит – потенциальный радиофармпрепарат для терапии нейроэндокринных опухолей Нейроэндокринные опухоли - редкие, но трудно диагностируемые заболевания, для которых характерна повышенная экспрессия рецепторов гормона соматостатина (SST) на поверхности опухолевых клеток. Для лечения таких заболеваний применяются различные аналоги соматостатина, среди которых циклические октапептиды и их конъюгаты уже широко используются в мировой клинической практике. На данном этапе мы продолжили исследование конъюгата DOTA-тифетрилит, включающего хелатор DOTA и пентапептид с последовательностью Thz-Phe-D-Trp-Lys-Thr. DOTA-тифетрилит содержит в себе ключевую последовательность Phe-D-Trp-Lys-Thr и ранее продемонстрировал сродство к рецепторам соматостатина (SSTR) типов 2 и 5 на поверхности клеток человеческой нейробластомы (IMR-32), а также наличие необходимого типа вторичной структуры бета-поворот по результатам спектроскопии кругового дихроизма. С одной стороны, расширение спектра исследуемых аналогов соматостатина с уточненными данными по сродству к различным типам рецепторов SST может способствовать развитию методов персонализированной медицины, поскольку для разных типов опухолей характерна различная экспрессия SSTR10–12. С другой стороны, переход к более коротким биологическим векторам в составе РФП помимо расширения класса пептидов для персонализированной медицины будет способствовать удешевлению производства и, соответственно, росту доступности РФП для населения, своевременной диагностике и лечению. Среди элементов, обладающих потенциальными медицинскими радионуклидами, большое внимание привлекает тербий, поскольку для него существует четыре изотопа с массовыми числами 149, 152, 155 и 161, охватывающих весь спектр возможных медицинских применений. Среди них радионуклид 161Tb обладает ядерно-физическими характеристиками, пригодными для его применения в тераностике: средняя энергия бета-частиц составляет 150 кэВ, а наличие низкоэнергетических гамма-линий позволяет проводить визуализацию в гамма-камере. По некоторым оценкам, 161Tb по своим ядерно-физическим свойствам даже превосходит широко используемый в терапии 177Lu, поскольку при бета-распаде 161Tb испускается значительное количество конверсионных и Оже-электронов, которые обеспечивают гораздо более высокую локальную плотность дозы из-за их меньшего пробега в ткани (0,5–30 мкм). Ранее 161Tb уже использовался для мечения аналогов соматостатина и других молекул, а также уже применялся на пациентах. В нашей прошлой работе конъюгат DOTA-тифетрилит был успешно помечен радионуклидами 44Sc, 90Y, 152Eu и 207Bi, при этом радионуклид 152Eu использовался как долгоживущий аналог медицинских радионуклидов РЗЭ, в частности, 161Tb за счет схожих химических и координационных свойств катионов лантаноидов. Катионы Tb3+ и Eu3+ действительно обладают схожими характеристиками: близкими ионными радиусами18 и гидролитической способностью (Таблица 1), что позволяет предполагать схожие результаты как по оптимальным условиям мечения, так и по стабильности образуемых комплексов в различных средах. Таблица 1. Сравнительные характеристики рассматриваемых катионов. M Ri (КЧ 8), Ǻ lg βM-OH lg βM-DOTA20,21 Eu 1,07 -7,9 26,2; 28,2 Tb 1,04 -7,86 28,6 Для сравнения результатов по мечению, конъюгат DOTA-тифетрилит был помечен 161Tb. 161Tb был получен путем облучения мишени из оксида гадолиния природного состава дейтронами с энергией 13,3 МэВ. На рис.1 представлены объединенные результаты по мечению DOTA-тифетрилит обоими катионами. Видно, что связывание катионов тербия протекает даже быстрее, чем европия: степень мечения 98% достигается уже через 5 минут после начала реакции при pH 4 и Т=90°С. Такое увеличение скорости реакции может быть связано с большим значением константы устойчивости комплекса Tb-DOTA по сравнению с Eu-DOTA: для последнего данные, найденные в литературе, несколько отличаются, однако оба значения меньше, чем значение для константы с тербием (Таблица 1). Увеличение значения pH до 6.5 приводит к снижению скорости реакции мечения, возможно из-за гидролиза катиона. Рис. 1. Зависимость степени мечения DOTA-тифетрилит от времени катионами 152Eu и 161Tb. Для того, чтобы лечебная доза ионизирующего излучения была доставлена максимально эффективно, радиофармацевтический препарат не должен претерпевать перехелатирование с белками в составе плазмы крови. Для оценки стабильности исследуемых комплексов в подобных условиях комплексы M-DOTA-тифетрилит с радиохимической чистотой от 95% до 98% использовали для исследований стабильности in vitro. Радиоактивную фракцию, перехелатированную белками сыворотки, определяли за счет отделения белков сыворотки путем их осаждения этанолом. Полученные результаты демонстрируют, что при 100-кратном избытке фетальной бычьей сыворотки (пептид разбавлен до 1 мкМ) наблюдается высвобождение от 0 до 10% катиона из комплексов M-DOTA-тифетрилит (М=Eu, Tb) в течение 30-60 минут (Рис. 2). После 24 ч инкубирования меченного соединения в среде сывороточных белков радиохимическая чистота M-DOTA-тифетрилит не изменяется. В целом стабильность [161Tb]Tb-DOTA-тифетрилит согласуется как с данными для других комплексов с пептидными конъюгатами DOTA, для которых характерна высокая устойчивость в сыворотке в течение минимум 24 ч, так и с высокой стабильностью [152Eu]Eu-DOTA-тифетрилит в частности. Полученные результаты по мечению и стабильности подтверждают высокую схожесть поведения меченных комплексов между собой и позволяют использовать катион 152Eu3+ в качестве долгоживущего аналога 161Tb в условиях in vivo. Рис.2. Стабильность в сыворотке для комплексов M-DOTA-тифетрилит. Для исследования биораспределения комплексов пептидных конъюгатов на иммунодефицитных мышах использовалась клеточная линия IMR-32 (нейробластома человека), экспрессирующая SSTR2 и SSTR5, и которая ранее была использована для анализа сродства конъюгатов к рецепторам. На данном этапе предполагали как установление факта нацеливания и накопления исследуемых конъюгатов в новообразовании (опухоли), так и анализ устойчивости меченных комплексов в условиях живого организма. Для этого биораспределение комплекса с пептидным конъюгатом сопоставляется с распределением свободного катиона радионуклида. Другим вариантом может быть метод «блокирования» целевых рецепторов на поверхности опухоли и некоторых других органов, экспрессирующих данные рецепторы, путем предварительной инъекции препарата, достоверно связывающегося с нужными рецепторами. Животные были разделены на три группы в зависимости от вводимого вещества: 1) исследуемый комплекс [152Eu]Eu-DOTA-тифетрилит, 2) [152Eu]Eu-DOTATATE – вещество, выступающее в качестве положительного контроля, поскольку DOTATATE должен накапливаться в опухоли, на поверхности которой присутствуют рецепторы SSTR2 и SSTR5, 3) [152Eu]EuCl3 - отрицательный контроль. Полученные данные о распределении всех вводимых веществ представлены на рис.3. Из полученных данных видно, что катионы европия, не связанные изначально в комплекс, преимущественно накапливаются в легких, печени и селезенке, не демонстрируя клиренс, в то время как для исследуемого комплекса [152Eu]Eu-DOTA-тифетрилит наибольшее накопление регистрируется в почках, как и для [152Eu]Eu-DOTATATE. Можно считать, что [152Eu]Eu-DOTA-тифетрилит подвергается почечному клиренсу, что также подтверждается результатами измерения собранной в течение 6 часов мочи (Рис.S1), где наибольшая скорость счета наблюдается в моче уже через 2 ч. Интересно, что накопление [152Eu]Eu- DOTA-тифетрилит в почках превышает аналогичное накопление [152Eu]Eu-DOTATATE, что может быть связано с меньшей длиной аминокислотной цепи исследуемого пептида и, соответственно, молярной массой, и его большей гидрофильностью. Наблюдаемое накопление [152Eu]Eu-DOTA-тифетрилит в опухоли превышает этот же параметр для свободного катиона почти в 3 раза, но в то же время оно в 1,5 раза меньше, чем в случае октапептида [152Eu]Eu-DOTATATE. В целом, качественно и количественно профиль биораспределения исследуемого комплекса коррелирует с распределением [152Eu]Eu-DOTATATE и существенно отличается от [152Eu]EuCl3, поэтому можно говорить как об устойчивости комплекса in vivo, так и о способности исследуемого комплекса накапливаться в целевом органе – опухоли – то есть сохранении афинности меченного нециклического короткого тетрапептида в условиях in vivo. Поскольку накопление специфичного препарата в опухоли напрямую зависит от ограниченного числа рецепторов на мембранах клеток, для увеличения накопленной активности в опухоли целесообразным может быть повышение удельной активности вводимого препарата. Рис. 3. Распределение меченных соединений 152Eu в организме мышей через 6 ч после введения.   ЗАКЛЮЧЕНИЕ В рамках данного этапа проведены курсы дополнительного образования по основам ядерной медицины. Для чего были привлечены лекторы – ведущие ученые в области физических и зимических основ методов ядерной медицины. Было уделено внимание практическим аспектам использования радиофармпрепаратов: от основ надлежащей производственной практики до перспектив диагностических и терапевтических препаратов в современном состоянии ядерной медицины в РФ. С точки зрения доставки лечебной дозы излучения, низкомолекулярные соединения могут быть привлекательной альтернативой для антител, поскольку обладают сравнимой величиной сродства к целевым рецепторам, а также улучшенными фармакокинетическими характеристиками. В свою очередь, ультракороткие пептиды, включающие в себя только ключевую последовательность для узнавания рецептором, остаются мало изученными объектами, хотя эффективность подобных соединений была продемонстрирована на примере небольших лигандов PSMA. Конъюгат DOTA-тифетрилит - первый ультракороткий пептид линейного типа с показанной аффинностью к рецепторам соматостатина типов 2 и 5 и способностью накапливаться в опухоли, что позволяет его рассматривать в качестве потенциального биологического вектора в составе радиофармпрепаратов.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".