ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Проект направлен на разработку глюкозных биосенсоров и тест-полосок для высокоточной детекции глюкозы в условиях гипо/гипергликемии. Известно, что тест-полоски для глюкометров содержат в своем составе ферменты, которые по природе своей нестабильны. В связи с тем, что аналитический сигнал биосенсора напрямую связан с активностью фермента, то велика вероятность получения ложно-отрицательных или ложно-положительных результатов, что в случае введения пациентом инсулина может привести к коме или летальному исходу. Решением данной проблемы может стать смена лимитирующей стадии процесса за счет создания диффузионных ограничений по медиатору. В таком случае, некоторая степень инактивации фермента не приведет к значительным изменениям чувствительности сенсора. В соответствии с законами ферментативной кинетики зависимость отклика биосенсора от концентрации субстрата имеет гиперболический вид. Следовательно, в качестве дополнительного преимущества предлагаемого подхода стоит ожидать линеаризации зависимости отклика биосенсора от концентрации субстрата. Широкий диапазон линейности отклика биосенсора, в отличие от гиперболического, позволит обеспечить одинаково высокую чувствительность при высоких и при низких концентрациях глюкозы. В проекте также будет предложен способ повышения каталитических токов путем увеличения электропроводящей поверхности за счет включения в фермент-содержащую мембрану проводящих наноматериалов (углеродных или полимерных наночастиц).
Within the framework of the transition to personalized medicine, high-tech healthcare and health-preserving technologies (a development priority of STC in Russia), the current course of research is the development of simple, reliable and accurate methods of express analysis. The problem with personal blood glucose meters is the fundamental impossibility to calibrate these devices and sensors immediately before measurement. When measuring glucose, the result cannot be verified because the test strips are disposable. Test strips for glucose meters are known to contain enzymes that are naturally unstable. Due to the fact that the analytical signal of the biosensor is directly related to the activity of the enzyme, there is a high probability of obtaining false-negative or false-positive results, which, if the patient administers insulin, can lead to coma or death. The solution to this problem can be a change in the limiting stage of the process by creating diffusion barrier for the mediator. In this case, some degree of enzyme inactivation will not lead to significant changes in sensor sensitivity. As an additional advantage of this approach, we should expect the linearization of the dependence of the response of the biosensor on the substrate concentration. In accordance with the enzymatic kinetics this dependence has a hyperbolic form in general. In contrast to the hyperbolic one the wide linear range of the biosensor response will provide equally high sensitivity at high and low glucose concentrations. The essence of the proposed approach is to create a membrane-forming mixture containing an enzyme, a mediator, and a polyelectrolyte for one-stage deposition on an electrode substrate. For these purposes, methods for creating diffusion restrictions by forming additional polymeric membranes over the sensitive enzyme layer of the sensor are known. However, this complicates the technology in industrial production and leads to a decrease in reproducibility. It is necessary to take into account the magnitude of the charge of the used mediators and polymer, since the mediator must be retained in the membrane and the membrane must create a diffusion restriction. Thus, membrane-forming mixtures of the enzyme / mediator / polyelectrolyte composition contribute to the simultaneous formation of both the sensitive layer of the sensor and the creation of a diffusion barrier. First, a single act of applying and drying a mixture to electrode surface will significantly increase the reproducibility of the technological process, and reduce labor costs and costs for the production of test strips. Secondly, such an approach will ensure the independence of the response from the loss of enzyme activity and provide an ability to control the linear range of the biosensor. Third, it is proposed to use water-soluble biocompatible polymers to create membranes that will provide the most favorable environment for enzymes, which is the key to the stability of the biosensor and preserve enzyme activity during long-term storage. Another reason for the decrease in the accuracy of glucose test strips may be their insufficiently high selectivity due to background signals (competing processes with the participation of electroactive compounds present in the sample). Thus, approaches to blocking the access of interfering compounds to the electrode by forming additional semipermeable membranes on the surface of the sensitive layer of the biosensor are known. The project proposes to implement an alternative mechanism: direct transfer of an electron from an enzyme to an electrode. Biosensors based on this principle have not yet become widespread due to the low efficiency of direct bioelectrocatalysis, and, consequently, the low sensitivity of methods based on it. The project will propose a technique for increasing catalytic currents by increasing the electrically conductive surface by including conductive nanomaterials (carbon or polymer nanoparticles) into the enzyme-containing membrane. During the implementation of the project, it is planned to: 1) investgate the membrane properties of mixtures based on various polymers in relation to diffusion-mobile mediators; 2) to develop compositions of enzyme-containing membrane-forming mixtures for one-stage deposition on electrode substrates to create both mediator and mediator-free biosensors; 3) test biosensors with different membrane compositions in amperometry (coulometry) modes; 4) to approve electrochemical test strips for the detection of glucose in biological fluids (blood serum or whole blood) for monitoring hypo- / hyperglycemia/ Thus, as a result of the project, biosensors and test strips will be developed for high-precision glucose detection in hypo / hyperglycemic conditions.
В результате проекта будут получены: 1) Диффузионные мембраны на основе полиэлектролитов с контролируемой диффузионной проницаемостью по отношению к медиаторам глюкозных биосенсоров. Представления о диффузионной проницаемости полимерных мембран различной природы для широкого круга наиболее применимых в биосенсорике медиаторов позволят разработать универсальные подходы к созданию высокоточных биосенсоров. 2) Стабильные фермент-содержащие мембранообразующие смеси на основе биосовместимых полимеров для одностадийной модификации проводящих подложек. Полученные закономерности изменения свойств и эксплуатационных характеристик в зависимости от состава многокомпонентных смесей для иммобилизация ферментов позволит управлять характеристиками биосенсоров на их основе (стабильность, чувствительность, точность). Благодаря разработке высокотехнологичных составов для капельной модификации электродов осуществим переход от многостадийных и комплексных стадий производственного цикла к удобной научно обоснованной технологии для масштабного промышленного изготовления сенсоров, что повысит воспроизводимость, сократит расходы и трудозатраты. 3) Высокоточные электрохимические биосенсоры с диффузионными ограничениями по медиатору для персональных глюкометров В рамках проекта будут заложены основы создания биосенсоров с диффузионными ограничениями по медиатору, что важно для исключения влияния нестабильности и неконтролируемой потери активности фермента на аналитические характеристики биосенсоров. 4) Высокоселективные глюкозные биосенсоры на основе глюкозодегидрогеназ, включенных в прямой биоэлектрокатализ. Включение фермента в варианты прямого биоэлектрокатализа и подходы для усиления биоэлектрокаталитического тока за счет применения проводящих наноматериалов раскроет перспективы для применения альтернативного механизма действия биосенсоров для создания глюкозных тест-полосок. Успешная реализация проекта позволит раскрыть перспективы одностадийной иммобилизации ферментов и медиаторов в диффузионных мембранах, а также прямого биоэлектркатализа для создания тест-полосок для высокоточного определения состояний гипо/гипергликемии
1. Диффузионная подвижность медиаторов в мембранах с различным содержанием полиэлектролитов. Диффузионную подвижность водорастворимых медиаторов в мембранах, сформированных на поверхности электродов, изучали методом циклической вольтамперометрии в водных растворах медиаторов. Заряд медиатора и полиэлектролита, а также плотность мембраны (количество полиэлектролита) являются главными факторами, влияющими на значения кажущихся коэффициентов диффузии. Кажущийся коэффициент диффузии катиона [Ru(NH3)6]3+ в положительно заряженных матрицах (хитозан и полисилоксан) снижается в 1.5-2 раза, в то время как отрицательно-заряженный перфторсульфониированный полимер (ПФС) не оказывает влияния на коэффициент диффузии данного медиатора. Для медиатора отрицательного заряда (гексацианоферрат (III)-ион) было обнаружено его дополнительное концентрирование в мембране с увеличением количества положительно-заряженного хитозана на электроде. 2. Иммобилизация фермента в мембранах путем капельной модификации электродов. Предложена иммобилизация фермента в мембране на основе ПФС или хитозана на поверхности печатных электродов модифицированных медиаторами (гексацианоферрат (III) калия, тионин, фенотиазин) на стадии печати (в составе углеродной пасты). Определена каталитическая активность глюкозооксидазы в хитозановых мембранах с содержанием полимера от 0.01 до 0.8%. Кажущаяся константа Михаэлиса достигает своего минимального значения (2.1 ± 0.2 мМ) при увеличении количества хитозана в мембранообразующей смеси до 0.1% и выше. Максимальная чувствительность биосенсоров (49 ± 2 мА•М-1•см-2) на основе берлинской лазури достигается для мембранообразующих смесей, содержащей 0.25% хитозана. Для создания биосенсоров со смещенным в область миллимолярных концентраций глюкозы линейным диапазоном разработаны стабильные трехкомпонентные мембранообразующие смеси, содержащие и фермент и медиатор, на основе полиэлектролитов, позволяющих контролировать диффузию медиаторов в мембране. 3. Медиаторные биосенсоры на основе глюкозооксидазы, иммобилизованной в составе диффузионных мембран. Хроноамперометрические отклики регистрировали в условиях скачка потенциала используя для калибровки значение тока на 5 секунде. Максимальная чувствительность достигается в начальный момент времени после наложения потенциала, так как хроноамперограммы представляют собой экспоненциально убывающие кривые. Чувствительность сенсоров на основе гексацианоферрата (III) калия (8-13% в углеродной пасте) и глюкозоксидазы, иммобилизованной в ПФС, составила 9 – 13 мА•М-1•см-2, линейный диапазон определяемых концентраций глюкозы - от 1 до 20 мМ. Тест-полоски на основе фенотиазина в углеродной пасте характеризуются более низкой (в 5 – 10 раз) чувствительностью. Оптимальные аналитические характеристики получены для тест-полосок на основе трехкомпонентных мебранообразующей смесей. Для сенсоров на основе соиммобилизации 100 мМ гексацианоферрата (III) калия и 10 мг∙мл-1 глюкозооксидазы в 0.01% растворе хитозана кроме повышенного в 2 раза коэффициента чувствительности (23 ±1 мА•М-1•см-2), отклик линеен в диапазоне от 1 до 50 мМ глюкозы, что является рекордным значением верхнего предела для глюкозных биосенсоров. Линейность в широком диапазоне концентраций обусловлена увеличением кажущейся константы Михаэлиса (до 35± 7 мМ). 4. Глюкозные тест-полоски на основе трехкомпонентных хитозановых мембран. Для высокоточной детекции глюкозы в микролитровых объемах биосенсоры были модифицированы капилляром. Найдены составы мембранообразующих смесей на основе хитозана, глюкозооксидазы и водорастворимых медиаторов (гексацианоферрат (III) калия, метосульфат феназина, гексаамминрутения (III) хлорид, 1,1-ферроцендиметанол), обеспечивающие широкий диапазон линейности глюкозных тест-полосок: от 1 до 30-50 мМ и высокие коэффициенты чувствительности от 10 до 37 мА∙см-2∙М-1. Различное содержание хитозана в мембране позволяет управлять диффузионной подвижностью медиатора и, соответственно, характеристиками биосенсоров. Выявлена прямая зависимость коэффициентов чувствительности тест-полосок от скорости высвобождения медиатора из мембраны. Рекордная чувствительность достигнута для наиболее «быстро высвобождающегося» медиатора хлорида гексаамминрутения (III) (55 мA∙M-1∙см-2). 5. Печатные электродные структуры на основе различных углерод- и серебросодержащих паст. Для изготовления тест-полосок методом трафаретной печати предложен дизайн двухэлектродных печатных структур типа «подкова» с графитовым рабочим электродом и серебряным противоэлектродом. Для изготовления электродных структур протестированы углеродсодержащие пасты различных производителей, в том числе отечественных. Обнаружено, что некоторые материалы углеродного слоя замедляют скорость электродной реакции для отрицательно-заряженного медиатора (феррицианида), при этом чувствительность тест-полосок снижается, однако диапазон линейности сохраняется (1-50 мМ глюкозы). Наилучшие тест-полоски на основе пасты отечественного производства характеризуются значением коэффициента чувствительности 15±1 мА∙см-2∙М-1 и достаточным диапазоном линейности (1-30 мМ). 6. Биосенсоры на основе глюкозодегидрогеназы, включенной в прямой биоэлектрокатализ. Повысить эффективность прямого биоэлектрокатализа возможно путем соиммобилизации фермента с проводящими наноматериалами в полиэлектролите. Соиммобилизация глюкозодегидрогеназы с наночастицами сажи в полимерных матрицах на основе ПФС позволяет увеличить предельный каталитический ток до 25 мкА•см-2 и на порядок увеличить константу Михаэлиса до 0.15 мМ, по сравнению с иммобилизацией без полиэлектролита. Биосенсоры на основе ПФС и наночастиц боронат-замещенного полианилина, обладают сравнимыми характеристиками: KM 0.18 мМ и предельный каталитический ток 2.2 мкА•см-2. 7. Селективность и стабильность глюкозных тест-полосок на основе мембран различного состава. Мешающее влияние восстановителей оценили при потенциале 0.3 В для тест-полосок на основе гексацианоферрата (III): 0.2 мМ парацетамола, аскорбиновой или мочевой кислот не вносят значительного вклада в сигнал биосенсора. Также созданы тест-полоски на основе низкопотенциальных медиаторов: [Ru(NH3)6]3+ и метосульфата феназина, работающие при более низких потенциалах: 0.1 и 0.2В, соответственно. После пятичасового экспресс-теста при повышенной температуре (60 °С), ускоряющей инактивацию фермента, коэффициент чувствительности тест-полосок на основе [Ru(NH3)6]Cl3 и K3[Fe(CN)6] сохраняется на 86%. Коммерческие тест-полоски сохраняли лишь 25% первоначальной чувствительности уже после 3-х часов. Чувствительность тест-полосок на основе гексацианоферрата калия после одного года хранения при 4°C составила 28±2 мА•М-1•см-2 (93 % от исходного значения). Мембранообразущая смесь стабильна при 4°C как минимум в течение недели без потери характеристик тест-полосок, производящихся на ее основе. 8. Валидация разработанных глюкозных тест-полосок для анализа цельной крови Правильность подтверждена путем анализа сертифицированных сывороток крови, а также венозной крови, полученной в сертифицированных лабораториях. По сравнению с коммерческими тест-полосками, чувствительность которых в цельной крови значительно снижается по сравнению с модельными растворами (в 3 раза), для разработанных в проекте получен самый высокий показатель сохранения чувствительности в крови: 97%. Широкий диапазон линейности (1-35 мМ глюкозы) сохраняется и при измерениях в крови. Таким образом, совместная иммобилизация медиатора и фермента в хитозане позволяет добиться стабильных аналитических характеристик тест-полосок даже в цельной крови и обеспечивает точное определение концентрации глюкозы в гипо- и гипергликемических состояниях. По результатам выполнения проекта опубликовано 3 статьи: в журнале Biosensors and Bioelectronics (IF = 12.6, Q 1). Journal of Electroanalytical Chemistry (IF 4.5, Q1) и Engineering Proceedings, сделаны доклады на международных конференциях.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 22 декабря 2021 г.-31 декабря 2022 г. | Электрохимические биосенсоры с настраиваемым линейным диапазоном для персональных глюкометров |
Результаты этапа: 1. Диффузионная подвижность медиаторов в мембранах с различным содержанием полиэлектролитов. Диффузионная подвижность низкомолекулярных медиаторов в полиэлектролитных мембранах, сформированных на поверхности электродов, зависит от заряда медиатора, полиэлектролита, а также плотности мембраны и может быть определена электрохимическими методами. В мембранах на основе отрицательно заряженного перфторсульфонированного полимера (ПФС) (0.3%) кажущийся коэффициент диффузии феррицианид-иона снижается на 3 порядка, в то время как катиона гексамминрутения (III) остается неизменным. При этом, в менее плотных мембранах, на основе 0.1% раствора ПФС, коэффициент диффузии феррицианид-иона снижается всего на порядок. Аномальное увеличение электрохимической активности гексацианоферрата калия с увеличением плотности мембраны наблюдается на электродах, модифицированных положительно заряженным при рН 6.0 биополимером – хитозаном, что является результатом дополнительной адсорбции медиатора в мембране. В соответствии с данными циклической вольтамперометрии и спектроскопии электрохимического импеданса количество адсорбированного гексацианоферрата (III) увеличивается с увеличением содержания хитозана в мембране (от 0.01 до 1%). 2. Мембранообразующие смеси фермент/медиатор/полимер в водных и/или водно-органических средах для одностадийной капельной модификации электродов. Для создания биосенсоров со смещенным в область миллимолярных концентраций глюкозы линейным диапазоном предпочтительны мембранообразующие смеси на основе биосовместимых полимеров ПФС и хитозана, позволяющих контролировать диффузию медиаторов в мембране. Предложен способ модификации печатных электродов медиаторами (гексацианоферрат (III) калия, тионин, фенотиазин) на стадии печати (в составе углеродной пасты), который обеспечивает удобство одностадийной капельной модификации электродов ферментсодержащей мембраной. Однако при таком подходе максимально допустимая концентрация медиаторов ограничена реологическими свойствами углеродной пасты для печати. Истинные растворы ПФС для иммобилизации ферментов могут быть получены только в водно-органических смесях, причем остаточная активность фермента высока в средах с высоким содержанием изопропанола >80%, а чувствительность максимальна в мембранах 0.3 % ПФС. Трехкомпонентные мембранообразующие смеси (фермент/медиатор/полимер) на основе хитозана отличаются простотой изготовления, ввиду хорошей растворимости биополимера в водных растворах, и подходят для большинства водорастворимых медиаторов (гексацианоферрата (III) калия, метосульфата феназина и гексаамминрутения (III) хлорида). Определена каталитическая активность фермента (глюкозоксидазы) в хитозановых мембранах с содержанием полимера от 0.01 до 0.8% на электродах, модифицированных берлинской лазурью. Кажущая константа Михаэлиса уменьшается с увеличением содержания хитозана в мембранообразующей смеси от 0.01 до 0.1%, что говорит об увеличении активности иммобилизованного фермента в хитозановой мембране. Предельное значение KM составило 2.1 ± 0.2 мМ. Максимальная чувствительность биосенсоров (49 ± 2 мА·М-1·см-2) на основе берлинской лазури достигается для мембранообразующих смесей, содержащей 0.25% хитозана. 3. Медиаторные биосенсоры с настраиваемым линейным диапазоном на основе глюкозоксидазы иммобилизованной в составе диффузионных мембран, содержащих медиатор. Предложен компактный дизайн двухэлектродных тест-полосок, изготавливаемых методом трафаретной печати. Для создания биосенсоров модификация электродов разработанными составами мембранообразующих смесей осуществляется капельным способом в одну стадию. Протестированы тест-полоски на основе медиаторов (фенотиазин, гексацианоферрат (III) калия, тионин) в составе углеродной пасты с иммобилизованным ферментом и на основе трехкомпонентных мембранообразующих смесей медиатор/фермент/полиэлектролит. Для тест-полосок на основе гексацианоферрата (III) калия (8-13% в углеродной пасте) и глюкозоксидазы, иммобилизованной в ПФС, чувствительность сенсоров составила 9 – 13 мА·М-1·см-2, а линейный диапазон определяемых концентраций глюкозы - от 1 до 20 мМ. Использование мембран на основе хитозана (0.002 – 0.01%), вместо ПФС, для иммобилизации глюкозооксидазы на таких электродах приводит к смещению линейного диапазона в область высоких концентраций глюкозы: от 5 до 30 мМ. Показано, что коэффициенты чувствительности тест-полосок возможно повысить на порядок при использовании фенотиазина (30-70 мМ) в составе мембранообразующего раствора. Использование трехкомпонентных мембранообразующих смесей на основе водных растворов хитозана позволяет в более широких пределах варьировать концентрацию медиаторов. Наилучшие аналитические характеристики получены для тест-полосок на основе смеси, содержащей 100 мМ гексацианоферрата (III) калия и 10 мг∙мл-1 глюкозооксидазы в 0.01% растворе хитозана. Кроме повышенного в два раза коэффициента чувствительности (23 ±1 мА·М-1·см-2), отклик тест-полосок линеен в диапазоне от 1 до 50 мМ глюкозы, что является рекордным значением верхнего предела обнаружения для глюкозных биосенсоров. 4. Биосенсоры на основе глюкозодегидрогеназы, включенной в прямой биоэлектрокатализ, усиленный проводящими наноматериалами. Для увеличения эффективности прямого биоэлектрокатализа предложена со-иммобилизация фермента с наночастицами сажи и проводящими полимерами в полиэлектролите. Со-иммобилизация глюкозодегидрогеназы в полимерные матрицы на основе ПФС с наночастицами сажи позволяет увеличить предельный каталитический ток до 25 мкА·см-2 и на порядок увеличить константу Михаэлиса до 0.15 мМ, по сравнению с иммобилизацией наночастиц сажи с ферментом без полиэлектролита. Биосенсоры на основе ПФС и наночастиц самодопированного боронат-замещенного полианилина, обладают сравнимыми характеристиками: KM 0.18 мМ и предельный каталитический ток 2.2 мкА·см-2. На примере пленок проводящего самодопированного полианилина с адсорбированным ферментом показано увеличение предельного каталитического тока в 7 раз и константы Михаэлиса в 2 раза при регистрации амперометрического сигнала биосенсоров при потенциале 0.0 В вместо 0.3 В, обусловленное смещением области электроактивности полианилина в нейтральных средах в более низкие потенциалы. 5. Хроноамперометрия и кулонометрия с тест-полосками на основе трехкомпонентных мембранообразующих смесей. Хроноамперометрические отклики биосенсоров, зарегистрированные в условиях скачка потенциала, представляют собой экспоненциально убывающие кривые, в связи с чем амперометрическая регистрация сигнала тест-полоски в начальный момент времени является предпочтительной. Максимальная чувствительность в режиме хроноамперометрии достигается на 3 – 6 секундах измерения токового отклика после наложения потенциала. Режим кулонометрии позволяет повысить точность измерения (коэффициенты вариации снижаются в среднем в 2 раза), при этом линейность отклика биосенсора остается в том же диапазоне. 6. Стабильность биосенсоров, стабильность мембранообразующей смеси. Более 50% исходного отклика сохраняется при выдерживании биосенсоров с наилучшими аналитическими характеристиками в течение 3 часов при температуре 60°C. В таких же условиях отклик коммерческих тест-полосок составлял лишь 25% от исходного. При хранении тест-полосок при комнатной температуре в течение 3 недель отклик биосенсора составляет в среднем 88% от исходного в диапазоне концентраций от 1 до 30 мМ. При этом сама мембранообразущая смесь может храниться при 4°C в течение недели без потери характеристик тест-полосок, производящихся на ее основе. 7. Публикация в высокорейтинговом журнале, результаты работы представлены на научных конференциях. В течение этапа опубликована статья в журнале Biosensors and Bioelectronics (IF = 12.5). Результаты работы представлены на двух международных конференциях. Под руководством руководителя проекта защищены 2 курсовые работы студентов химического факультета МГУ. | ||
2 | 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Электрохимические биосенсоры с настраиваемым линейным диапазоном для персональных глюкометров |
Результаты этапа: 1. Печатные электродные структуры на основе различных углерод- и серебросодержащих паст Удобным для массового производства способом изготовления двухэлектродных структур для тест-полосок является метод трафаретной печати. При этом характеристики будущих тест-полосок зависят не только от способа модификации структуры, но и от качества и состава углеродного и серебряного покрытий. С целью импортозамещения паст Gwent (Sun Chemical, Великобритания), наиболее распространенного изготовителя материалов для печати электродов, использовали серебро- и углеродсодержащие пасты других производителей, в том числе отечественных: Дельта-пасты (Россия), ФГБНУ ТИСНУМ (Россия) и Jelcon (Япония). Вольтамперная характеристика электродов в растворе медиатора является одним из основных критериев пригодности электродного покрытия для электрохимических измерений. Мы показали, что наблюдаемая в некоторых случаях блокировка электроактивности отрицательно-заряженного медиатора (феррицианида) не препятствует переносу заряда в случае положительно-заряженных медиаторов. Из паст российского производства наилучшие тест-полоски (на основе GP5) характеризуются близким к Gwent значением коэффициента чувствительности и широким диапазоном линейности (1-30 мМ). Использование серебросодержащей пасты производства Дельта-пасты позволяет в 1.5 раза повысить коэффициент чувствительности (44±2 мА∙см-2∙М-1), при сохранении линейного диапазона от 1 до 30 мМ глюкозы. Добавка наночастиц сажи, как в состав углеродсодержащей пасты, так и в состав мембранообразующих смесей, не оказывает влияния на чувствительность, но обеспечивает широкий диапазон линейности (1-50 мМ глюкозы) и позволяет повысить воспроизводимость измерений в области высоких концентраций глюкозы. Таким образом, при создании тест-полосок необходимо учитывать характеристики компонентов пасты для трафаретной печати электродных структур, влияющих на электроактивность медиаторов разного заряда. 2. Глюкозные биосенсоры и тест-полоски на основе трехкомпонентных ферментных мембран различного состава Оптимальный состав трехкомпонентных мембранообразующих смесей (медиатор, фермент, полиэлектролит) для изготовления тест-полосок определяется следующими факторами: 1) подвижностью медиатора в мембране; 2) реологическими свойствами смеси для капельного нанесения; 3) стабильностью и сохранением активности фермента. По сравнению с водно-спиртовыми смесями, водные растворы отличаются высокой стабильностью и воспроизводимостью в условиях капельной модификации подложек. Наиболее перспективным способом создания тест-полосок в одну стадию, обеспечивающим высокую чувствительность и широкий линейный диапазон явилось капельное нанесение мембранообразующих смесей на основе глюкозооксидазы, хитозана и водорастворимых медиаторов (гексацианоферрат (III) калия, метосульфат феназина, гексаамминрутения (III) хлорид, 1,1-ферроцендиметанол). Выявлена прямая зависимость коэффициентов чувствительности тест-полосок от скорости высвобождения медиатора из мембраны или материала электрода, предложен способ оценки константы скорости этого процесса. В случае положительно-заряженного полиэлектролита (хитозана) высокие значения константы соответствуют медиаторам положительного заряда. Рекордная чувствительность при регистрации сигнала на 5-й секунде после приложения потенциала достигнута для наиболее «быстро высвобождающегося» медиатора хлорида гексаамминрутения (III), в то время как тест-полоски на основе метосульфата феназина, адсорбирующегося на электроде, обладают самым низким коэффициентом чувствительности (13.1±0.5 мA∙M-1∙cм-2). Различное содержание хитозана в мембране позволяет управлять диффузионной подвижностью медиатора. Данные по скоростям высвобождения медиаторов из мембран с различным содержанием полиэлектролита также хорошо коррелируют с полученными значениями коэффициентов чувствительности тест-полосок. Для высокоточной детекции глюкозы в микролитровых объемах (менее 3 мкл) биосенсоры были модифицированы капилляром. Варьируя размер капилляра и его гидрофильность (обработка материала капилляра раствором ПАВ) возможно управлять аналитическими характеристиками тест-полосок. В течение второго года выполнения проекта найдены оптимальные составы мембранообразующих ферментсодержащих смесей на основе хитозана и всех рассмотренных медиаторов, обеспечивающие широкий диапазон линейности глюкозных тест-полосок: от 1 до 30-50 мМ и высокие коэффициенты чувствительности от 10 до 37 мА∙см-2∙М-1. 3. Селективность и стабильность тест-полосок на основе мембран различного состава Величина амперометрического отклика медиаторного биосенсора максимальна при регистрации сигнала при потенциале в области существования его окисленной формы, в соответствии с механизмом работы биосенсоров второго поколения. При использовании ферроцианида или ферроцендиметанола оптимальный рабочий потенциал соответствует 0.3 В. Показано, что при этом потенциале токи окисления восстановителей (0.2 мМ парацетамол, аскорбиновая и мочевая кислоты) не вносят значительного вклада в сигнал биосенсора. Чтобы исключить ложноположительный сигнал, обусловленный присутствием восстановителей в крови, созданы тест-полоски на основе низкопотенциальных медиаторов: хлорида гексаамминрутения (III) и метосульфата феназина, при этом рабочий потенциал удается понизить до 0.1 и 0.2В соответственно. Сравнение разработанных тест-полосок на основе свободно диффундирующих медиаторов с высокоселективными биосенсорами первого поколения на основе берлинской лазури показало, что чувствительность последних в 3-5 раз ниже (7.4±0.4 мА•М-1•см-2), а линейный диапазон определяемых концентраций глюкозы ограничен сверху 15 мМ. Таким образом, использование диффузионно-подвижных медиаторов предпочтительно для линейности отклика биосенсора в области высоких концентрации глюкозы. Использование комплексов железа или рутения в составе трехкомпонентных мембранообразующих смесей, обеспечивает высокую стабильность тест-полосок. В ходе пятичасового экспресс-теста при повышенной температуре (60 °С), ускоряющей инактивацию фермента. Коэффициент чувствительности тест-полосок на основе [Ru(NH3)6]Cl3 и K3[Fe(CN)6] сохраняется на 86%. В то время как коммерческие тест-полоски сохраняли лишь 20% от первоначальной чувствительности уже после трех часов. 4. Валидация разработанных глюкозных тест-полосок для анализа цельной крови Важным аспектом является применимость тест-полосок для анализа цельной крови. Правильность подтверждена путем анализа сертифицированных сывороток крови, а также венозной крови, полученной в сертифицированных лабораториях. Тест-полоски, изготовленные путем капельного нанесения на поверхность электрода мембранообразующих смесей на основе гексацианоферрата (III), фенотиазина и гексаамминрутения (III), применимы для анализа неразбавленных сывороток крови: найденные концентрации глюкозы в сыворотках крови соответствуют значениями, заявленным в сертификате. По сравнению с коммерческими тест-полосками, чувствительность которых в цельной крови значительно снижается по сравнению с модельными растворами (в 3 раза) для разработанных в проекте получен самый высокий показатель сохранения чувствительности в крови: 97%. Широкий диапазон линейности (1-35 мМ глюкозы) также сохраняется и при измерениях в крови. Таким образом, совместная иммобилизация медиатора и фермента в хитозане позволяет добиться стабильных аналитических характеристик тест-полосок даже в цельной крови и обеспечивает точное определение уровня глюкозы в гипо- и гипергликемических состояниях. По результатам второго года выполнения проекта опубликовано 2 статьи: в журнале Journal of Electroanalytical Chemistry (IF 4.5, Q1) и Engineering Proceedings и сделаны доклады на всероссийских и международных конференциях. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".