![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Основная фундаментальная задача проекта – установление взаимосвязи между составом водных полимерных рецептур и антимикробными (биоцидными) свойствами образуемых ими пленочных покрытий. Варьируя химическую природу компонентов и состав рецептуры можно в широких пределах менять физико-механические, структурные и биоцидные свойства полимерных покрытий. Полученные результаты позволят прогнозировать основные свойства рецептур и защитных покрытий и разработать процедуру (технологию) получения рецептур с оптимальными антимикробными свойствами и их нанесения на обрабатываемую поверхность.
The main fundamental task of the project is to establish the relationship between the composition of aqueous polymer formulations and the antimicrobial (biocidal) properties of the polymer film coatings. By varying the chemical nature of the components and the formulation composition, the physicomechanical, structural and biocidal properties of polymer coatings can be controlled within a wide range. The results of the project will allow to predict the main properties of formulations and protective polymer coatings and to develop a procedure (technology) for preparing formulations with optimal antimicrobial properties and their deposition onto the surface to be treated.
В ходе выполнения проекта будет исследовано формирование интерполиэлектролитных комплексов разного состава, в том числе с включенными низкомолекулярными биоцидами и антибиотиками; формирование пленочных покрытий из полимерных рецептур на поверхности гидрофобных и смешанных материалов (тканях, пленках, пластике, металле и др.); структурные характеристики полученных покрытий; физико-механические свойства покрытий; связывание бактерий и модельных объектов – липосом на полимерных покрытиях; токсичность/биологическая активность покрытий по отношению к бактериям (грамположительным и грамотрицательным) и дрожжам.
Исследованы реакции образования поликомплексов между противоположно заряженными макроионами в водных растворах. Варьирование состава поликомплексов позволяет регулировать их заряд, размер и стабильность к диссоциации на исходные компоненты в водно-солевых растворах и определяет способность поликомплексов солюбилизировать низкомолекулярные вещества. Катионные полимеры связываются с анионными бислойными везикулами (липосомами), сформированными из липидов и их смесей с поверхностно-активными веществами и белками. Такое взаимодействие сопровождается существенными структурными перестройками и морфологическими изменениями в везикулярных мембранах. Экспериментально подтвержден новый метод исследования трансмембранной миграции липидов, основанный на измерении электрокинетических характеристик липосом. Изучена обратимость процессов комплексообразования и индуцированных поликатионами структурных перестроек в анионных липидных мембранах. Изучены электрические свойства плоских липидных мембран, в том числе мембран со встроенным ионным каналообразователем грамицидином. Исследована адсорбция полиэлектролитов на поверхности противоположно заряженных коллоидных частиц, силикатных и полимерных микросфер и полимерных микрогелей. Исследованы биоцидные свойства полиэлектролитов с использованием нативных клеток и модельных объектов: липосом, липидных монослоев, плоских липидных бислоев. Одним из важных подходов к созданию новых антимикробных веществ является рациональное комбинирование химиопрепаратов различного механизма действия, в том числе с использованием антисептиков, к которым резистентность практически не развивается. У коллектива авторов имеются эффективные наработки в этом направлении с использованием гексилрезорцина. Опыт исследования микробной физиологии роста, количественного учета вегетативных и покоящихся форм микроорганизмов будет полностью использован для решения задач настоящего проекта.
Настоящий проект направлен на изучение особенностей формирования полимерных покрытий путем нанесения водного раствора полимера с катионными группами на поверхность гидрофобного материала и способности полученных покрытий к связыванию и последующей дезактивации бактериальных клеток. Использование воды в качестве растворителя полимера имеет очевидные преимущества с точки зрения доступности, экологической безопасности и экономической эффективности. Выполнение проекта позволит сделать важный шаг к разработке простой и надежной технологии получения стабильных биоцидных покрытий на гидрофобных (или загрязненных) поверхностях.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 13 мая 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Разработка полимерных рецептур и покрытий на основе интерполиэлектролитных комплексов и стандартных протоколов микробиологических исследований их антимикробной активности |
Результаты этапа: Целью работы было получение тонких пленок из полимеров и интерполиэлектролитных комплексов (ИПЭК) на различных поверхностях и исследование их антимикробной активности. Использовали катионный полидиаллилдиметиламмоний хлорид (ПДАДМАХ) и анионный полиакрилат натрия (ПaNa). Смешивание водных растворов ПДАДМАХ и ПаNa приводило к формированию ИПЭК, стабилизированных множественными ионными связями между ионными группами обоих полимеров. Положительно заряженные частицы ИПЭК были получены при соотношении мольных концентраций анионных и катионных групп [-]/[+] = 0,2 (ИПЭК-0,2) и 0,4 (ИПЭК-0,4). ИПЭК дисперсии демонстрировали агрегативную стабильность по крайне мере в течение двух недель после приготовления. Для формирования покрытий растворы ПДАДМАХ, ИПЭК-0,2 и ИПЭК-0,4 наносили на поверхность стекла, фольги, ткани и пластика и сушили до постоянного веса. Для лучшей визуализации покрытий в растворы добавляли краститель, родамин 6G. На поверхности стекла и фольги были получены равномерно окрашенные бледно-розовые пленочные покрытия. Ткань приобретала равномерный бледно-розовый цвет без видимого формирования пленки на поверхности. На гидрофобном пластике капли не растекались. Измерение краевого угла смачивания водных полимерных рецептур на полистирольной поверхности показало уменьшение его значения в ряду ПДАДМАХ – ИПЭК-0,2 – ИПЭК-0,4, что отражало повышение доли неполярных сегментов в составе макромолекул. Добавление поверхностно-активного вещества Silwet в водные полимерные рецептуры улучшило смачиваемость гидрофобной поверхности. Полное растекание композиций ПДАДМАХ, ИПЭК-0,2 и ИПЭК-0,4 на пластиковой поверхности происходило при концентрации 0,01, 0,006 и 0,003 вес.% Silwet, соответственно. Для оптимальной обработки гидрофильных поверхностей рекомендуемая доза полимерных рецептур составляет 5×10-2 мл/см2, для пропитки хлопчатобумажных тканей 1,7×10-2 мл/см2. Для обработки гидрофобных поверхностей она составляет 5×10-2 мл/см2 при условии использования Silwet. Стабильность покрытий на стекле к промыванию водой оценивали через последовательное нанесение на поверхность би-дистиллированной воды и последующую сушку образца. После 4-5 промываний на стеклах оставалось не более 2% от веса нанесенного полимера. Морфологию покрытий изучали методом сканирующей электронной микроскопией. На поверхности покрытий из ПДАДМАХ присутствовали кристаллы NaCl из буферного раствора. На покрытиях из ИПЭК количество кристаллов было значительно больше; дополнительная соль поступала с малыми противоионами, выделяющимися в раствор при образовании ИПЭК. Двукратное промывание покрытий водой приводило к полному удалению соли. При обработке ткани суспензией ИПЭК-0,4 исходная ячеистая структура полотна сохранилась. ИПЭК адсорбировался на поверхности волокон и формировал тонкое покрытие, которое сглаживало рельеф исходной поверхности. Методом атомно-силовой микроскопии показано, что толщина предельно отмытого покрытия из ПДАДМАХ составляет 17-20 нм; из ИПЭК-0,4 - 8 нм. Покрытие из ИПЭК-0,4 в отличие от покрытия ПДАДМАХ имело пористую структуру со средней глубиной пор вплоть до 8 нм. Антимикробная активность покрытий на поверхности стекла протестирована с помощью стандартной методики, включающей нанесение клеточной аликвоты на покрытие, инкубацию клеток в течение 15 или 30 минут, смывание клеток водой на субстрат (питательную среду) и подсчет выросших колоний. В качестве микроорганизмов использовали грамотрицательные бактерии Pseudomonas aeruginosa и грамположительные бактерии Staphylococcus aureus. Антимикробный эффект покрытий после 15-минутной инкубации снижался при увеличении количества клеток в нанесенной аликвоте. Наиболее чувствительными оказались клетки S. аureus: для 200-клеточной аликвоты доля выживших клеток на катионных покрытиях не превышала 5%. Наиболее активным показало себя покрытие из ИПЭК-0,4; при всех аликвотах доля выживших клеток S. аureus была меньше 2%. Клетки P. aeruginosa показали бóльшую выживаемость. Увеличение времени инкубации с 15 до 30 минут снижало количество выживших клеток в 1,5-10 раз. Изучено взаимодействие ПДАДМАХ и ИПЭК с липосомами, сформированными из нейтрального диолеоилфосфохолина и анионного диолеоилфосфосерина, 8/2. Добавление катионных полимерных рецептур приводило сначала к последовательному уменьшению отрицательного поверхностного заряда липосом вплоть до полной его нейтрализации. Затем поверхность липосом приобретала положительный заряд. Мольная концентрация катионных звеньев ПДАДМАХ, при которой происходила нейтрализация заряда, в ряду ПДАДМАХ, ИПЭК-0,2 и ИПЭК-0,4 составляла 2,8×10-4, 3,3×10-4 и 3,9×10-4 М, соответственно. Помимо линейного анионного ПaNa, для получения водных ИПЭК рецептур и покрытий был использован анионный латекс. Добавление раствора ПДАДМАХ к суспензии латексных частиц приводило к электростатической адсорбции поликатиона на латексных микросферах. Состав комплексов описывали соотношением z = [+]/[-], где первый компонент означал мольную концентрацию катионных звеньев ПДАДМАХ, а второй мольную концентрацию поверхностных анионных групп латексных частиц. При z < 0,5 и z > 1,2 растворы оставались гомогенными благодаря стабилизирующему отрицательному или положительному заряду латексных частиц с адсорбированным полимером. Электронейтральный комплекс образовывался при соотношении z = 0,82; максимальная адсорбция поликатиона достигалась при z = 1,5, при этом в растворе регистрировались положительно заряженные частицы ИПЭК с электрофоретической подвижностью +2 (мкм/с)/(В/см). При z > 1,5 в растворе присутствовали положительно заряженные частицы поликомплекса и свободный поликатион. Добавление 3,6 вес.% ПДАДМАХ к латексу (z = 1,5) приводило к формированию положительно заряженного ИПЭК и при этом практически не сказывалось на механических свойствах полученных пленок. При бóльшем весовом содержании ПДАДМАХ пленка становилась двухкомпонентной: она состояла из катионного ИПЭК и свободного ПДАДМАХ. Увеличение содержания ПДАДМАХ в пленке до 50 вес.% приводило к 20-кратному увеличению модуля эластичности, 2-кратному увеличению прочности и 2-кратному снижению предельной деформации разрушения пленок. Пленочные покрытия из исходного латекса и электронейтрального комплекса ПДАДМАХ/латекс показали высокую устойчивость при обработке водой. Двухкомпонентные покрытия с 7,7 вес.% ПДАДМАХ теряли ~67% поликатиона в ходе 7-кратного повторения процедуры промывки. Полимерные рецептуры на основе положительно заряженных ИПЭК ПДАДМАХ/латекс обладают антимикробными свойствами, которые усиливаются при увеличении содержания свободного поликатиона в покрытии. Покрытия с 7,7 вес.% ПДАДМАХ вызывали 100%-ную гибель грамположительных бактерий в течение 5 минут после нанесения. Все грамотрицательные бактерии Escherichia coli погибали в течение 15 минут, более 90% грамотрицательных бактерий P. aeruginosa погибало через 30 минут после нанесения на пленку. Вымывание избытка поликатиона не влияло на бактерицидную активность покрытий в отношении грамположительных бактерий, но значительно снижало бактерицидную активность в отношении грамотрицательных бактерий. Увеличение на порядок количества нанесенных клеток P. aeruginosa приводило к 10-кратному повышению доли выживших клеток. Для получения полимерных покрытий были также использованы полимеры природного происхождения: катионная целлюлоза и анионный альгинат натрия. Эти полимеры образуют положительно заряженные водорастворимые ИПЭК при мольном соотношении звеньев анионного и катионного полимеров [-]/[+] < 0,8 и отрицательно заряженные водорастворимые ИПЭК при [-]/[+] > 2. Поликомплексы не диссоциируют на исходные компоненты вплоть до 0,2 M NaCl. Образование ИПЭК сопровождается взаимной нейтрализацией зарядов полиэлектролитов, что приводит к уменьшению размеров макромолекулярных клубков и прогрессивному снижению вязкости растворов. | ||
2 | 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Получение биоцидных полимерных рецептур и покрытий на основе интерполиэлектролитных комплексов со встроенным низкомолекулярным биоцидом |
Результаты этапа: Для получения покрытий были использованы нестехиометричные интерполиэлектролитные комплексы (НИПЭК), образованные разноименно заряженными линейными синтетическими полиэлектролитами: анионным гидролизованным полиакрилонитрилом (ГИПАН) – сополимером акриловой кислоты и акриламида и катионным поли-N,N-диаллил-N,N-диметиламмоний хлоридом (ПДАДМАХ). Состав смеси выражали в виде мольного соотношения Z = [+]/[-], где [+] означает концентрацию четвертичных аминогрупп поликатиона, [-] концентрацию карбоксильных групп полианиона. В растворах НИПЭК с Z = 0,2 и 0,4 («анионных» НИПЭК) регистрировали частицы с электрофоретической подвижностью (ЭФП) равной -3,2 и -2,8 (мкм/с)/(В/см), соответственно, и средним гидродинамическим диаметром 195 и 205 нм. Частицы НИПЭК с Z = 2,5 и 5,0 («катионных» НИПЭК) характеризовались значениями ЭФП = 3,6 и 2,4 (мкм/с)/(В/см), соответственно, и средним гидродинамическим диаметром 198 и 300 нм. Для получения покрытий использовали также НИПЭК, образованные противоположно заряженными полисахаридами: анионным альгинатом натрия и катионным кватернизованным этоксилатом гидроксиэтилцеллюлозы. Для связывания низкомолекулярного биоцида, 4-гексилрезорцина (ГР), с частицами НИПЭК его предварительно растворяли в органическом растворителе (ацетоне или этиловом спирте) и смешивали с водными растворами/суспензиями поликомплексов. В результате получали слабо опалесцирующие гомогенные суспензии тройных комплексов НИПЭК-ГР. Гомогенные суспензии тройных комплексов сохраняли стабильность в течение 3-6 месяцев при 5 °С. Полимерные покрытия готовили двумя методами. 1) На стеклянную пластинку или пластиковую пленку Parafilm наносили водные суспензии НИПЭК ГИПАН-ПДАДМАХ с ГР и без него и сушили их до постоянного веса. 2) Пластинку или пленку погружали на 2 минуты в водную суспензию НИПЭК ГИПАН-ПДАДМАХ с ГР и без него. Пластинки/пленки извлекали из раствора и сушили образцы как указано выше. На поверхности стекла были получены однородные пленочные покрытия. При высушивания НИПЭК рецептуры без ГР на поверхности пластика образовывалась неоднородная пленка. Введение ГР в полимерную суспензию обеспечивало сродство полимерной рецептуры к гидрофобной поверхности и ее хорошей адгезии на пластике. Для изучения стабильности покрытий в водном окружении полимерную рецептуру равномерно распределяли на поверхности стекла. Стекла с нанесенными рецептурами сушили до постоянного веса, после чего промывали покрытия дистиллированной водой. После 4-5 промываний на стеклах оставалось не более 2% от веса нанесенной рецептуры ГИПАН-ГР. Использование НИПЭК привело к повышению водостойкости композиций: после 6 промываний на стекле оставалось до 15% от первоначально нанесенной НИПЭК-ГР рецептуры. Нанесение водных растворов катионного НИПЭК альгинат-целлюлоза на чашки Петри из стекла или полистирола приводило к формированию прозрачных гомогенных пленок, которые легко растворялись в воде. Тройной комплекс НИПЭК-ГР формировал на поверхности стекла и полистирола покрытие с равномерным распределением включений белого цвета размером 1-5 мм. После добавления воды покрытие лишь незначительно набухало и оставалось на поверхности. Каждое 2 минутное промывание дистиллированной водой покрытий из тройного комплекса НИПЭК ГИПАН-ПДАДМАХ-ГР на пленке приводило к потере в среднем 2,7 вес.% ГР. Морфологию полимерных покрытий изучали методом сканирующей электронной микроскопии. При 0,1 вес.% содержании ГР покрытия из НИПЭК ГИПАН-ПДАДМАХ-ГР на стекле характеризовались однородной поверхностью. Увеличение содержания ГР до 0,5 вес.% приводило к появлению в полимерной матрице включений округлой формы размером от 40 до 1400 нм. На кривой растяжения исходной пленки Parafilm можно выделить три участка: прямолинейный участок до деформации 1%, появление пика в области деформации 3% и последующее снижение напряжения с выходом на плато и разрывом образца при деформации около 400%. Нанесение покрытия из тройного комплекса НИПЭК ГИПАН-ПДАДМАХ-ГР на поверхность пленки Parafilm не оказывает заметного влияния на ее механические свойства. Взаимодействие НИПЭК с анионными липидными везикулами (липосомами) моделировало взаимодействие поликомплексов с клеточной мембраной. Внутренний объем липосом заполняли раствором 1 М низкомолекулярной соли (NaCl). После добавления к суспензии липосом анионного НИПЭК ГИПАН-ПДАДМАХ и тройного НИПЭК ГИПАН-ПДАДМАХ-ГР в течение часа регистрировали постепенное увеличение проводимости суспензии, что указывало на разрушение липосомальной мембраны. Микробиологические исследования проводили с использованием грамотрицательных бактерий, грамположительных бактерий и дрожжей. Выживаемость микроорганизмов в растворах в присутствии полимерных рецептур оценивали с использованием двух стандартных параметров – минимальной ингибирующей концентрации (МИК) и минимальной бактерицидной концентрации (МБК). Анионные полимерные рецептуры – индивидуальные ГИПАН и альгинат натрия и анионные НИПЭК ГИПАН-ПДАДМАХ оказались нетоксичными для всех исследованных микроорганизмов, в то время как ПДАДМАХ и катионные НИПЭК ГИПАН-ПДАДМАХ проявили антимикробную активность. Катионная целлюлоза не показала токсичности для всех исследованных микроорганизмов. Полимерная рецептура из катионного НИПЭК альгинат-целлюлоза также не проявила антимикробной активности. Тройной катионный НИПЭК альгинат-целлюлоза-ГР подавлял рост всех микроорганизмов. В большинстве случаев значения МИК и МБК тройного комплекса были сравнимы с соответствующим значениями для индивидуального ГР. Антибактериальная активность тройных комплексов катионный НИПЭК ГИПАН-ПДАДМАХ-ГР повышалась при увеличении содержания ГР в рецептуре и доли свободных положительно заряженных звеньев ПДАДМАХ в поликомплексе. Количественная оценка цитотоксичности полимерных покрытий методом подсчета выросших колоний показала, что покрытия из тройного комплекса НИПЭК ГИПАН-ПДАДМАХ-ГР вызывают гибель клеток. Инкубация клеточных суспензий на покрытиях, полученных на поверхности стекла, в течение 45 мин вызывала 99% гибель клеток всех тестовых микроорганизмов. Антибактериальная активность тройных комплексов на основе катионных НИПЭК была выше по сравнению с анионными и возрастала при увеличении количества свободных положительно заряженных звеньев ПДАДМАХ в НИПЭК. Значительная часть микроорганизмов удалялась с катионного полимерного покрытия в течение 3-минутной обработки водой. Увеличение продолжительности обработки водой приводило к снижению числа клеток на поверхности до 20-30% в случае бактерий и 60% для дрожжей. Десорбция клеток всех тестовых микроорганизмов с поверхности покрытия ПДАДМАХ была связана с растворением катионного покрытия при его обработке водой. Это облегчало десорбцию клеток, которые покидали поверхность в виде комплексов с ПДАДМАХ. Жизнеспособность микробных клеток на поверхности оценивали методом их окрашивания с использованием набора флуоресцентных красителей Leave/Dead. Клетки, нанесенные на контрольное стекло без полимерного покрытия, сохраняли способность к делению. Клетки на покрытиях из ПДАДМАХ погибали через 1 ч после нанесения. Эта же методика позволила зафиксировать гибель всех клеток, оставшихся на полимерной покрытии после его промывки водой. Жизнеспособность смытых клеток была проанализирована с помощью традиционной методики – через подсчет количества выросших колоний. Все смытые с ПДАДМАХ покрытия клетки оказались нежизнеспособными. Таким образом, проведенное исследование позволило оценить количество смываемых клеток в ходе стандартной процедуры тестирования выживаемости клеток на биоцидном покрытии и определить жизнеспособность смытых и оставшихся на покрытии клеток. | ||
3 | 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. | Получение биоцидных полимерных рецептур и покрытий на основе интерполиэлектролитных комплексов, включающих биологически активное соединение |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".