ИСТИНА

Исследование кинетических параметров коммуникации элементов генома (в частности, границ хроматиновых петель) в живых клетках в норме и при деплеции компонентов когезинового комплекса.

Biochemical methods for studying genome topology, such as Hi-C, have revealed characteristic features of eukaryotic chromosome organization: the presence of topologically associated domains (TADs), loops and compartments. Apparently, the CTCF protein and cohesin complex play a key role in the formation of TADs and loops in mammals. TADs were originally discovered as a statistical phenomenon reflecting the preferred probability of contacts between different parts of the genome. However, in each individual cell, these contacts may differ from the averaged picture obtained on the cell population. In addition, data on the organization of the genome in TADs have so far been obtained only on fixed cells, by Hi-C and FISH methods. These are end-point methods, as opposed to real-time observation. With these methods it is impossible to analyze the same cell at different time points, so the process of TADs and loops formation and their dynamics in a single cell has not yet been studied in real time. The project aims to study the kinetic parameters of communication of genome elements (in particular, chromatin loops) in living cells in normal confition and during the depletion of cohesin complex components. To achieve the goals of the project, cell lines will be obtained on which in vivo visualization of DNA loci will be performed during disassembly and recovery of TADs and chromatin loops. To assemble and disassemble TADs, an AID-depletion system will be used. It is based on auxin-induced ubiquitinylation of the target protein, which leads to its degradation in the proteasome. For ubiquitination, the target protein is fused to degron, a special amino acid sequence recognized by the ubiquitin ligase complex. CRISPR imaging will be used to visualize the target loci. This method is based on the use of a catalytically inactive Cas9 (dCas9), which is recruited to the target locus using guide RNA. An example of the technology is CRISPR-Sirius, where aptamer modules are added to the guide RNA to increase signal brightness. Aptamer modules are the RNA hairpins of bacteriophages MS2 and PP7 recognized by the proteins of these bacteriophages (MCP and PCP), fused with fluorescent proteins. The project will produce data characterizing the spatial dynamics of the loci that make up the TADs and loops. In addition, visualization of several loci in the same cell (e.g. TAD boundaries) will allow for the first time to follow in real time the process of formation of the studied chromatin folding elements in a living cell and to describe the kinetics of this process. The results will be of great fundamental value, since they will expand the understanding of the mechanisms of chromatin folding in human cells. The methods planned for this project can be adapted to study the spatial dynamics and mutual arrangement of any genomic loci. Thus, this project, if successful, could serve as a starting point for a series of future projects.

Для решения поставленных задач на втором году выполнения проекта будут проведены следующие эксперименты и ожидается получить следующие результаты: 1. Проанализировать сближение пары локусов, формирующих петлю и находящихся на разных границах одного ТАДа, во время восстановления когезина после временной деплеции. Клетки полученной линии будут трансфицированы плазмидами с визуализирующими РНК-гидами к локусам, расположенным на границе ТАДа. Локусы, подходящие для визуализации, будут выбраны на основе анализа Hi-C карты используемых клеточных линий. Локусы будут визуализироваться разными цветами. Клетки засеваются на чашку со стеклянным дном, помещаются на конфокальный микроскоп на специальный столик с камерой, поддерживающей необходимую температуру и атмосферу. Сначала клетки микроскопируются без ауксина, затем добавляется ауксин, что приведет к деградации когезина, и затем клеткам меняют среду на свежую без ауксина. На протяжении всего эксперимента ведется микроскопирование. В описанном эксперименте мы ожидаем увидеть, что среднее расстояние между локусами после деплеции когезина увеличится, а затем, после восстановления когезина, снова уменьшится, отражая образование петли. В ходе такого эксперимента мы сможем определить процент клеток, в которых наблюдается сближение локусов на границе ТАДов. Это позволит нам понять, как согласуются данные о контактах, наблюдаемые на картах Hi-C, с данными, получаемыми при микроскопии индивидуальных клеток. Кроме того, мы сможем измерить кинетику сближения локусов, отражающую кинетику образования ТАДов. 2. Сравнить сближение пары локусов, формирующих петлю и находящихся на разных границах одного ТАДа, со сближением пары локусов, находящихся в разных ТАДах, во время восстановления когезина после временной деплеции. Параллельно с первым экспериментом будет поставлен аналогичный, но визуализироваться будут уже другая пара локусов — которая находится примерно на том же расстоянии по геному, но в разных ТАДах («вторая пара»). Мы ожидаем, что при восстановлении ТАДов среднее расстояние во второй паре локусов не будет уменьшаться в той же степени, что среднее расстояние в первой паре локусов (располагающихся на границе одного ТАДа и формирующих петлю). Такие результаты подтвердят гипотезу, что расстояние между локусами в пространстве в индивидуальных клетках действительно коррелирует с их расположением на карте Hi-C. 3. Проанализировать сближение локуса, находящегося в основании страйпа, с другими локусами, входящими в состав страйпа, во время восстановления когезина после временной деплеции. На полученных клетках с дегроном в RAD21 и системой CRISPR-имаджинга будет поставлен эксперимент для проверки модели, согласно которой страйпы возникают в результате однонаправленного протягивания заякоренным когезином хроматиновой фибриллы. В данном эксперименте мы подберем визуализирующие гидовые РНК к следующим локусам: к основанию страйпа, к другой границе ТАДа со страйпом, к локусу в соседнем ТАДе. В ходе такого анализа мы сможем определить кинетические параметры образования страйпа, выяснить, в какой доле клеток в действительности наблюдается сближение локусов. Согласно модели однонаправленной экструзии петли при образовании страйпа после деплеции когезина и отмывки от ауксина локус в основании страйпа будет приближаться к локусу на другой границе ТАДа. При этом можно ожидать, что скорость сближения таких локусов будет меньше, чем скорость сближения границ ТАДов сходного размера без страйпов, формирующихся, по-видимому, по механизму двунаправленной экструзии петли. В качестве контрольного локуса будет визуализирован локус в другом ТАДе, который не должен приближаться к локусу в основании страйпа (или будет это делать в меньшей доле клеток). 4. Исследовать расстояние между соседними ТАДами для пары ТАДов, находящихся в А-компартменте, и для пары ТАДов в B-компартменте. В данном эксперименте мы подберем гидовые РНК к двум ТАДам. В одном эксперименте мы визуализируем ТАДы, находящиеся в А-компартменте, а в другом — в B-компартменте. Мы ожидаем, что расстояние между ТАДами из А-компартмента будет больше, чем расстояние между ТАДами из B-компартмента, поскольку хроматин в B-компартменте должен быть сильнее компактизован. 5. Выявить, наследуется ли при делении клетки относительное расстояние между локусами, входящими в состав соседних ТАДов. В индивидуальных клетках будет измерено расстояние между соседними ТАДами до митоза, и после митоза. Затем будет проведено сравнение дисперсии расстояния между локусами в выборке индивидуальных клеток до и после митоза. Если эта дисперсия будет маленькой, то расстояние между ТАДами наследуется при делении клетки. Если эта дисперсия будет сопоставима с дисперсией по популяции клеток, то расстояние между ТАДами не наследуется. В данном исследовании мы визуализируем две пары соседних ТАДов: одна пара ТАДов будет из А-компартмента, другая пара — из В-компартмента. Это позволит нам понять, существует ли различие в наследовании характерного расстояния между ТАДами в разных компартментах. 6. Проанализировать подвижность различных локусов во время восстановления когезина после временной деплеции. В качестве таких локусов будут выступать следующие локусы: на границе ТАДа в основании страйпа, на границе ТАДа без страйпа, внутри ТАДа. Мы ожидаем, что подвижность локуса внутри ТАДа будет выше подвижности локуса на границе ТАДов, поскольку этот локус не так жестко закреплен, как основание петли. Кроме того, мы ожидаем, что подвижность локуса в основании страйпа будет меньше подвижности локуса на границе ТАДа без страйпа (но с петлей): диффузия в ядерном пространстве комплекса, состоящий из крупного петлеобразующего белка и ДНК будет ограничена множественными транзиентными взаимодействиями с экструдируемыми участками ДНК. В качестве меры подвижности будет анализироваться MSD-кривые (mean square displacement), по которым можно вычислить характеристики подвижности: тип подвижности локуса (диффузия, ограниченная диффузия, направленное движение) и диффузионный коэффициент. Для корректировки общего смещения ядра будет анализироваться также подвижность ядрышка: по нашим данным и по опубликованным данным (Fu et al., 2016), белки PCP-EGFP и MCP-Santaka в некоторой степени накапливаются в ядрышках, что делает их видимым в клетках.

Лаборатория, где работает коллектив авторов проекта, специализируется на молекулярном клонировании и получении различных клеточных линий с отредактированным геномом, а также на работе по прижизненной визуализации локусов ДНК в клетках млекопитающих, что является главными методическими задачами в данном проекте. За последние годы в лаборатории были собраны десятки плазмидных конструкций, использующихся для редактирования генома, поэтому для коллектива не станет сложностью собрать все необходимые конструкции в рамках заявляемого проекта. Также члены коллектива обладают опытом проведения исследований C-методами и анализа данных подобных экспериментов. Всё это позволит нам успешно выполнить все запланированные в проекте работы.