ИСТИНА

Конкретной фундаментальной задачей проекта является выяснение взаимосвязи между наличием G-квадруплексных структур в промоторных областях генов и функционированием важнейшего эпигенетического модификатора ДНК – de novo ДНК метилтрансферазы Dnmt3a.

The specific fundamental task of the project is to elucidate the relationship between the presence of G-quadruplex structures in the promoter regions of genes and the functioning of the most important epigenetic DNA modifier, de novo DNA methyltransferase Dnmt3a.

Первый год 1) Будут получены препараты полноразмерной Dnmt3a мыши и ее доменов для дальнейших исследований. 2) Для исследования влияния G-квадруплексов на метилирование будет создана модельная система 1, содержащая свободный G4-образующий (GGGT)4-олигонуклеотид и этот же олигонуклеотид в составе протяженного модельного ДНК-дуплекса ((GGGT)4-ДНК)). 3) Для доказательства наличия G-квадруплекса будет осуществлена физико-химическая характеристика (GGGT)4-олигонуклеотида. 4) Будет исследовано связывания (GGGT)4-олигонуклеотида с полученными препаратами МТазы. 5) Будет исследовано метилирование (GGGT)4-ДНК каталитическим доменом (Dnmt3a-CD) и полноразмерным ферментом Dnmt3a2. 6) Будет создана модельная система 2 для исследования влияния G4-структуры в с-МУС на работу Dnmt3a мыши. Начато доказательство структуры компонентов системы 2 физико-химическими методами. Второй год 1) Будет проведено доказательство наличия G-квадруплекса в компонентах системы 2 физико-химическими методами. 4) Будет проведено исследование связывания с-МУС-олигонуклеотида, имитирующего G-квадруплекс в соответствующем промоторе, с полученными препаратами МТазы. 5) Будет исследовано метилирование сМУС-ДНК с различной локализацией структуры G4 по отношению к метилируемому сайту МТазой Dnmt3a-CD. Выясним зависимость степени метилирования от наличия и от расположения CpG-сайтов по отношению к G4. 6) Будет определено влияние промоторных G4 на метилирование ДНК в присутствии противоопухолевого агента кураксина CBL0137.

Нами накоплен большой многолетний опыт в изучении МТаз: получение конструктов и выделение ферментов, исследование механизма метилирования и ингибирования, изучение ДНК-белковых контактов, разработка методики анализа метилирования, аффинная модификация аналогами субстратов, моделирование структуры комплекса МТаза-ДНК, сайт-направленный мутагенез МТаз. В нашем распоряжении имеются конструкции для выделения полноразмерного фермента Dnmt3a и его фрагментов в виде гистидиновых (для Dnmt3a и Dnmt3a–CD) и глутатион-S-трансферазных (для PWWP-домена) производных. Варьируя разработанные ранее методы определения активности Dnmt3a и оптимизируя их, мы можем впервые наблюдать эффекты на метилирование CpG-сайтов, расположенных на определенном расстоянии до G-квадруплексов, получать кинетические параметры реакции и определять молекулярный механизм процесса метилирования. Поскольку важную роль в проекте занимает изучения связывания МТазы и ее отдельных доменов с G-квадруплексами, важным будет накопленный нами опыт по определению природы влияния противоопухолевых ДНК-связывающих препаратов на функционирование Dnmt3a и разработанные впервые для этой работы методы изучения комплексов ДНК/Dnmt3a/лиганд. При выборе для исследования промоторных областей ряда онкогенов с G-квадруплексными структурами будет использован опыт поиска мутантных форм Dnmt3a у пациентов с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ). Будут использоваться две методологии изучения G-квадруплексов: как отдельных структур (базируясь на литературных данных по аптамерам G4) и G4 определенной топологии в составе двойной спирали ДНК (оригинальные структуры, разработанные в нашей лаборатории). В нашей группе имеется большой опыт характеристики различных структур двойной спирали ДНК методами КД и УФ-плавления.

В результате работы показано, что наличие G-квадруплексов (G4) в промоторах онкогенов изменяет статус их метилирования,оказывая гипометилирующий эффект из-за нарушения функционирования Dnmt3a. Этот эффект зависит от взаимного положения сайтов метилирования CpG и G4 и уменьшается при удалении G4 от CpG. Cо структурами G4 взаимодействует каталитический домен Dnmt3a. Можно предположить, что влияние G4 на функционирование Dnmt3a-CD определяется секвестированием фермента на неканонической структуре и нарушением правильного связывания тетрамерного фермента с двухцепочечной областью промотора c-MYC ввиду препятствия, создаваемого этой структурой.