ИСТИНА

Проект направлен на исследование роли рибосомных генов генома человека в этиологии и патогенезе шизофрении.

The project is aimed at studying the role of ribosomal genes in the human genome in the etiology and pathogenesis of schizophrenia. Multicopy ribosomal repetition (genes 18S, 5.8S, 28S rRNA) determines the biogenesis of ribosomes (and hence the level of protein biosynthesis in the body) and is one of the characteristics of human adaptive capacity. The burden of schizophrenic disorders, according to official estimates, is up to 0.5% of the country's GDP [Gurovich IE, Lyubov EB, 2002]. The prevalence of diseases in the population remains relatively stable throughout all periods of its study, the rates of detection of schizophrenia, schizophrenic spectrum disorders and schizophreniform disorders throughout life vary slightly in the regions and are 1.45%, 0.5% and 1.6%, respectively [Goldner EM et al., 2002]. In the Russian Federation, according to statistical data, among all patients observed for the pathology of the psyche, the proportion of patients with schizophrenia is 16%, and in psychiatric hospitals this figure reaches 40-50%. The incidence in Russia is 6.5 per 100 thousand of the population, annually 9.5 thousand people are registered in state institutions with the first diagnosis of diseases of the schizophrenic spectrum for the first time in their life. The number of patients covered by psychiatric care is 467.1 thousand, or 319.3 people per 100 thousand people, disability of schizophrenic patients reaches 60%, and unstable labor adaptation is observed in 90% of patients [Gurovich IE, Lyubov E. B ., 2002; Federal State Statistics Service (rosstat). 2015]. In recent decades, the world scientific literature regularly displays data on the role of many genes in the etiology and pathogenesis of schizophrenia. However, later these data are, as a rule, revised and refuted. Almost all authors consider only unique or small-copy genes. The authors of the application paid attention for the first time to multicopy genes encoding rRNA ribosomes (rDNA) in patients with schizophrenia [Veiko et al., 2003; Veiko, 2001]. The central event in the life of any cell is protein synthesis by ribosomes. Any mutation leading, in particular, to the development of schizophrenia, manifests itself in the body against the background of a given level of protein synthesis. Transcription of RNA rRNA by polymerase I is a key moment in the biogenesis of ribosomes. Ribosomal genes form a special structure in the cell - the nucleolus, where the biogenesis of ribosomes occurs. In addition to the synthesis of rRNA, the nucleolus also performs a number of key functions in the vital functions of cells: it ensures chromatin stability in general, regulates aging and response to stress, and serves as a temporary storage for the many proteins necessary for the regulation of many signaling cascades. A number of authors believe that the nucleolus is a "conductor" that controls the expression of the genome as a whole. The genomes of schizophrenic patients contain an increased number of copies of rDNA compared to control [Veiko et al., 2003; Veiko, 2001]. There are reasons to believe that a large number of copies of rDNA in the genome can lead to accelerated aging, a change in the response to stress, a change in the level of apoptosis of cells, and other negative consequences that lead to disruption of the functioning of the genome of cells in schizophrenic patients. Since oxidative stress is observed in schizophrenia, and rDNA contains many of the most easily oxidizable sequences of the genome (Gn), a high level of rDNA damage is to be expected, which may be accompanied by an additional disruption of the nucleolus functions. In recent years, it has been shown that the amount of rDNA in the human genome is negatively correlated with the amount of mitochondrial DNA (mtDNA) [Gibbon et al., 2014]. Since a large number of transcribed copies of rDNA are associated with accelerated aging, negative correlation with telomere length of chromosomes (the number of telomere repeats) should be expected. The instability of the genome, due to the high level of rDNA transcription, can be characterized by the number of another highly replicative repeat - satellite III (region 1q12). It is interesting to note that all 4 repeats (rDNA, mtDNA, telomeric and satellite III (region 1q12)) are contained in the human genome in approximately equal amounts. Analyzing together the number of these repeats in patients with schizophrenia and healthy donors, valuable information on the level of ribosome biogenesis, on cell energy supply, on aging (the level of oxidative stress), and on the stability of the genome can be obtained. The project plans to receive answers to the main questions: • What clinical forms, syndromes and symptoms of schizophrenia are associated with an increased number of copies of rDNA in the genome and an increased level of rDNA damage? • How does the number of copies of rDNA in the genomes of patients affect the effectiveness of therapy (onset of remission) and the severity of side effects from drugs? • How is the number of rDNA copies associated with the level of apoptosis in the body and in the cultured cells of the patients? • How the number of rDNA copies affects rRNA level and transcription rate of ribosomal RNA genes

Впервые будет исследована структурно-функциональная организация рибосомных генов больных шизофренией в сравнении с рибосомными генами психически здоровых людей: определены вариабельность общего количества копий рДНК в геномах, уровни метилирования различных участков рДНК, повреждения рДНК, экспрессии генов рРНК (количество рРНК). Свойства комплекса рибосомных генов будут сопоставлены с клиническими формами шизофрении, с эффективностью ответа организма больного на терапию. Будет установлено, каким образом свойства комплекса рибосомных генов влияют на такие общие свойства клеток, как количество рибосом, количество митохондрий, уровень окислительного стресса и стабильность генома, уровень апоптоза. Для характеристики общих свойств генома клеток больных шизофренией будет исследована вариабельность трех других повторов генома – мтДНК (маркер количества митохондрий), теломерный повтор (маркер уровня окислительного стресса и старения) и сателлит III(1q12) (оценка нестабильности генома). На первичных клетках и на культурах клеток больных и здоровых людей, на нейронах мозга крысы будет исследовано действие ряда применяемых в отечественной психиатрии антипсихотических средств на свойства комплекса рибосомных генов и на вариабельность трех других перечисленных повторов генома. Будет исследована возможность снижения активности транскрипции рибосомных генов в клетках больных с применением новых отечественных соединений, которые вызывают избирательное метилирование рибосомной ДНК.

Основной результат: геномы больных шизофренией содержат аномально высокие количества копий рДНК. Мы проанализировали зависимости содержания в геноме лейкоцитов человека трех повторов (мтДНК, теломерного и сателлита III) от количества копий рДНК. 1). Большое число копий рДНК коррелирует с высоким уровнем биогенеза рибосом и с несбалансированным высоким уровнем синтеза белка. Синтез белка – энергоемкий процесс, потребляющий до 80% всех запасов АТФ клетки. На митохондрии клетки ложится очень большая нагрузка. Чтобы обеспечить клетку нужной энергией, необходимо синтезировать больше митохондрий. Однако в клетках леченых больных шизофренией уровень мтДНК сравним с уровнем в контроле. В клетках нелеченых больных уровень мтДНК выше, но часть мтДНК повреждена. Параметр, показывающий количество мтДНК на одну копии рДНК в клетке, для выборки больных шизофренией достоверно ниже, чем для контроля. Клеткам больных шизофренией, по-видимому, не хватает энергии вследствие несбалансированного биогенеза рибосом. Одно из направлений восстановления баланса – это снижение количества активно транскрибируемых копий рДНК, например, за счет дополнительного метилирования копий рДНК. В рамках проекта мы проверили гипотезу о наличии отрицательной корреляции между копийностью рДНК и мтДНК, сформулированную ранее [Gibbons et al., 2014]. Для всех изученных выборок мы обнаружили слабую положительную корреляцию между числом копий мтДНК и рДНК. Такая корреляция нам кажется более реальной: высокий уровень биогенеза рибосом требует больше энергии, т.е. больше митохондрий. 2) Большое количество копий рДНК в геномах больных шизофренией коррелирует с низким содержанием повтора сателлита III (f-SatIII). Показатель, равный отношению f-SatIII/число копий рДНК, для больных намного ниже, чем для здоровых людей. Вместе с тем в клетках больных мы обнаружили более активную транскрипции сателлитного повтора. Эта транскрипция является следствием хронического стресса, который испытывает организм больного. 3) Признаком того, что большое количество копий рДНК в геноме человека ускоряет старение, являются данные о соотношении количества теломерного повтора и рДНК. Мы подтвердили данные других авторов о снижении количества теломерного повтора в клетках больных шизофренией. Максимальный уровень теломерного повтора мы фиксировали в образцах ДНК больных с низким количеством копий рДНК (ниже среднего). Также была обнаружена отрицательная корреляция между количеством копий рДНК и содержанием теломерного повтора в контрольной выборке. Наиболее информативным для характеристики про- и антиапоптотических процессов, происходящих в клетках, является соотношение уровней транскрипционной активности генов BCL2/ВАХ. Для больных шизофренией в остром периоде уровень коэффициента BCL2/ВАХ – на (10-20) % ниже контрольных значений, что свидетельствует о преобладании процесса апоптоза в клетках крови, и, вероятно, является реакцией на высокий уровень повреждений ДНК клеток крови. После проведенного успешного курса терапии больных шизофренией мы наблюдали приближение показателя BCL2/ВАХ к контрольным значениям. Достоверное повышение коэффициента BCL2/ВАХ ~ в 2 раза наблюдается у больных шизофренией с длительностью заболевания более 5 лет. При этом происходит увеличение числа клеток с поврежденной ДНК. Полученные результаты по исследованию корреляции наличия двунитевых разрывов, уровня апоптоза и уровня транскрипционной активности проапоптотического гена подтверждают наши данные о более активном процессе апоптоза у пациентов с острым психозом и о сниженном уровне апоптоза у больных шизофренией с длительностью заболевания более 5 лет. При выполнении проекта мы впервые обнаружили нестабильность содержания повтора f-SatIII (1q12) в клетках одной и той же клеточной популяции. В этом отношении повтор f-SatIII похож на теломерный повтор, размер которого варьирует в зависимости от возраста клеточной популяции и наличия в популяции окислительного стресса. Одна и та же клеточная популяция значительно гетерогенна по содержанию сателлитного повтора в клетках. Мы исследовали механизм, обуславливающий вариацию числа копий тандемного повтора f-SatIII в клетках больных шизофренией, поскольку понимание фундаментальных основ организации и изменения числа тандемных повторов может способствовать оптимизации подходов к лечению больных шизофренией. Мы заметили закономерность: в центре ядра облученных или стимулированных лимфоцитов намного чаще встречаются метки с малой площадью, чем на периферии ядра. Аналогичный ответ мы наблюдали для ядер лимфоцитов больных шизофренией: к центру ядра преимущественно перемещаются локусы 1q12 с малым размером. В серии экспериментов мы подтвердили, что объемные локусы 1q12 не способны к перемещению в пространстве ядра в ответ на различные стимулы (окислительный стресс или стимуляция пролиферации) и остаются на периферии ядра. Проведенные эксперименты на мононуклеарах крови и культивируемых стволовых клетках подтвердили, что в условиях эндогенного (приступ шизофрении) или экзогенного (действие радиации или пероксида водорода) индуктора окислительного стресса два объемных тандемных повтора (рибосомный и сателлитный) двигаются навстречу и локализуются в области сферического кольца радиусом от 0,55 до 0,65 (радиус ядра принят за единицу). Такие изменения в локализации двух повторов отражают изменения в пространственной структуре хроматина, которые, по-видимому, необходимы для изменения профиля экспрессии всего генома для нормального ответа на окислительный стресс. Клетки с низким количеством повтора (малый размер домена 1q12) способны к пролиферации и к развитию адаптивного ответа на стресс (повышает устойчивость клеток к хроническому стрессу). Оба процесса требуют перемещения 1q12 в ядре и его сближения с ядрышком (рДНК). В некоторых клетках происходит переход гетерохроматина сателлита III в эухроматин и активируется транскрипция сателлита. Этот процесс приводит к увеличению содержания f-SatIII в ДНК клетки, и эти клетки пополняют фракцию клеток с большим размером повтора f-SatIII. Клетки с большим содержанием f-SatIII накапливаются в популяции при естественном и репликативном старении и в условиях окислительного стресса. При более интенсивном воздействии эти клетки гибнут, так как не способны к адаптивному ответу. Выделенные из крови лимфоциты больных шизофренией имеют признаки активации, характерные для контрольных лимфоцитов, которые облучили малыми дозами рентгеновского излучения. В ядрах наблюдали транслокацию доменов 1q12 малого размера в центральные области ядра, при этом ядрышки занимали большую площадь и сближались с областью 1q12. Можно предположить, что в организме больных окислительный стресс хронически стимулирует адаптивный ответ, направленный на активацию репарационных, антиокислительных и антиапоптотических систем. По-видимому, в организме больных процесс селекции клеток крови по содержанию повтора f-SatIII значительно ускорен по сравнению с контролем. Дополнительным фактором, направленным на отбор клеток только с низким количеством f-SatIII, является большой размер ядрышка, которое содержит больше рДНК, чем ядрышко контрольных клеток. Известно, что рибосомный повтор в составе ядрышка стабилизирует гетерохроматиновые участки в ядре. Большое содержание рДНК в геноме сдвигает баланс гетерохроматин-эухроматин в сторону гетерохроматина. Было также показано, что изменение содержания рДНК в геноме приводит к значительным конформационным перестройкам в ядре, что сопровождается изменением профиля экспрессии многих генов, которые пространственно расположены на значительном расстоянии от ядрышка. Таким образом, низкое содержание f-SatIII в ДНК лейкоцитов крови больных шизофренией, которое мы впервые обнаружили при выполнении проекта, можно объяснить тремя причинами: (1) Большие размеры кластеров рДНК стабилизируют гетерохроматин 1q12, снижая интенсивность процесса транскрипции сателлита, который способствует увеличению количества f-SatIII. (2) Хронический окислительный стресс индуцирует адаптивный ответ только в клетках с низким содержанием f-SatIII. (3) Клетки с высоким содержанием f-SatIII, в которых адаптивный ответ блокирован, менее устойчивы к повреждающему воздействию и гибнут. Чтобы подтвердить предложенный нами механизм, мы провели дополнительные исследования и сравнили уровни маркеров окислительного стресса в выделенных лимфоцитах больных шизофренией с содержанием двух тандемных повторов (рибосомного и сателлитного f-SatIII). Проведенные исследования на выборке больных шизофренией и студентов при экзаменационном стрессе позволили предположить, что в самом начале патологического процесса в клетках крови больных шизофренией происходили те же изменения, что и у студентов при стрессе – стресс индуцировал транскрипцию сателлита III, что привело к увеличению числа клеток крови с большим содержанием повтора. В организме больных шизофренией к моменту госпитализации стресс принимает хронический характер и все клетки с большим содержанием повтора f-SatIII элиминируются из кровотока. Для исследования влияния антипсихотиков и новых синтезированных соединений на копийность высокоповторяющихся последовательностей генома в культивируемых фибробластах кожи больных шизофренией и здорового контроля, были выбраны соединения, которые применялись для купирования психоза и стабилизации психического состояния у больных шизофренией: галоперидол; рисперидон; трифтазин; вальпроевая кислота; оланзапин, а также два соединения, влияющие на уровень метилирования рДНК - димерные бис-бензимидазолы (DBP2 и DBP3); и три соединения, которые обладают способностью связывать активные формы кислорода на фоне низкой токсичности – 2 производных фуллерена С-70 и CeO2, которое существует в водных растворах в форме наночастиц. Все соединения были исследованы на токсичность в МТТ-тесте и выбрана их нетоксичная концентрация. Мы не обнаружили достоверной разницы между контрольными клетками и клетками, обработанными антипсихотиками или исследуемыми соединениями, по содержанию копий рибосомного повтора. Число копий рДНК не зависело от времени культивирования и присутствия в растворе антипсихотиков или соединений. Таким образом, мы еще раз подтвердили стабильность содержания рДНК в геноме человека. В отличие от рДНК, содержание сателлитного повтора f-SatIII в ДНК культивируемых клеток нестабильно. При длительном культивировании (4 суток) в присутствии антипсихотиков или соединений содержание повтора значительно изменяется. Штаммы с исходно низкими уровнями повтора (ниже 15 пг/нг ДНК) при культивировании с антипсихотиками повышают содержание повтора. Штаммы с высокими уровнями повтора, напротив, снижают содержание повтора. Изменения пропорциональны исходному количеству повтора f-SatIII в штамме. Относительно высокое число копий рибосомного повтора в геноме штаммов фибробластов больных шизофренией коррелирует с относительно низким содержанием f-SatIII и более высоким уровнем изменения содержания этого повтора в присутствии антипсихотиков или исследуемых соединений. Действие антипсихотиков или исследуемых соединений на транскрипционную активность генов рДНК, сателлита III, а также генов BAX, BCL2 и Р53 зависит от природы штамма и не имеет универсального характера. Однако, через 24 часа после добавления к клеткам антипсихотиков или исследуемых соединений мы фиксировали положительную высоко достоверную корреляцию между двумя транскриптами сателлитной ДНК (транскриптом РНК SATIII(1) и транскриптом РНК SATIII(9)). По-видимому, имеется общий механизм, который инициирует транскрипцию некодирующих РНК с сателлита III, локализованного в прицентромерном участке на первой и на девятой хромосомах. В экспериментах на нейронах показали, что вальпроевая кислота не влияет на общее количество копий рДНК и уровень повреждения рДНК, но повышает количество рРНК и 45S рРНК, а также РНК генов Bdnf и Ngf, в присутствии вальпроевой кислоты значительно возрастало число отростков нейронов и контактов между ними. Показали с использованием флуоресцентной микроскопии, что ядрышки фибробластов больных шизофренией содержат повышенный уровень 5- метил-дезоксицитозина, что подтверждает универсальный характер эпигенетической регуляции в геноме разных клеток человека. Эксперименты, проведенные на клетках разного типа, подтверждают, что окислительный стресс при шизофрении носит системный характер. По-видимому, в мозге больного могут протекать те же процессы, что и в клетках крови. Мы обнаружили значительную вариабельность в содержании повтора f-SatIII в ДНК клеток 8-ми различных участков мозга одного умершего больного шизофренией. Содержание f-SatIII варьировало от 5 пг/нг (left hemisphere – postcentral gyrus) до 32 пг/нг ДНК (striatum – caudate nucleus) на фоне стабильного содержания рибосомного повтора. Этот факт может указывать на различный уровень окислительного стресса в различных участках мозга при жизни больного SZ. Возможно, низкое содержание f-SatIII в ДНК в сочетании с низким уровнем окисления ДНК свидетельствует об отсутствии стресса в популяции клеток. Это состояние характерно для клеток молодого организма в отсутствие стресса. Популяция клеток с высоким содержанием f-SatIII в ДНК, по-видимому, испытывает умеренный стресс, который индуцирует транскрипцию ДНК SATIII и увеличение числа копий повтора f-SatIII в субпопуляции клеток. При этом стресс недостаточно интенсивный, чтобы индуцировать гибель клеток с большим размером гетерохроматина 1q12. Накопление таких клеток в популяции может нарушать функционирование ткани мозга, поскольку клетки с большими блоками гетерохроматина не могут изменять пространственную конфигурацию хроматина в ответ на различные стимулы. Низкое содержание f-SatIII в ДНК в сочетании с высоким уровнем окисления ДНК указывает на высокий уровень повреждения ДНК и на высокий уровень гибели клеток данной популяции. Участки мозга с такими свойствами клеток, по-видимому, потеряли часть клеток и функционируют неправильно. Таким образом, в ходе выполнения проекта мы показали, что окислительный стресс является наиболее вероятной причиной низкого содержания сателлитного повтора в составе ДНК клеток крови. Нам представляется актуальным дальнейшее исследование вариации числа копий тандемных повторов генома человека в клетках больных SZ. Например, более подробный анализ содержания четырех маркеров – рДНК (стабильный признак) и f-SatIII, теломерный повтор, уровень 8-oxodG (нестабильные признаки) в образцах ДНК, выделенной из множества различных участков мозга психически здоровых и больных людей, может дать ценную информацию об уровне окислительного стресса и о нарушении функционирования различных участков мозга при шизофрении, что позволит еще более приблизиться к пониманию биохимических причин развития шизофрении. Полученные в ходе выполнения проекта результаты соответствуют поставленным задачам, подтверждают актуальность темы проекта и целесообразность проведения дальнейших исследований. На протяжении трех лет выполнения проекта его результаты широко освещались в средствах массовых информации. В 2018 году на литературно-художественном новостном портале «Византийский ковчег» вышло интервью с Еленой Малиновской под названием «Ученые тоже люди…», где рассказывалось об основных результатах выполнения гранта за первый год (http://vizkov.com/articles/life/interview/elena_malinovskaya_uchenye_tozhe_lyudi_/?sphrase_id=10169). В том же году на портале Neuronovosti.Ru было опубликовано интервью с Костюк Г.П. под названием «Нейронауке без клиницистов не разобраться в шизофрении», где говорилось о перспективе тесного сотрудничества врачей-психиатров и ученых в попытках разобраться в патогенезе шизофрении (https://zen.yandex.ru/media/neuronovosti.ru/neironauke-bez-klinicistov-ne-razobratsia-v-shizofrenii-5afb1299c3321b2347a25381). В 2019 году в программе «Вести» на канале «Россия 24» вышел сюжет под названием «Программа Наука: вечная молодость», где рассказывалось о работе лаборатории в изучении рибосомных генов и взаимосвязи их количества в геноме человека с продолжительностью жизни и развитием психических заболеваний (https://www.vesti.ru/videos/show/vid/790953). В 2020 году в интернет-издании «Коммерсантъ наука» вышла статья под названием «Сколько человеку нужно рибосом для долгой жизни», где был подробно описан метод определения количества копий рибосомных генов, а также рассказано о совместной работе членов коллектива с врачами-психиатрами из психиатрической клинической больницы №1 им. Н. А. Алексеева по исследованию роли рибосомных генов в причинах и механизмах развития шизофрении (https://www.kommersant.ru/doc/4215243). Помимо этого в этом году члены коллектива приняли участие в мероприятии «Дни без турникетов» в рамках фестиваля науки Nauka 0+. По этому поводу на портале youtube.com был выложен ролик о посещении участников фестиваля лаборатории и о проведенных лекциях (https://youtu.be/qyXIWzYoGvM).