ИСТИНА

Сократимые чехлы бактериофагов семейства Myoviridae представляют собой простейшие однокомпонентные двигательные системы, своего рода молекулярные мышцы вирусов, состоящие из белковых молекул одного типа. В процессе инфицирования происходит необратимое сокращение чехла; за счет высвобождающейся при этом энергии жесткий внутренний стержень проникает через клеточную стенку и обеспечивает введение геномной ДНК в клетку хозяина. Все бактериофаги этого семейства имеют общую морфологию частиц, и процесс сокращения чехла у них протекает, скорее всего, по одной и той же схеме, несмотря на существенные различия в длине хвостов и количестве субъединиц белка в чехле. Применение высокоразрешающих современных методов структурной биологии значительно расширило наши представления об архитектуре фагов и некоторых деталях процесса инфицирования, однако молекулярный механизм сокращения чехлов при инфицировании не выяснен, а структура белков, формирующих чехлы фагов, до сих пор не известна. Характерной особенностью чехольных белков является их способность к самосборке в полимерные структуры как in vivo, так и in vitro. При экспрессии в клетках E. coli чехольные белки формируют поличехлы, имеющие нерегулярную длину, что препятствует получению их упорядоченных кристаллов. Одной из главных задач предлагаемого проекта является определение структуры рекомбинантных чехольных белков с помощью рентгеноструктурного анализа. Для этого методами белковой инженерии будут получены мутантные варианты, утратившие способность к полимеризации и пригодные для кристаллизации. Кристаллические структуры чехольных белков (или их фрагментов) будут встроены в реконструированные на основе крио-электронных изображений модели растянутых и сокращенных чехлов, что позволит выяснить молекулярный механизм сокращения чехла, а также получить представление о происходящих при этом конформационных перестройках белка. Сравнение структуры и свойств рекомбинантных чехольных белков из разных фагов позволит установить общие закономерности и выявить характерные отличительные особенности процесса сокращения чехла при инфицировании.

Цель предлагаемого проекта – изучение структуры и свойств чехольных белков различных представителей семейства Myoviridae, а также выяснение молекулярного механизма сокращения хвостовых чехлов в процессе инфицирования. В качестве объектов исследования выбраны различные по размеру генома представители семейства Myoviridae: фаг Т4 (172 kbp) E. coli, фаги phiKZ (280 kbp) и SN (66 kbp) Ps. aeruginosa. При общей морфологии частиц, хвосты перечисленных выше фагов значительно отличаются по длине и количеству субъединиц белка в чехле. Так, чехол фага Т4 состоит из 138 субъединиц продукта гена 18 (пг18), а чехол гигантского бактериофага phiKZ, у которого хвост почти вдвое длиннее, – из 264 субъединиц пг29. Гомологии в аминокислотных последовательностях чехольных белков (пг18 фага Т4 и пг29 фага phiKZ) не выявлено. Для фага SN, выделенного в нашей лаборатории ранее, определена нуклеотидная последовательность генома, однако пока нам не известно, какой ген кодирует белок чехла. Идентификация чехольного белка фага SN является одной из первоочередных задач предлагаемого проекта. Характерной особенностью чехольных белков является их способность к образованию различных полимерных форм как in vivo, так и in vitro. При морфогенезе фаговых частиц in vivo полимеризация чехольного белка начинается на вершине базальной пластинки и осуществляется на хвостовом стержне, как на матрице, приводя к формированию чехла в растянутой форме. В отсутствие матрицы чехольные белки также способны к самосборке в полимерные структуры. Нами установлено, что при экспрессии в клетках E. coli рекомбинантные белки (пг18 фага Т4 и пг29 фага phiKZ) формируют так называемые поличехлы, имеющие нерегулярную длину и представляющие собой полые трубки. Поличехлы имеют тенденцию к росту в длину, а при высокой концентрации взаимодействуют между собой боковыми поверхностями, образуя упорядоченные агрегаты. Они стабильны в растворах с высокой ионной силой, а при низкой ионной силе диссоциируют на мономеры. Одной из главных задач предлагаемого проекта является определение структуры рекомбинантных чехольных белков методами рентгеноструктурного анализа. Поскольку получить упорядоченные кристаллы поличехлов, имеющих нерегулярную длину, не удается, для кристаллизации необходимо получить мутантные варианты белков, утратившие способность к полимеризации. Ранее нами генно-инженерными методами был получен ряд мутантов продукта гена 18 фага Т4 и изучены их свойства. Для одного из мутантов (М26), являющегося мономером, были получены кристаллы. К сожалению, эти кристаллы дифрагируют с низким разрешением (7-8 ?), что затрудняет решение структуры данного белка. Однако мы имеем набор данных с разрешением 3,5 ? с кристаллов трипсин-устойчивого фрагмента, полученного при ограниченном протеолизе данного мутанта, и мы надеемся решить его структуру в ближайшее время. Следующим шагом будет встраивание кристаллической структуры этого фрагмента в модели реконструкции растянутого и сокращенного чехлов фага Т4, которые выполнены на основе изображений, полученных с помощью крио-электронной микроскопии. Мы планируем получить мутанты в мономерной форме и для чехольных белков фагов phiKZ и SN, и также решить их структуру методами рентгеноструктурного анализа. Для фага phiKZ мы планируем выполнить реконструкцию чехлов в сокращенном состоянии (в составе фаговых частиц) и поличехлов, формируемых рекомбинантным белком. Встраивание структур с высоким разрешением в реконструированные растянутые и сокращенные чехлы позволит выяснить молекулярный механизм сокращения чехла, а также получить представление о происходящих при этом конформационных перестройках белка. Сравнение структуры и свойств рекомбинантных чехольных белков из разных фагов позволит установить общие закономерности и выявить характерные отличительные особенности процесса сокращения чехлов при инфицировании.

В рамках проекта, направленного на выяснение молекулярного механизма сокращения хвостовых чехлов в процессе инфицирования бактериофагов семейства Myoviridae, исследования проводились на различных по размеру генома фагах (T4 E. coli, phiKZ и SN P. aeruginosa), имеющих общую морфологию хвостов, но существенно различающихся по длине хвостов и количеству субъединиц белка в чехле. Нами впервые были идентифицированы и охарактеризованы чехольные белки фагов phiKZ и SN. Локализация белков на частицах вирионов была подтверждена с помощью иммуноэлектронной микроскопии. Разработана система экспрессии в клетках E. coli как полноразмерных, так и различных делеционных мутантов этих белков; отработаны методики их очистки, проведено сравнительное изучение их свойств. На основе мутантов, утративших способность к самосборке в полимерные структуры, получены протеазоустойчивые фрагменты чехольных белков. Получены кристаллы протеазоустойчивых фрагментов чехольных белков фагов phiKZ и SN, пригодные для рентгеноструктурного анализа. В сотрудничестве с лабораторией М. Россманна (США) впервые для вирусов семейства Myioviridae определены с атомным разрешением структуры фрагментов двух чехольных белков. Методом множественной аномальной дисперсии с разрешением 1.8 Å определена структура полученного нами ранее трипсин-устойчивого фрагмента чехольного белка (пг18) фага Т4, а затем на ее основе методом молекулярного замещения решена структура другого мутанта (примерно 3/4 молекулы) с разрешением 3.5 Å. Кристаллическая структура пг18 была встроена в ранее реконструированные на основе криоэлектронных изображений модели растянутого и сокращенного чехлов. Предложен механизм сокращения чехла фага Т4. Показано, что при сокращении чехла субъединицы пг18 перемещаются относительно друг друга без заметных изменений в их структуре. С разрешением 2.2 Å определена структура протеазоустойчивого фрагмента чехольного белка (пг29) фага phiKZ. Впервые проведен сравнительный анализ пространственных структур двух чехольных белков. Хотя эти белки не имеют гомологии на уровне аминокислотной последовательности, а элементы вторичной структуры у пг29 связаны между собой в порядке, отличном от пг18, выявлено сходство в топологии чехольных белков фагов phiKZ и Т4, что, по-видимому, обусловлено подобием выполняемых ими функций и указывает на общее эволюционное происхождение. Для выяснения механизма сокращения чехла phiKZ кристаллическая структура пг29 была встроена в реконструированную нами ранее на основе криоэлектронных изображений модель растянутого чехла фага. С целью получения модели чехла в сокращенном состоянии впервые проведена реконструкция на основе криоэлектронных изображений поличехлов, формируемых рекомбинантным пг29. Сопоставление атомных моделей чехлов фагов Т4 и phiKZ до и после сокращения позволит сравнить механизмы сокращения чехлов при инфицировании.