![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Проект направлен на исследование актуальной и малоизученной проблемы – участия и роли в регуляции нервно-мышечной синаптической передачи предшественника нейротрофина мозга (BDNF – brain-derived neurotrophic factor) - proBDNF и образующегося за счет его протеолиза продомена BDNF – побочного продукта «созревания» BDNF. BDNF, хорошо известный нейротрофин семейства полипептидных факторов роста, в последнее время достаточно широко исследуется как преимущественно ретроградный регулятор синаптической передачи в моторных синапсах, реализующий целый спектр пресинаптических эффектов (Hurtado et al., 2017; Simo et al, 2018; Gaydukov et al., 2018; Gaydukov et al., 2019). И предшественник BDNF (proBDNF), и продукт образования BDNF (продомен BDNF) потенциально способны проявлять собственное сигнальное действие. Запланированное изучение регуляторных эффектов proBDNF и продомена BDNF именно в моторных синапсах отличается исключительной новизной, поскольку, несмотря на присутствие в них потенциальной мишени их рецепторного действия - рецептора p75 (Garcia et al., 2010), данные о самостоятельном модулирующем квантовую секрецию медиатора действии proBDNF и продомена BDNF в моторных синапсах (в отличие от синапсов ЦНС), практически отсутствуют. В ходе выполнения проекта будут изучены проявления регуляторного влияния (судя по пилотным экспериментам – преимущественно негативные) proBDNF и продомена BDNF на спонтанную и вызванную стимуляцией нерва быструю синхронную квантовую секрецию ацетилхолина как в зрелых моторных синапсах мыши (m. diaphragm и m.extensor digitorum longus (EDL)), так и в синапсах, новообразуемых после пережатия нерва, которые функционально отличаются от зрелых (m. EDL). Конкретными целями проекта являются выявление рецепторов, через активацию которых реализуется регуляторное действие proBDNF и продомена BDNF в зрелых и новообразованных в ходе реиннервации моторных синапсов, а также запускаемых при активации этих рецепторов сигнальных каскадов и финальных мишеней этих каскадов, обеспечивающих изменения нервно-мышечной передачи. Поиск финальных мишеней proBDNF и продомена BDNF будет проводиться среди спектра пресинаптических калиевых каналов (GIRK, потенциал-зависимые Kv-каналы, кальций-активируемые SK-каналы и BK-каналы), способных опосредованно контролировать уровень активности триггерных потенциал-зависимых кальциевых каналов моторных терминалей и уровень секреции медиатора. Исследования будут проводиться с использованием классического электрофизиологического метода регистрации постсинаптических потенциалов (или, если потребуется, постсинаптических токов в режиме двухэлектродной фиксации потенциала мышечных волокон) в сочетании с селективными фармакологическими воздействиями на интересующие компоненты сигнальных каскадов и их финальных мишеней. Параллельно будут использованы молекулярно-биологические методики (иммуноферментный анализ и вестерн-блоттинг) для подтверждения наличия в моторных синапсах proBDNF, компонентов запускаемых proBDNF и продоменом BDNF сигнальных путей и их мишеней. В ходе выполнения проекта предполагается охарактеризовать механизмы регуляции квантовой секреции медиатора (ацетилхолина) в моторных синапсах под действием proBDNF и продомена BDNF. Актуальность решения данной проблемы обусловлена необходимостью более детального исследования и переоценки однозначного действия BDNF в моторных синапсах с учетом реального спектра возможных одновременно сосуществующих влияний не только зрелого BDNF, но и proBDNF и/или продомена BDNF на параметры синаптической передачи.
The project is aimed at investigating a highly topical and little-studied problem - the participation and role in the regulation of neuromuscular synaptic transmission of the precursor of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) - proBDNF and the prodomain BDNF, a by-product of BDNF maturation, formed due to proBDNF proteolysis. BDNF, a well-known neurotrophin of the family of polypeptide growth factors, has recently been widely studied as a predominantly retrograde regulator of synaptic transmission in motor synapses, realizing a whole spectrum of presynaptic effects (Hurtado et al., 2017; Simo et al., 2018; Gaydukov et al., 2018; Gaydukov et al., 2019). Both the BDNF precursor (proBDNF) and the BDNF maturation product (BDNF prodomain) are potentially capable of exerting their own signaling effects. The planned study of the regulatory effects of proBDNF and the BDNF prodomain precisely in motor synapses is extremely novel, because, despite the presence of a potential target of their receptor action, the p75 receptor (Garcia et al., 2010), data concerning modulation of quantal neurotransmitter release by proBDNF and BDNF prodomain in motor synapses (in contrast to CNS synapses) are practically absent. In the course of the project, the manifestations of the regulatory influence (judging by the pilot experiments, mostly negative) of proBDNF and the BDNF prodomain on the spontaneous and induced by nerve stimulation, rapid synchronous quantal release of acetylcholine will be researched, both in mature motor synapses of mice (m. diaphragma and m. extensor digitorum longus (m. EDL)) and in newly-formed synapses after nerve clamping, which are functionally different from mature ones (m. EDL). The specific goals of the project are to identify receptors via the activation of which the regulatory action of proBDNF and the BDNF prodomain is realized in mature and newly-formed motor synapses during reinnervation, as well as signaling cascades triggered by activation of these receptors and the final targets of these cascades that provide changes in neuromuscular transmission. The search for the final targets of proBDNF and the BDNF prodomain will be carried out among the spectrum of presynaptic potassium channels (GIRK, calcium-activated SK-channels and BK channels), which can indirectly control the level of activity of voltage-gated calcium channels of motor terminals and the level of transmitter release. The studies will be carried out using the classical electrophysiological method of recording postsynaptic potentials (or, if required, postsynaptic currents in the mode of two-electrode voltage-clamp) in combination with selective pharmacological effects on the components of signaling cascades of interest and their final targets. In parallel, molecular biological techniques (enzyme-linked immunosorbent assay and Western blotting) will be used to confirm the presence in motor synapses of components triggered by proBDNF and the BDNF prodomain of signaling pathways and their targets. In the course of the project, it is planned to characterize the mechanisms of regulation of the quantal release of a neurotransmitter (acetylcholine) in motor synapses by proBDNF and the BDNF prodomain. The urgency of solving this problem is due to the need for a more detailed study and reevaluation of the unambiguous action of BDNF in motor synapses, taking into account the real spectrum of possible simultaneously coexisting influences of not only mature BDNF, but also proBDNF and / or BDNF prodomain on the parameters of synaptic transmission.
Запланирован ряд взаимосвязанных серий экспериментов, направленных на раскрытие молекулярных механизмов синаптического действия proBDNF и продомена BDNF в моторных синапсах m. diaphragmа и m. EDL (интактных и новообразованных после пережатия нерва) мыши. Основной метод – микроэлектродная электрофизиологическая регистрация и анализ параметров спонтанных МПКП и вызванных ПКП (в ходе генерации ритмических залпов ПКП (50 Гц, 1 с). Выявленные в ходе выполнения проекта изменения параметров МПКП и ПКП результате действия продомена BDNF, расщепляемой и устойчивой к расщеплению форм proBDNF будут далее подвергнуты проверке (с использованием селективных блокаторов) на возможное участие в реализации этих изменений калиевых каналов: входящего выпрямления - GIRK, кальций-активируемых малой проводимости – SK; кальций-активируемых большой проводимости – BK. В случае выявления неучастия в реализации эффектов продомена BDNF и proBDNF всех вышеперечисленных калиевых каналов предусмотрена дополнительная серия экспериментов, которая будет направлена на выявление возможного вклада потенциалзависимых калиевых каналов в реализацию синаптического модулирующего влияния proBDNF и продомена BDNF. Далее планируется выявить участие в реализации синаптических эффектов proBDNF и продомена BDNF в интактных и новообразованных моторных синапсах мыши p75-рецепторов (с использованием блокатора их сигналинга TAT-Pep5) и сигнального каскада с участием RhoA (с использованием ингибитора Y27632). Запланирован сравнительный анализ с использованием гель-электрофореза и Вестерн-блоттинга уровня p75 в образцах используемых в проекте нервно-мышечных препаратов, а также анализ уровня активации RhoA при действии на нервно-мышечные препараты продомена BDNF и proBDNF путем комбинированного иммуноферментного анализа общего уровня RhoA и уровня активного RhoA, ассоциированного с GTP. В ТЕЧЕНИЕ ПЕРВОГО ГОДА РАБОТЫ (2022-2023 гг.) планируется провести основную часть исследований в рамках решения задач 1 и 2, упомянутых в пункте 4.3, а именно: 1. Финализировать исследования изменений параметров спонтанной и вызванной синаптической активности в зрелых и новообразованных моторных синапсах под действием proBDNF (расщепляемой и нерасщепляемой форм) и продомена BDNF при их экзогенной действии (каждый – в концентрации 1 нМ) на нервно-мышечные препараты (задача 1). 2. Исследовать влияние на спонтанную и вызванную синаптическую передачу в зрелых и новообразованных моторных синапсах совместного введения продомена BDNF и зрелого BDNF (в эквимолярной концентрации 1 нМ) (задача 1). 3. Провести масштабные электрофизиологические исследования по установлению, какие именно калиевые каналы – GIRK, SK или BK – участвуют в реализации синаптических эффектов proBDNF и продомена BDNF в зрелых и новообразованных синапсах мыши. Данные серии экспериментов будут проведены с использованием экзогенной аппликации proBDNF или продомена BDNF в присутсвии селективных ингибиторов калиевых каналов – тертиапина (GIRK), апамина (SK), ибериотоксина или паксиллина (BK) (задача 2). В результате проведенных исследований 1-го года работы: 1. Будут окончательно финализированы (с учетом имеющихся предварительных результатов) приоритетные данные о в целом негативном характере модулирования различных параметров спонтанной и вызванной синаптической передачи под действием расщепляемого proBDNF, устойчивого к расщеплению proBDNF и продомена BDNF в зрелых и новообразованных после пережатия моторных синапсах. 2. Будут получены данные о сравнительной силе регуляторного влияния на синаптическую передачу в зрелых и новообразованных синапсах продомена BDNF и зрелого BDNF. Учитывая наши предварительные данные об отсутствии влияния 1 нМ расщепляемого proBDNF (служащего источником продомена и зрелого BDNF) на синаптическую передачу в зрелых моторных синапсах и снижения частоты МПКП в новообразованных синапсах, где в результате травмы может быть повышен уровень p75, мы ожидаем выявления более высокого вклада продомена BDNF в регуляцию секреции ацетилхолина в новообразованных синапсах по сравнению со зрелыми 3. Будут получены данные, какой (или какие) именно калиевые каналы (GIRK, SK или BK) моторных нервных терминалей обеспечивают угнетающее действие продомена BDNF и (возможно) proBDNF на квантовую секрецию в зрелых и новообразованных моторных синапсах. В ТЕЧЕНИЕ ВТОРОГО ГОДА РАБОТЫ (2023-2024 гг.) планируется на основе результатов решения задач 1 и 2, упомянутых в пункте 4.3, выполнить задачу 3, а именно: 1. Электрофизиологически исследовать роль p75 рецепторов как потенциальной мишени proBDNF и продомена BDNF в моторных синапсах, через активацию которых эти сигнальные молекулы могут реализовывать свои синаптические эффекты. В качестве фармакологического инструмента будет использован блокатор сигналинга p75 – TAT-Pep5 в сочетании с аппликацией proBDNF (его расщепляемой или нерасщепляемой формы – выбор будет сделан по результатам решения задачи 1 в ходе 1го года выполнения проекта) или продомена BDNF. 2. Сопоставить уровень белка p75 в образцах иннервированной и неиннервированной частей мышечных волокон m. diaphragma, m. EDL (интактная) и m. EDL (реиннервированная после пережатия нерва, с новообразованными синапсами). с использованием гель-электрофореза и Вестерн-блоттинга. 3. Провести электрофизиологическую оценку роли RhoA-сигнального пути в качестве вероятного посредника в реализации синаптических эффектов proBDNF и продомена BDNF в моторных синапсах. В качестве фармакологического инструмента будет использован ингибитор RhoA - Y27632 в сочетании с аппликацией proBDNF (его расщепляемой или нерасщепляемой формы – выбор будет сделан по результатам решения задачи 1 в ходе 1го года выполнения проекта) или продомена BDNF. 4. Оценить увеличение активности RhoA с использованием в образцах иннервированной и неиннервированной частей мышечных волокон m. diaphragma, m. EDL (интактная) и m. EDL (реиннервированная после пережатия нерва, с новообразованными синапсами) в результате действия proBDNF (его расщепляемой или нерасщепляемой формы – выбор будет сделан по результатам решения задачи 1 в ходе 1го года выполнения проекта) или продомена BDNF.
Мы провели пилотные эксперименты на зрелых и новообразованных синапсах, исследуя влияния расщепляемой формы proBDNF и продомена BDNF (оба – 1 нМ) на параметры спонтанной и вызванной секреции (при короткой высокочастотной стимуляции нерва) ацетилхолина. ProBDNF вызвал статистически значимое снижение частоты МПКП в новообразованных, но не зрелых синапсах, в которых расщепляемый предшественник нейротрофина был неэффективен в плане изменения каких либо параметров как спонтанной, так и вызванной секреции ацетилхолина. По результатам пилотных экспериментов в зрелых синапсах продомен BDNF оказывает мощное угнетающее действие как на спонтанную секрецию квантов ацетилхолина (уменьшение как частоты МПКП, так и их амплитуды), так и на вызванный многоквантовый синхронный выброс медиатора (уменьшение амплитуды и квантового состава ПКП в залпах). При этом в новообразованных синапсах уменьшение амплитуд ПКП сопровождается постоянством квантового состава за счет роста амплитуды МПКП. Эти предварительные данные позволяют предполагать увеличение под действием продомена пресинаптической калиевой проводимости, снижающей поступление ионов кальция в терминаль, что негативно сказывается на уровне нервно-мышечной передачи. Эти результаты требуют проверки, и механизмы в целом негативного влияния продомена BDNF (и proBDNF) планируется более подробно рассмотреть в данном проекте с детальным анализом того, за счет чего угнетается квантовая секреция ацетилхолина.
Мы впервые показали ранее неизвестную активность двух пептидных побочных продуктов процессинга BDNF (proBDNF и продомен BDNF) в моторных синапсах мышей. Эти сигнальные молекулы участвуют в регуляции выброса квантов АХ, и их эффекты в большинстве случаев отличаются от эффектов зрелого BDNF. ЗРЕЛЫЕ МОТОРНЫЕ СИНАПСЫ ДИАФРАГМЫ МЫШИ. Расщепляемый proBDNF (1 нМ) в зрелых моторных синапсах не влияет на параметры спонтанного и вызванного выброса АХ. Отсутствие влияний на секрецию медиатора у proBDNF, в отличие от его тормозного действия, наблюдавшегося в новообразованных синапсов, очевидно, связано с возможными изменениями функционирования пронейротрофинов в зрелых моторных синапсах. Нами был обнаружен неизвестный ранее широкий спектр выраженных тормозных влияний продомена BDNF на спонтанную (одноквантовую) и вызванную синхронную многоквантовую секрецию ацетилхолина в зрелых моторных синапсах: снижение частоты МПКП, уменьшение квантового состава ПКП в коротком высокочастотном залпе и снижение амплитуды постсинаптических потенциалов (возникающее не за счет снижения входного сопротивления мышечных волокон). Сортилин играет ключевую роль неотъемлемого компонента рецепторного комплекса с рецептором p75 (но не с TrkB), обеспечивающего совместно «правильную» рецепцию продомена BDNF и запуск сигнального пути с участием RhoА и Rho-киназы, направленного на активацию калиевых каналов GIRK и SK. Открытие участия каналов GIRK в негативной регуляции квантовой секреции в моторных синапсах млекопитающих двумя ранее неизученными сигнальными молекулами, связанными с BDNF, является еще одним приоритетом коллектива. Известно, что GIRK обладают своеобразным механизмом активации – со стороны Giβγ-субъединиц (при активности метаботропных рецепторов, сцепленных с Gi-белком) и фосфоинозитол-(4,5)-бисфосфата (PIP2). Мы определили конкретный тип метаботропных G-белок-сцепленных рецепторов, обеспечивающих возможность активации GIRK. Из трех пресинаптических (M2, P2Y13 и A1) исключительно А1-рецепторы аденозина оказались функционально сопряжены не только с торможением кальциевых -каналов L-типа, но и с GIRK-опосредованным угнетением квантовой секреции ацетилхолина под действием продомена BDNF. Результаты наших предыдущих исследований и данные, полученные в ходе выполнения проекта – свидетельствуют о дуальной регуляторной роли А1-рецепторов в зрелых моторных синапсах. Эти метаботропные рецепторы выступают как негативный регулятор активности L-типа Са2+-каналов, и одновременно могут играть роль коактиватора GIRK, что необходимо для реализации тормозных эффектов продомена BDNF. Используя нокаутных по гену паннексина 1 мышей или фармакологическое блокирование этого белка, мы выявили необходимость функционирование в моторных синапсах именно «паннексинового источника» синаптических пуринов (АТФ/аденозина) для А1-зависимого GIRK-опосредованного тормозного синаптического действия продомена BDNF. Мы впервые показали, что ингибирование PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10), способное сдвигать фосфолипидный метаболизм в сторону снижения содержания PIP2 полностью предотвращает торможение квантовой секреции, вызываемое продоменом BDNF в зрелых моторных синапсах диафрагмы мыши. Таким образом, мы получили доказательства того, что вовлечение GIRK в регуляцию квантовой секреции АХ в зрелых моторных синапсах мыши возникает при пространственно-временном «совпадении» эндогенной активации аденозиновых А1-рецепторов и возрастания PIP2 за счет активации PTEN в результате запуска продоменом BDNF сигнального каскада с участием Rho-киназы. Мы показали, что при запуске продоменом сигнального пути с участием Rho-киназы активация SK-каналов обеспечивается за счет функционирования рианодин-чувствительных кальциевых депо. Блокирование рианодиновых рецепторов полностью «восстанавливало» индуцируемое продоменом BDNF снижение частоты МПКП и квантового состава ПКП (оба эти параметра секреции АХ имеют пресинаптическую природу) при заблокированных SK-каналах. Вовлечение SK-каналов в реализацию негативного влияния продомена BDNF на квантовую секрецию АХ обеспечивается возможным ROCK-опосредованным торможением активности кальциевой АТФазы кальциевых депо. Такое индуцированное продоменом действие ROCK способно увеличивать внутриклеточную концентрацию ионов кальция за счет его выхода из депо через рианодиновые рецепторы и активировать SK-каналы, вовлекая их в регуляцию квантовой секреции ацетилхолина. НОВООБРАЗОВАННЫЕ МОТОРНЫЕ СИНАПСЫ. Расщепляемый proBDNF (1 нМ) снижал частоту МПКП и увеличивал значение МП мышечных волокон в новообразованных синапсах из-за активации пресинаптических калиевых каналов GIRK, но не затрагивал характеристики вызванной квантовой секреции АХ. Ингибирующий эффект proBDNF на спонтанную секрецию АХ отличается от потенцирующего действия зрелого BDNF на амплитуду постсинаптических потенциалов в регенерирующих моторных синапсах. Мы впервые показали, что в новообразованных синапсах ингибирующее действие proBDNF на частоту МПКП реализуется не за счет p75-опосредованного сигнального пути, связанного с Rho-GDI, но требует участия TrkB и сортилина. Кроме того, мы получили новые приоритетные данные, что в новообразованных синапсах вовлечение GIRK в регуляцию спонтанной секреции не сопряжено с активностью M2-, P2Y13- и A1-рецепторов. Наряду с proBDNF нами впервые исследована активность продомена BDNF в новообразованных синапсах, оказывающего там разнонаправленное действие на выброс квантов АХ: продомен действует синергично с BDNF и стимулирует увеличение размера квантов АХ, но снижает квантовый состав ПКП, то есть, как и расщепляемый пронейротрофин, стабилизирует вызванную секрецию АХ. Анализ компонентов рецепции proBDNF и продоменом BDNF показал, что запуск ими сигнальных путей в новообразованных синапсах, вызывающих целый спектр синаптических эффектов, требует участия TrkB, сортилина и p75. Cортилин в этих синапсах, по-видимому, способен взаимодействовать не только с TrkB рецепторами, но и с p75 рецепторами, обеспечивая развитие собственных синаптических эффектов у proBDNF и продомена. В случае пронейротрофина такой многокомпонентный рецепторный комплекс (сортилин/TrkB/p75) обеспечивает стабилизацию вызванной секреции АХ и снижению частоты спонтанной секреции квантов АХ (за счет активации GIRK) в функционально ослабленных моторных синапсах при реиннервации мышечных волокон. Все три компонента рецепторного комплекса необходимы для запуска сигнальных путей, обеспечивающих разнонаправленные влияния на параметры квантовой секреции АХ продомена BDNF – при ингибировании любого из этих компонентов продомен BDNF полностью утрачивал способность вызывать увеличение размера квантов АХ и снижать квантовый состав ПКП в новообразованных синапсах. GIRK-независимое снижение квантового состава ПКП в присутствии продомена BDNF соответствует современным данным об ингибирующих эффектах proBDNF (и продомена BDNF) на секрецию нейромедиаторов и развитие форм синаптической пластичности, подавляющих ее в синапсах ЦНС и регенерирующих нервно-мышечных соединениях. Анализ вовлечения сигнального каскада с участием митоген-активируемой киназы MEK1/2 в TrkB-опосредованное увеличении размера квантов АХ в новообразованных синапсах показал, что как зрелый нейротрофин, так и его продомен в равной степени задействуют этот сигнальный каскад, аналогично тому, как это происходит в зрелых моторных синапсах под действием BDNF (но не продомена BDNF). Вероятнее всего, такая синергичность действия нейротрофина мозга и его продомена обеспечивается их взаимодействием с TrkB-рецепторами (в составе рецепторного комплекса с p75 и сортилином), способными при их активации запускать сигнальный каскад с участием митоген-активируемых протеинкиназ. Новым и неожиданным фактом является выявленная нами связь MEK1/2-Erk-сигнального каскада не только с увеличением размера квантов под действием продомена BDNF в новообразованных моторных синапсах, но и с уменьшением в них квантового состава ПКП.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Механизмы регуляции квантовой секреции медиатора под действием пронейротрофина мозга (proBDNF) и продомена нейротрофина мозга (продомена BDNF) в моторных синапсах млекопитающих |
Результаты этапа: 1) в моторных синапсах млекопитающих продукты созревания BDNF – proBDNF и продомен BDNF способны оказывать каждый самостоятельное модулирующее влияние на спонтанную и вызванную секрецию АХ, причем преимущественно тормозное, в отличие от зрелого нейротрофина. 2) Характер и конкретное воздействие proBDNF (его расщепляемой и устойчивой к расщеплению форм) и продомена BDNF на определенные параметры спонтанной или вызванной секреции АХ зависит от функционального состояния моторных синапсов. 3) В новообразованных синапсах m.EDL proBDNF и продомен BDNF реализуют свои эффекты за счет неканонической активации рецепторов TrkB, приводящей к стабилизации вызванной секреции АХ в этих функционально незрелых синапсах. 4) В зрелых моторных синапсах диафрагмы продомен BDNF, в отличие от зрелого нейротрофина, тормозит спонтанную и вызванную квантовую секрецию АХ за счет активации рецепторов p75 и запуска сигнального каскада с участием Rho-киназы. 5) Впервые показано доминирующая роль каналов GIRK в реализации тормозных эффектов пронейротрофина в новообразованных синапсах m.EDL, и сочетанное вовлечение GIRK, SK каналов и синаптических пуринорецепторов в проявлении тормозного влияния продомена BDNF в зрелых моторных синапсах. | ||
2 | 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Механизмы регуляции квантовой секреции медиатора под действием пронейротрофина мозга (proBDNF) и продомена нейротрофина мозга (продомена BDNF) в моторных синапсах млекопитающих |
Результаты этапа: Данный проект направлен на исследование участия, роли и механизмов регуляции нервно-мышечной синаптической передачи предшественником нейротрофина мозга (BDNF) - proBDNF и образующимся за счет его протеолиза продоменом BDNF. proBDNF и продомен BDNF проявляют собственные сигнальные действия в моторных синапсах, преимущественно отличные от таковых зрелого BDNF, и зависящие от функционального статуса моторных синапсов. Объектами изучения служили изолированные нервно-мышечные препараты мышей со зрелыми синапсами (диафрагма) и функционально отличающимися от них новообразованными синапсами в ходе реиннервации m. extensor digitorum longus после пережатия нерва. В 2023 году мы выявили присутствие и необходимую роль сортилина как необходимого участника функциональных комплексов с рецепторами p75 (в зрелых синапсах) или TrkB (в новообразованных моторных синапсах), запускающих при их активации proBDNF или продоменом BDNF характерные изменения параметров, характеризующих спонтанную и вызванную (в коротком ритмическом залпе) квантовую секрецию ацетилхолина. В зрелых синапсах сортилин вместе p75 совместно обеспечивает «правильную» рецепцию продомена BDNF и запуск сигнального пути с участием RhoА и Rho-киназы, направленного на активацию калиевых каналов GIRK в зрелых моторных синапсах. В новообразованных синапсах рецепция и сигналинг proBDNF и продомена BDNF оказались еще комплекснее и сложнее. В этих синапсах для проявления синаптических эффектов пронейротрофина и его продомена требуется совместное участие рецепторов TrkB, p75 и сортилина. В случае proBDNF такой трехкомпонентный рецепторный комплекс обеспечивает сигналинг, стабилизирующий вызванную секрецию и снижающий частоту спонтанной секреции ацетилхолина (за счет активации GIRK). Все три компонента рецепторного комплекса оказались необходимы для запуска сигнального пути (с участием митоген-активируемых протеинкиназ), обеспечивающего разнонаправленные сочетанные влияния на параметры квантовой секреции ацетилхолина продомена BDNF –увеличение размера квантов и уменьшение квантового состава ПКП (в совокупности эти влияния стабилизируют нервно-мышечную передачу при реиннервации мышцы). Ключевая роль калиевых каналов GIRK в реализации тормозного действия proBDNF в новообразованных синапсах и продомена BDNF в зрелых синапсах потребовала исследования механизма вовлечения этих каналов в регуляцию квантовой секреции ацетилхолина.Определяли конкретный тип G-белок-сцепленных рецепторов, обеспечивающих возможность активации GIRK. В зрелых моторных синапсах мы впервые показали, что M2- и P2Y13-рецепторы не участвуют в активации GIRK при действии продомена BDNF, но их эндогенная активация тормозит вызванную мультиквантовую секрецию ацетилхолина за счет угнетения активности пресинаптических кальциевых каналов L-типа. Приоритетным результатом наших исследований является то, что из трех пресинаптических метаботропных рецепторов (M2, P2Y13 и A1) исключительно А1-рецепторы оказались функционально сопряжены не только с торможением кальциевых каналов L-типа, но и с GIRK-опосредованным торможением квантовой секреции ацетилхолина под действием продомена BDNF. Результаты наших предыдущих исследований и данные, полученные на втором году выполнения проекта выявили дуальную регуляцию секреции ацетилхолина со стороны пресинаптических аденозиновых А1-рецепторов в зрелых моторных синапсах. Эти метаботропные рецепторы выступают, с одной стороны как мощный негативный регулятор активности L-типа кальциевых каналов, тормозя активность протеинкиназы А, вероятнее всего благодаря ингибирующему влиянию Giα-субъединицы на функционирование аденилатциклазы, и одновременно могут продуцировать образование Giβγ-субъединиц, необходимых для активации GIRK и реализации тормозных эффектов продомена BDNF в случае активации им пресинаптического рецепторного комплекса р75/сортилин. При этом для А1-зависимого GIRK-опосредованного тормозного действия продомена BDNF на квантовую секрецию ацетилхолина в моторных синапсах необходимо функционирование каналообразующих белков паннексинов 1 в качестве источника синаптических пуринов (АТФ/аденозина) в моторных синапсах. Устранение «паннексинового источника» пуринов в моторных синапсах препятствует активации А1-рецепторов и развитию тормозных влияний продомена BDNF. Интересно, что в новообразованных синапсах, где к активации GIRK приводит действие не продомена, а proBDNF, функционирование этих калиевых каналов оказалось не сопряжено с эндогенной активацией M2-, P2Y13- илиA1-рецепторов. Возрастание размера квантов АХ в новообразованных синапсах как под действием зрелого нейротрофина, так и его продомена обеспечивается запуском одного и того же сигнального пути с участием митоген-активируемых протеинкиназ, аналогично тому, как это происходит в зрелых моторных синапсах. Вероятнее всего, такая синергичность действия нейротрофина мозга и его продомена обеспечивается их взаимодействием с TrkB-рецепторами (в составе рецепторного комплекса с p75 и сортилином, что мы показали на втором году выполнения проекта), запускающими сигнальный каскад с участием митоген-активируемых протеинкиназ. Новым и неожиданным фактом является выявленная связь MEK1/2-Erk-сигнального каскада не только с увеличением размера квантов под действием продомена BDNF в новообразованных моторных синапсах, но и с уменьшением в них квантового состава ПКП. В зрелых моторных синапсах под действием продомена BDNF в торможение квантовой секреции ацетилхолина вовлекаются, помимо GIRK,кальций-активируемые калиевыеSK-каналы. Мы впервые показали, что запуск продоменом сигнального пути с участием Rho-киназы обеспечивает необходимое и достаточное для активации SK-каналов возрастание концентрации внутритерминального кальция, причем за счет активности рианодин-чувствительных кальциевых депо. Блокирование рианодиновых рецепторов кальциевых депо полностью «восстанавливало» индуцируемое продоменом BDNF снижение частоты МПКП и квантового состава ПКП (оба эти параметра секреции ацетилхолина имеют пресинаптическую природу) при заблокированных SK-каналах. Вовлечение SK-каналов в реализацию негативного влияния продомена BDNFна квантовую секрецию АХ обеспечивается возможным ROCK-опосредованным торможением активности кальциевой АТФазы кальциевых депо, как это показано надругих экспериментальных объектах. Такое индуцированное продоменом действие ROCK способно увеличивать внутриклеточную концентрацию ионов кальция за счет его выхода из депо через рианодиновые рецепторы и активировать SK-каналы, «демпфируя» таким своеобразным образом предпосылки к кальций-зависимому увеличению частоты МПКП и квантового состава ПКП. В совокупности с отсутствием изменений временного хода постсинаптических потенциалов под действием продомена BDNF в зрелых синапсах диафрагмы мыши, постоянство входного сопротивления мышечных волокон по сравнению с контролем позволяют предполагать, что продомен-индуцированное «уменьшение размера кванта» может иметь в основе какие-либо пресинаптические механизмы. Ингибирование PTEN, способное сдвигать фосфолипидный метаболизм в сторону снижения содержания фосфоинозитол(4,5)бисфосфата (PIP2), необходимого для активации GIRK, полностью предотвращает торможение квантовой секреции АХ, вызываемое продоменом BDNF в зрелых моторных синапсах диафрагмы мыши. Учитывая дуальный характер активации GIRK, мы предполагаем, что их вовлечение в регуляцию квантовой секреции АХ возникает при пространственно-временном «совпадении» эндогенной активации аденозиновых А1-рецепторов (обеспечивающих GIRK βγ-субъединицами Gi-белков) и возрастания около GIRK содержания PIP2 за счет активации PTEN в результате запуска продоменом BDNF сигнального каскада с участием Rho-киназы. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".