ИСТИНА

В настоящее время огромное внимание уделяется изучению различных ферментов, перспективных для использования в промышленных биотехнологиях. Лакказы базидиальных грибов представляют собой практически идеальный биокатализатор для «зеленой» химии из-за своей широкой субстратной специфичности и стабильности. Благодаря постоянному интересу к лакказам, данные ферменты интенсивно изучаются. Однако, несмотря на то, что многочисленные исследования направлены на поиск, выделение, характеристику и изучение новых лакказ, до сих пор не удается четко выявить взаимосвязь между белковой структурой ферментов и их свойствами. Несмотря на схожую молекулярную организацию, лакказы базидиальных грибов, относящихся к различным таксономическим группам и занимающих в природе разные экологические ниши, отличаются по своим свойствам и функциям, таким как окислительно-восстановительный потенциал медного центра Т1, субстратная специфичность и стабильность. Для успешного создания эффективного биокатализатора, прежде всего, необходима информация о том, что на структурном уровне обеспечивает эффективность катализа и стабильность работы фермента в экстремальных условиях (высокие температуры, кислые или щелочные значения рН, высокие концентрации солей и детергентов, органические растворители). В данном проекте планируется провести сравнительное исследование двух лакказ базидиальных грибов Trametes hirsuta и Coriolopsis caperata, для которых ранее нами были получены их пространственные структуры, анализ которых выявил значительные отличия в области субстрат-связывающих карманов, а также в количестве сайтов гликозилирования и их локализации на поверхности белка. В рамках данного проекта будет проведен сравнительный анализ взаимосвязи субстратной специфичности грибных высоко редокс-потенциальных лакказ со строением их субстрат-связывающих карманов и изучена роль гликозилирования белковой глобулы лакказ в стабильности и функционировании данного фермента. Для этого будет изучена ферментативная кинетика окисления различных модельных и природных фенольных субстратов, отличающихся количеством и природой заместителей в ароматическом кольце, геометрическими размерами и гидрофильными свойствами. Будет изучена протеолитическая стабильность и термостабильность нативных и дегликозилированных препаратов лакказ. Опираясь на полученные экспериментальные данные и in silico анализ пространственных структур исследуемых лакказ, будет возможно выявить особенности их строения, которые на структурном уровне определяют их субстратную специфичность и стабильность.

В работе впервые планируется провести сравнительный анализ взаимосвязи субстратной специфичности грибных высоко редокс-потенциальных лакказ со строением субстрат-связывающих карманов данных ферментов. Впервые планируется комплексно изучить роль гликозилирования белковой глобулы лакказы в стабильности и функционировании данного фермента. В работе будет проведено сравнительное изучение субстратной специфичности лакказ базидиальных грибов родов Trametes sp. и Coriolopsis sp. на примере T.hirsuta и C.caperata соответственно и будут получены следующие результаты: – будет изучена ферментативная кинетика окисления различных модельных (гваяцильного и сирингильного ряда: гваякол и феруловая кислота; 2,6-диметоксифенол и синаповая кислота) и природных фенольных субстратов (дилигнаны: пинорезинол, секоизоларицирезинол – СЕКО, два конформационных изомера СЕКО дигликозида), отличающихся количеством и природой заместителей в ароматическом кольце, геометрическими размерами и гидрофильными свойствами, и определены кинетические константы (Km, Vm, kcat); – будет изучено влияния рН и температуры среды на скорость протекания ферментативных реакций окисления различных модельных и природных фенольных субстратов лакказами T.hirsuta и C.caperata и определены значения pK и энергии активации; – будет проведен in silico сравнительный анализ аминокислотного состава, геометрии, размера и гидрофобности субстрат-связывающих карманов двух лакказ T.hirsuta и C.caperata; – будет установлена структурно-функциональная взаимосвязь между субстратной специфичностью и строением субстрат-связывающего кармана лакказ базидиальных грибов родов Trametes sp. и Coriolopsis sp. В работе впервые будет проведено комплексное сравнительное изучение физико-химических свойств нативных (гликозилированных) и дегликозилированных лакказ из базидиальных грибов T.hirsuta и C.caperata с использованием методов фотометрии, флуоресценции, спектроскопии кругового дихроизма, дифференциальной сканирующей калориметрии. В результате выполнения данного проекта будут получены следующие результаты: – будут получены и охарактеризованы дегликозилированные формы лакказ из T.hirsuta и C.caperata; – будет проведена оценка ферментативной активности дегликозилированных форм лакказ грибов T.hirsuta и C.caperata, степени их дегликозилирования, изменения вторичной структуры и содержания ионов меди в активном центре ферментов; – будут изучены протеолитическая стабильность и термостабильность нативных и дегликозилированных препаратов лакказ грибов T.hirsuta и C.caperata; – будут изучены гидрофильные/гидрофобные свойства нативных и дегликозилированных препаратов лакказ T.hirsuta и C.caperata с использованием гидрофобного зонда Bis-ANS; – будет проведен in silico анализ профилей гидрофильности/гидрофобности аминокислотных последовательностей лакказ базидиальных грибов T.hirsuta (laccase A, GenBank: AIZ72721.1) и C.caperata (laccase 2, GenBank: AGE13770.1) с использованием нескольких алгоритмов с помощью программ веб-сервиса ProtScale. – будет проведен in silico анализ пространственных структур лакказ базидиальных грибов T.hirsuta (код PDB: 3FPX) и C.caperata (код PDB: 4JHV) (расчет поверхностного заряда и гидрофильности/гидрофобности белковой поверхности); – будут получены новые данные о влиянии количества и локализации сайтов связывания углеводов в белковой глобуле лакказы, ее гидрофильными/гидрофобными свойствами на стабильность фермента. Таким образом, будет установлена структурно-функциональная взаимосвязь между стабильностью лакказ базидиальных грибов родов Trametes sp. и Coriolopsis sp. к воздействию протеолитических ферментов и высоких температур и гликозилированием белковой глобулы ферментов. Результаты работ обеспечат получение новых фундаментальных знаний в области биохимии, ферментативного катализа и молекулярной биологии, в частности, в области исследования структур и функциональных свойств ферментов, перспективных для использования в биотехнологии.

В лаборатории молекулярных основ биотрансформаций проводятся исследования физиологии и биохимии базидиомицетов и роли их ферментов в процессах биотрансформаций. Ранее были отобраны базидиомицеты с высоким лигнолитическим потенциалом, для которых были выделены и частично охарактеризованы мажорные изоформы лакказ, в том числе, лакказы из T.hirsuta [Koroljova?Skorobogat'ko et al., 1998; Polyakov et al., 2008] и C.caperata [Fedorova et al., 2013]. Определены нуклеотидные последовательности генов, кодирующих мажорные формы лакказ T.hirsuta (LacA, GenBank: AIZ72721.1) и C.caperata (Lac2, GenBank: AGE13770.1). Определены основные физико-химические характеристики данных лакказ. Методом потенциометрического титрования был определен окислительно-восстановительный потенциал, равный 780 мВ для обеих лакказ. Анализ кинетических данных показал, что лакказа C.caperata имеет более высокие константы Михаэлиса для фенольных субстратов (2,6-диметоксифенол, пирокатехол, гваякол) и более низкую – для нефенольного субстрата (ABTS), нежели лакказа T.hirsuta. Термостабильность данных лакказ также значительно отличалась: время полуинактивации при 60 град. С для лакказы C.caperata составило 200 мин, в то время как для лакказы T.hirsuta – всего 20 мин. У коллектива имеется большой опыт в изучении структур ферментов. Были получены структуры лакказ T.hirsuta [Polyakov et al., 2008; PDB code: 3FPX], C.caperata [Glazunova et al., 2015; PDB code: 4JHU, 4JHV]. Предварительный анализ полученных 3D структур лакказ T.hirsuta и C.caperata выявил отличия в гликозилировании белковых глобул (по количеству и локализация сайтов гликозилирования), а также в строении субстрат-связывающих карманов ферментов. Полученные данные определили постановку задач данного проекта.