ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Цель настоящего проекта заключается в разработке новых биоиндикаторов эффективности доставки антиоксидантов с помощью каротиноид-связывающих белков на основе комплексного оптического исследования структурно-динамических изменений клеточной мембраны при осуществлении белок-опосредованных механизмов доставки.
Due to high anti-inflammatory and antioxidant properties, carotenoids are considered as promising therapeutic agents in the treatment of many diseases. Carotenoids are vital for the normal functioning of certain organs and tissues serving as the metabolic precursors of chemical compounds that determine various physiological processes. Since carotenoids are not synthesized in the human body, it is necessary to ensure their supply either as part of the consumed products, or as part of food additives and pharmacological substances.Efficient delivery of carotenoids into the cell is limited due to the lipophilic nature of carotenoids, their poor water solubility, low chemical / photochemical stability, and poor bioavailability. In this regard, the study of new approaches for the target delivery of carotenoids is an interesting area of modern biotechnology. Carotenoids are lipophilic substances. Therefore, for target delivery, their encapsulation inside stable and biocompatible liposomes and / or lipid structures is being thoroughly investigated. However, recent studies show that the efficiency of absorption of carotenoids by cells through liposomal transport is limited: incubation of cells with liposomes carrying micromolar concentrations of carotenoids leads only to picomolar concentrations in target cells. A promising solution to this problem is to provide a selective transport of carotenoids using special protein carriers. The research team of this project has experience in creating modified nanoscale structures capable of binding carotenoids with high efficiency (in particular, the AnaCTDH protein based on the water-soluble carotenoprotein isolated from the cyanobacteria Anabaena sp. PCC 7120). In a recent work (EG Maksimov, E. Yu. Parshina et al. Antioxidants 2020, vol. 9, p. 869), the project participants showed convincing results on the delivery of carotenoids using AnaCTDH into the membranes of various human cell cultures, to reduce the oxidative stress induced in cells. Several issues related to the interaction of carotenoid-binding proteins with the cell membrane at the process of carotenoid delivery remain unstudied. In particular, the mechanisms of transport and orientation of carotenoids in the membrane during the delivery of the carotenoid and how its viscoelastic properties change are not entirely clear. The latter is a limiting factor in assessing the efficiency of antioxidants delivery based on carotenoid-containing proteins. In the current project, a comprehensive study of structural and dynamic changes in the cell membrane at the carotenoidbinding proteins delivery of antioxidants will be carried out using non-invasive laser-optical approaches. As a result of the project, data sets of diagnostic information will be obtained, which will make it possible to identify new bioindicators of the effectiveness of antioxidants target delivery. The research will include computational experiments using molecular dynamics methods aimed at in silico modeling of structural changes occurring in the membrane during the incorporation of a carotenoid molecule into the lipid bilayer at protein-mediated delivery. Using laser-optical methods of biophotonics, a fullscale experimental series in vitro will be carried out to study the processes occurring in the membrane bilayer. The obtained results will help to establish a new promising technology for the target delivery of carotenoids.
Будут сформированы экспериментальные модели плоских, покрашенных флуоресцентным красителем, бислойных мембран, а также моноламиллярных липосом, в том числе со встроенными молекулами каротиноидов. Будут получены и охарактеризованы образцы каротиноидов (эхиненоны, астаксантины) и каротиноид-связывающих белков (Ana-CTDH, CBP). В результате численных расчетов in silico будут проанализированы структурные параметры каротиноидов (эхиненоны, астаксантины) в процессе встраивания в мембрану. Будут получены данные о равновесном положении (распределении) молекул рассматриваемых каротиноидов в липидных мембранах. В ходе оптического исследования будут измерены и проанализированы кинетики затухания флуоресценции красителя в мембранных моделях в зависимости от типа и концентрации каротиноидов и каротиноид-связывающих белков. С помощью методов FRAP и анизотропии флуоресценции будут получены значения вязкости и коэффициенты диффузии свободных фосфолипидов в экспериментальных мембранных объектах для различных каротиноидов (эхиненоны, астакстантины) и каротиноид-содержащих белков. С помощью КР-микроскопии будут получены КР-изображения модельных мембранных объектов, картированные по параметрам характеристических полос каротиноидов в спектре комбинационного рассеяния (в первую очередь, полосы 1520 см-1 и 1156 см-1). Таким образом, в результате исследований на модельных мембранных объектах в рамках 1-го года выполнения проекта, будут сформулированы наиболее оптимальные экспериментальные условия для исследования эффективности адресной белок-опосредованной доставки антиоксидантов на экспериментальных in vitro клеточных моделях, которые запланированы на 2 год проекта.
Участники проекта имеют опыт совместной работы, прежде всего, в области разработки методики мэппинга объектов по данным резонансной КР-спектроскопии (детальное описание методического подхода см. в п. 4.6 настоящей заявки). На рис. 1-4 (см. Дополнительные материалы) приведены результаты совместной работы по мэппингу клеток Haematococcus Pluvialis Red с помощью анализа спектрометрических данных резонансного КР на полосе 1520 см-1. Используемое программное обеспечение позволяет проводить картирование объектов по различным параметрам спектров КР, включая среднюю интенсивность, FWHM, соотношение интенсивностей и пр. Данный подход будет реализован в проекте для анализа распределения и структуры каротиноидов при осуществлении адресной доставки с помощью каротиноид-содержащих белков.
1) Будут разработаны протоколы витальной покраски клеток флуоресцентным красителем для последующего исследования изменений вязкоупругих свойств мембран в процессе доставки каротиноидов; 2) Будут получены значения изменения микровязкости и коэффициента диффузии свободных фосфолипидов клеточной мембраны клеток человека при осуществлении белок-опосредованной доставки каротиноидов. В качестве клеток-мишеней планируется использование клеток кожи (кератиноциты, культура HaCaT); эмбриональных клеток (HEK); клеток эндотелия кровеносных сосудов; 3) Будет проведено моделирование с применением методов молекулярной динамики, характеризующие процессы переноса молекулы каротиноида из глобулы белка-переносчика в липидный бислой; 4) Будет проведен мэппинг культуральных клеток человека на основе анализа данных спектроскопии комбинационного рассеяния при осуществлении доставки каротиноидов с помощью белок-опосредованных механизмов. Будут исследованы массивы данных и детально изучено положение и спектральные особенности полос, характеризующих функциональное состояние и гетерогенность распределения каротиноидов в клетке (в первую очередь полосы 1520 см-1 и 1156 см-1). Будут получены карты клеток с распределением интенсивности указанных полос и значения ширины на полувысоте; 5) На основе анализа всей совокупности результатов численных и натурных экспериментов на модельных объектах в рамках 1-го года проекта и результатов экспериментов, проведенных на клеточных моделях на 2 году проекта, будут разработаны оптические биоиндикаторы эффективности адресной доставки антиоксидантов. Полученные величины будут применены для характеристики эффективности доставки конкретных каротиноидов (эхиненоны, астаксантин) с помощью конкретных белок-опосредованных механизмов (в частности, производные ОСР).
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Разработка био-оптических индикаторов эффективности белок-опосредованной адресной доставки антиоксидантов |
Результаты этапа: По результатам исследований, проведенных на 1 этапе проекта, было опубликовано две статьи в высокорейтинговых научных журналах: 1) Semenov A.N., Gvozdev D.A., Parshina E. Yu. et al // Membranes (IF 4.562, Q1) 2022, 12(10), 905; doi: 10.3390/membranes12100905 2) Semenov A.N., Gvozdev D.A., Parshina E. Yu. et al. Probing red blood cells membrane microviscosity using fluorescence anisotropy decay curves of the lipophilic dye PKH26 // International Journal of Molecular Sciences (IF 5.542, Q1) 2022, 23(24), 15767; doi: 10.3390/ijms232415767 По результатам исследований, проведенных на 1 этапе проета, было сделано два доклада на международных конференциях: 1) Raman and fluorescence lifetime imaging of cellular carotenoids distribution in algae (Устный доклад) Авторы: Semenov A.N., Protasova E.A., Parshina E.Yu, Chekanov K.A., Fedorenko T.A., Ahaev D.N., Lobakova E.S., Maksimov E.G. Мероприятие: 20th International Conference Laser Optics (ICLO 2022), г. Санкт-Петербург, Россия, 20-24 июня 2022 2) Protein-mediated carotenoid delivery into liposomes affects local microviscosity of the membrane as revealed by fluorescence anisotropy (Устный доклад) Авторы: Semenov A.N., Gvozdev D.A., Khashimova A.R., Parshina E.Y., Zlenko D.V., Baizhumanov A.A., Lotosh N.Y., Selishcheva A.A., Sluchanko N.N., Maksimov E.G. Мероприятие: Международная конференция Advanced Laser Technologies (ALT 22), г. Москва, Россия, 11-16 сентября 2022 Тезисы докладов были опубликованы в соответствующих сборниках трудов конференций. Краткое описание полученных научных результатов. В результате проведенных исследований в течение первого года выполнения проекта были измерены значения микровязкости мембраны двух типов липосом: (1) липосомы из липоида соевого лецитина S75; (2) липосомы из яичного лецитина. Мембраны соответствующих липосом различаются по своему составу фосфолипидов и соответственно обладают различной микровязкостью. Согласно полученным данным, мембрана липосом из яичного лецитина обладает более высокой микровязкостью по сравнению с мембраной липосом из соевого лецитина S75. При этом эффективность встраивания каротиноидов зависит от вязкоупругих свойств мембраны и происходит тем менее эффективнее, чем выше микровязкость мембранного бислоя. Были отработаны методики прямой нагрузки липосом S75 каротиноидами непосредственно в процессе синтеза липосом. Так, в мембрану липосом S75 были инкорпорированы бета-каротин, астаксантин, моноэфиры астаксантина и диэфира астаксантина. С помощью метода динамического светорассеяния показано, что нагрузка липосом каротиноидами дозозависимо увеличивает средний диаметр липосом и повышает дисперсность получаемой наноэмульсии. Были апробированы методики покраски мембран липосом флуоресцентным зондом TM-BODIPY. Были измерены кинетики затухания флуоресценции зонда TM-BODIPY в мембране различного типа липосом в зависимости от концентрации каротиноидов в липидной фазе. Показано, что при увеличении концентрации каротиноида в мембране наблюдаются значительные изменения в кинетике затухания флуоресценции зонда: с увеличением концентрации каротиноида наблюдается уменьшение среднего времени жизни флуоресценции зонда. Это свидетельствует о доставке каротиноида в мембрану, поскольку механизмом в основе наблюдаемых изменений служит диполь-дипольное взаимодействие в рамках переноса энергии по Ферстеру (FRET) при сближении донора (зонд TM-BODIPY) и акцептора (каротиноид) в мембране на близкие расстояния. Сравнивая изменения среднего времени жизни флуоресценции зонда TM-BODIPY в мембране липосом в зависимости от концентрации эхиненона (ECN), который был доставлен в мембрану с помощью каротиноидного белка AnaCTDH, и в зависимости от концентрации бета-каротина, который был встроен в мембрану непосредственно в процессе синтеза липосом, показано, что оба способа доставки сопоставимы друг с другом в плане эффективности. Учитывая, что прямая инкорпорация каротиноида в мембрану является достаточно трудоемким процессом так как требует наличия органических растворителей, белок-опосредованная доставка каротиноидов в мембрану липосом является предпочтительным механизмом поскольку реализуется в водной среде путем добавления комплекса «белок-каротиноид» в водный раствор уже готовых липосом. Впервые были проведены in silico расчеты локализации различных каротиноидов в билипидной мембране с применением методов молекулярной динамики. Из анализа траектории движения центра масс каротиноидной молекулы внутри билипидного слоя были получены данные о наиболее вероятно реализуемом положении (распределении) эхиненона и бета-каротина в мембране. Показано, что локализация молекул неполярного бета- каротина в мембране характеризуется бимодальным распределением, то есть бета-каротин способен занимать два различных положения в мембране. Одно положение было реализовано в ходе моделирования в прибл. 10% случаев и предполагает локализацию бета-каротина внутри мембраны под углом 40-43 градуса к нормали к поверхности мембраны. Однако значительно более вероятным является второе положение, при котором бета-каротин локализован практически параллельно мембране вблизи ее внутренней поверхности. Такая локализация была обнаружена в подавляющем количестве случаев при моделировании. При таком расположении бета-каротин взаимодействует с большим количеством фосфолипидов мембраны и тем самым ограничивает их свободную диффузию, приводя к росту локальной микровязкости. Это полностью подтверждается в эксперименте: прямая нагрузка бета-каротином липосом из соевого лецитина S75, согласно измерениям анизотропии флуоресценции TM-BODIPY в липосомальной мембране, кратно увеличивало микровязкость мембран липосом (при 18 ◦С инкорпорация мембраны бета-каротином повышает η до 85±5 сП против 20±3 сП в контроле). В то же время, распределение полярного эхиненона в мембране отличается от бета-каротина и характеризуется одномодальным распределением, которое описывает наиболее вероятное расположение эхиненона внутри липидного ядра мембраны вблизи внутренней поверхности под углом 20-30 градусов к нормали к поверхности мембраны. При таком расположении эхиненон также взаимодействует с фосфолипидами мембраны, однако со значительно меньшим их числом, тем самым в меньшей степени воздействуя на локальные вязкоупругие свойства. Это полностью подтверждается в эксперименте по измерению анизотропии флуоресценции TM-BODIPY в мембране липосом S75 при различной концентрации комплекса эхиненона (ECN) с каротиноидным белком-переносчиком AnaCTDH. Видно, что добавление AnaCTDH-ECN в раствор липосом увеличивало микровязкость липосомальной мембраны (при 20 ◦С при концентрации [AnaCTDH-ECN]=1440 нМ микровязкость η увеличилась до 31±2 сП против 20±3 сП в контроле), но на меньшую величину по сравнению с бета-каротином. С физиологической точки зрения использование эхиненона предпочтительней, поскольку он не приводит к значительным изменениям вязкоупругих свойств мембраны и в меньшей степени затрагивает текучесть мембранных фосфолипидов при сохранении своих антиоксидантных свойств. Таким образом, микровязкость является чувствительным оптическим параметром оценки и диагностики встраивания и локализации каротиноидной молекулы в мембране. Анализ характерных изменений в кинетике затухания флуоресценции зонда TM-BODIPY в мембране с увеличением концентрации каротиноидов позволил в рамках модели переноса энергии по FRET-механизму впервые описать транспорт каротиноидов в мембранном бислое в процессе доставки. Полученные экспериментальные данные флуоресцентных измерений были дополнены численным моделированием с помощью методов молекулярной динамики локализации каротиноидов (бета-каротина и эхиненона) в мембране, в результате чего были оценены средние расстояния между каротиноидами и флуоресцентного зонда при встраивании каротиноида в мембрану. Так, было рассчитано среднее расстояние между флуоресцентным зондом и бета-каротином (54 ангстрем) и между зондом и эхиненоном (68 ангстрем). Были проведены in vitro исследования на уровне живых клеток молекулярных процессов, связанных с процессами транспорта и доставки каротиноидов. С помощью анализа больших массивов спектрометрических данных микроскопии комбинационного рассеяния (КР) была впервые оценена гетерогенность распределения каротиноидов внутри клеток зеленой и красной форм микроводорослей Bracteacoccus aggregatus. Было проведено картирование каротиноид- содержащих клеток по параметрам специфических «finger-print» полос каротиноидов в КР-спектре, а именно по показателю полной ширины на полувысоте полосы 1160 см-1 (FWHM1160) и полосы 1520 см-1 (FWHM1520). С помощью этих параметров характеризуется гетерогенность распределения каротиноидов по возможным изомерным вариациям, которые может принимать каротиноидная молекула. Показано, что карты клеток микроводорослей Bracteacoccus aggregatus в вегетативной («культивационной») зеленой форме, характеризуемых набором первичных каротиноидов среди которых преобладают каротины, имеют сильно гетерогенный профиль по параметрам полос FWHM1160 и FWHM1520 и имеют выраженную структурированность, указывая на то, что содержащиеся в них первичные каротиноиды распределены во всем внутриклеточном пространстве в различных изомерных состояниях. При этом статистическое распределение значений FWHM1160 и FWHM1520 имеет широкий профиль, что естественным образом связано с большим количеством возможных изомерных форм каротиноидов. Данное обстоятельство обусловлено наличием у клеток в зеленой форме сильно развитого фотосинтетического аппарата, с которым связаны первичные каротиноиды. В т.н. «индуктивную» красную форму клетки Bracteacoccus aggregatus переходят при ухудшении внешних условий обитания, в частности, при повышенной освещенности. У клеток в красной форме редуцируется фотосинтетический аппарат, а большую часть внутриклеточного пространства заполняет липидное тело с синтезируемыми вторичными каротиноидами, среди которых доминируют астаксантины, выступающие в роли основных антиоксидантных агентов. Эти особенности клеточной физиологии находят свое отображение в картировании красных форм Bracteacoccus aggregatus по параметрам FWHM1160 и FWHM1520. Красные клетки являются более гомогенными, а весь клеточный профиль имеет две характерные области: центральная область внутри клетки и область на периферии вблизи клеточной стенки. Соответствующие карты красных клеток указывают на то, что вторичные каротиноиды в центральной части клетки находятся в одной изомерной форме, в то время как вторичные каротиноиды вблизи клеточной стенки и в ней самой находятся в другой изомерной форме. Соответственно статистическое распределение значений FWHM1160 и FWHM1520 по всей красной клетке имеет узкий профиль, а среднее значение FWHM1160 и FWHM1520 смещено в область более широких полос. Методика время-разрешенного измерения анизотропии флуоресценции зонда, находящегося в мембране, была апробирована для оценки микровязкости мембран живых клеток. Так с помощью время-разрешенной анизотропии флуоресценции витального зонда PKH26 была впервые измерена температурная зависимость микровязкости мембран эритроцитов. Кинетика анизотропии PKH26 в мембране эритроцитов имела сложный бифазный профиль, который отражал ротационные вращения двух различных фракций молекул зонда. К первой фракции относятся молекулы PKH26, которые не связаны с мембраной и свободно вращаются в буферном растворе, и корреляционное время вращения θ1 таких молекул мало. Вторая фракция состоит из молекул PKH26, заякоренных в мембране клеток. Характерное корреляционное время θ2 ротационной диффузии таких молекул много больше, поскольку они находятся в связанном с мембраной клетки состоянии. Подобные кинетики анизотропии с мультикорреляционными временами были аппроксимированы с помощью функции ассоциативного (связанного) затухания, что позволило определить корреляционное время θ2 связанной с мембраной фракции молекул зонда и определить таким образом микровязкость мембран эритроцитов, которая составила 97.7±29.3 сП при температуре 36 ◦С. В дальнейшем, микровязкость мембран эритроцитов может быть использована в качестве параметра состояния мембраны и тем самым рассмотрена в качестве оптического индикатора эффективности доставки каротиноида в мембрану клеток крови. | ||
2 | 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Разработка био-оптических индикаторов эффективности белок-опосредованной адресной доставки антиоксидантов |
Результаты этапа: Исследования, проводимые в ходе 2 этапа Проекта, были направлены на апробацию на уровне биологических объектов (мембраны живых клеток) ряда фотофизических параметров, таких как корреляционное время анизотропии мембранного флуоресцентного красителя θ и определяемая с его помощью микровязкость мембраны η, среднее время жизни флуоресценции красителя в мембране τср, а также спектральные сигнатуры каротиноидов в спектре комбинационного рассеяния (КР) каротиноид-содержащих объектов, в качестве био-оптических индикаторов оценки эффективности доставки антиоксидантов. Экспериментальные серии с применением оптических методик последовательно проводились на объектах с постепенным усложнением устройства мембраны в целях верификации описанных выше параметров. Получено, что в системе липосом с выраженной гетерогенностью липидной среды, реализованной путем модификации фосфолипидов полиэтиленгликолем, мембранная вязкость η увеличивается при встраивании β-каротина. Результат был получен в двух типах наноразмерных липосом. В липосомах из фосфолипида DPPE-ПЭГ5000 добавление каротиноида увеличивало мембранную микровязкость на 5-15% в зависимости от температуры (например, при 24 oC встраивание β- каротина обеспечило θ = 1.4±0.4 нс (η~425 сПа) против θ = 1.14±0.28 нс (375 сПа) в интактных липосомах без каротиноида). Аналогичные результаты, пусть и с меньшим (4-7 %) эффектом, были получены в системе липосом DSPE- ПЭГ2000. Таким образом, параметр мембранной микровязкости η, определяемый в ходе время-разрешенного измерения анизотропии флуоресценции мембранного красителя, является параметром, чувствительным к встраиванию каротиноида в мембранный бислой даже в условиях выраженной гетерогенности. В этой связи, имеется потенциал использования этого параметра для оценки эффективности доставки каротиноидов в мембрану еще более сложных и гетерогенных объектов, к которым относятся живые клетки. В качестве начального модельного клеточного объекта были использованы эритроциты капиллярной крови человека. Перед проведением время-разрешенных флуоресцентных измерений микровязкости мембран эритроцитов были разработаны методики витальной покраски клеток неспецифическими липофильными красителями NileRed и двух красителей на основе BODIPY (TM-BDP и BDP630/650 X NHS-эфир (BDP630)). Разработанные методики учитывают стандартные рекомендации при проведении витального окрашивания клеток, а также ряд особенностей эритроцитов, в частности, необходимость отмывки эритроцитов в фосфатном буфере от белковых компонентов плазмы крови и необходимость соблюдения температуры 37 oC при инкубации в присутствии красителя. Для каждого красителя были получены флуоресцентные изображения окрашенных эритроцитов, а также были измерены концентрационные зависимости среднего времени жизни τср флуоресценции красителя в эритроцитарной мембране для определения оптимального значения концентрации. В случае эритроцитов, оптимальные значения концентрации указанных красителей располагаются в диапазоне 500 нМ – 1 μМ, что позволяет обеспечить приемлемое соотношение сигнал\шум и избежать артефактов при использовании больших значений концентрации красителя, таких как цитотоксичность и возможные homoFRET проявления. Разработанные методики были использованы для время-разрешенного измерения микровязкости мембраны эритроцитов при осуществлении встраивания каротиноида зеаксантина с помощью каротиноидного белка AstaP (комплекс ΔNC-AstaP-ZEA). Показано, что при добавлении ΔNC-AstaP-ZEA в концентрации 0.2 мг\мл (по белку) наблюдается замедление кинетики анизотропии флуоресценции красителя в мембране, что свидетельствует об увеличении мембранной микровязкости вследствие встраивания зеаксантина в мембранный бислой эритроцитов. Для более детального исследования эффективности этого процесса были проведены эксперименты по время-разрешенной визуализации (FLIM) эритроцитов, покрашенных мембранным красителем BDP630 (концентрация 1 μМ), до и после добавления каротиноидного белкового комплекса ΔNC-AstaP-ZEA (концентрация 0.2 мг\мл). Обнаружено, что добавление каротиноидного белка приводит к уменьшению среднего времени жизни красителя с 1.87 нс (контроль) до 1.35 нс, при этом в диаграмме статистических распределений τср возникают компоненты с коротким временем жизни флуоресценции. Дополнительный анализ FLIM-изображений покрашенных эритроцитов до и после добавления каротиноидного белка указывает, что наблюдаемые результаты есть следствие миграции энергии от молекулы красителя BDP630, находящейся в мембране и выступающей в качестве донора, на доставленный в мембрану каротиноид зеаксантин, который выступает в качестве акцептора. Дополнительные численные расчеты показывают, что при данных концентрациях красителя и каротиноидного белка эффективность переноса энергии составляет 30%, а среднее расстояние между BDP630 и зеаксантином в составе пары донор-акцептор в эритроцитарной мембране составило ~90 Å. Таким образом, были получены данные, подтверждающие факт доставки каротиноида зеаксантина в мембрану с помощью белок-опосредованных механизмов и адекватность полученных изменений мембранной микровязкости η, зафиксированных в ходе время-разрешенных измерений анизотропии флуоресценции. Дальнейшие шаги были направлены на проведение экспериментов по оценке следующих аспектов белок- опосредованной доставки каротиноидов, а именно обеспечение антиоксидантой защиты. Для этого была исследована линия клеток пигментного эпителия сетчатки взрослого человека ARPE-19, нагруженная липофусциновыми гранулами в качестве источника оксидативного стресса. Известно, что липофусциновые гранулы способны генерировать активные формы кислорода и другие радикалы под действием света, тем самым вызывая сильный цитотоксический эффект. Отсутствие должного контроля состояния липофусциновых гранул в клетках пигментного эпителия может значительно ухудшить протекание болезни и в некоторых случаях, в частности, при возрастной макулярной дегенерации, привести к полной потери зрения. Возможным видом терапии глазных патологий, связанных с накоплением липофусциновых гранул, является направленная доставка в клетки сетчатки и пигментного глазного эпителия антиоксидантов на основе каротиноидов. В ходе Проекта были проведены время-разрешенные FLIM-исследования клеток ARPE-19 с липофусцином, фотоокисление которых было проведено путем освещения клеточной культуры белым светом диодных ламп, в присутствии и в отсутствие холо-формы каротиноидного белка BmCBP в комплексе с зеаксантином (комплекс BmCBP-ZEA) в концентрации 200 нМ. Детальный анализ полученных усредненных кинетик затухания флуоресценции липофусцина и диаграмм распределений средних времен жизни показал, что, во-первых, само присутствие BmCBP- ZEA без фотоокисления уже приводит к уменьшению времени жизни флуоресценции липофусцина (контроль без облучения, 272±12 пс в пробах с белком (BmCBP+) против 333±35 пс в пробах без белка (BmCBP-)). Во-вторых, обнаружен заметный эффект сдерживания роста времени жизни флуоресценции липофусцина под действием фотоокисления (облучение, 338±23 пс в пробах с белком (BmCBP+) против 440±50 пс в пробах без белка (BmCBP-)). На заключительном этапе работ на 2 году Проекта был апробирован оптический параметр оценки гетерогенности распределений каротиноидов в различных формах каротиноид-продуцирующих объектов (клеток водорослей Bracteacoccus aggregatus), основывающийся на соотношении интенсивностей полос-сигнатур (1520 см-1 и 1156 см-1) каротиноидов в КР спектре (параметр I1520/I1156). Значения I1520/I1156, посчитанные для КР-спектра в каждом пикселе изображения, позволяют восстановить карты клеточных объектов в масштабе величины I1520/I1156. Гетерогенность структур на полученных картах клеток позволяет анализировать особенности перераспределения каротиноидов первичного и вторичного наборов в процессе перехода клеток водорослей из вегетативной формы в индуктивную. Так, карты вегетативной (зеленой) формы водорослей Bracteacoccus aggregatus характеризуются широким распределением значений параметра I1520/I1156 со средним значением 1.32±0.01. По мере трансформации в индуктивные оранжевые и красные формы под действием внешних стрессовых условий, соответствующие карты клеток изменяются, и структура этих карт принимает значительно более гомогенный характер. Среднее значение параметра I1520/I1156 при этом смещается в область больших значений: 1.41±0.02 для оранжевой формы и 1.44±0.01 для красной формы. Наблюдаемые изменения связаны с двумя параллельными процессами, происходящими в клетках под действием внешнего стресса: редуцирование фотосинтетического аппарата и синтез вторичных каротиноидных продуктов. Поскольку зеленая, оранжевая и красная формы характеризуются различным набором каротиноидов, параметр I1520/I1156 играет важную роль с точки зрения биотехнологии производства каротиноидов, так как различные потребительские запросы от косметологии и медицины до пищевой промышленности требуют наработки каротиноидов самого разного типа. По результатам за 2 год подготовлено и опубликовано 2 статьи: 1) Semenov Alexey N., Maksimov Eugene G., Shirshin Evgeny A., Sluchanko Nikolai N., Feldman Tatiana B., Rubin Andrew B., Kirpichnikov Mikhail P., Ostrovsky Mikhail A. et al. Protein-Mediated Carotenoid Delivery Suppresses the Photoinducible Oxidation of Lipofuscin in Retinal Pigment Epithelial Cells // ANTIOXIDANTS (IF 7.0), vol. 12(2), 413, pp. 1-19 DOI: 10.3390/antiox12020413. 2) Gvozdev Daniil A., Semenov Alexey N., Tsoraev Georgy V., Maksimov Eugene G. The Role of the Photon Counting Loss Effect in Time-Resolved Measurements of Fluorescence Anisotropy // Photonics (IF 2.536), vol. 10 (6), 681, pp.1-11. DOI: 10.3390/photonics10060681. Результаты, полученные на 2 году Проекта, были доложены на Международной конференции Advanced Laser Technologies (ALT) – 2013, г. Самара, Россия, сентябрь 2023 г. (приглашенный доклад). |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".