ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Заявленный проект направлен на исследование побочных эффектов применения антидепрессантов на женскую репродуктивную функцию. Селективные ингибиторы обратного захвата серотонина (СИОЗС) являются препаратами первой линии терапии депрессивных состояний, поэтому представляют особый интерес в этом отношении. В последние годы заболеваемость депрессией и количество случаев применения СИОЗС неуклонно возрастает. Женщины детородного возраста, особенно во время и после беременности, являются группой риска, наиболее подверженной депрессивным состояниям. В связи с этим, важной научной проблемой является тщательный анализ возможных последствий приема антидепрессантов на репродуктивную функцию, в том числе во время беременности, когда закладывается овариальный пул развивающейся девочки, и в детском и подростковом возрасте, когда употребление антидепрессантов, зачастую, происходит неконтролируемо.
Depression is the most common mental disorder in the world, including in Russia. Women are twice as susceptible to depression, with the risk of depression increasing in childbearing age, and pregnancy is a vulnerable period during which there is a high likelihood of exacerbation of existing depression and the development of a new disease. Due to the prevalence of the problem, the most important task is to assess the safety of antidepressants, including their effects on reproductive function. In the course of a long process of oogenesis, not only does the formation and maturation of the oocyte occur, but the "material base" for the first stages of embryonic development accumulates. The most important feature of the female reproductive system's functioning is that the stock of future eggs is laid even in the embryonic period. With the age of a woman, starting from the fetal period, the number of oocytes in the ovary constantly decreases and cannot renew itself. It follows from this that all the influences made on the already formed ovarian pool are irreversible and can manifest themselves many years later at reproductive age. In light of the above, an important scientific problem is a thorough analysis of the possible consequences of the use of antidepressants during pregnancy, when the ovarian pool of a developing girl is laid and in childhood and adolescence, when using antidepressants often occurs uncontrollably. Among the spectrum of drugs used to treat depression, selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs) are first-line drugs, and their use has been steadily increasing in recent years. The serotonin transporter SERT, which is the main target of SSRIs, is expressed and functionally active in the ovary. It has been shown that taking antidepressants negatively affects the functional activity of granulosa cells, which are not only a key component guiding the process of egg maturation, but also perform the endocrine function by synthesizing estrogen. Among the consequences of this side effect is a tendency towards obesity and diabetes mellitus. However, the specific mechanisms of the effect of SSRIs on granulosa cells remain poorly understood. To fill this gap, it is planned to identify the molecular mechanisms by which antidepressants affect the components of ovarian follicles during their development. To solve this problem, within the framework of the declared project, studies will be carried out on the correlation of SERT activity in the oocyte with markers of the functional state and development potential of ovarian follicles, functional differences in ovarian follicles with different SERT activity in oocytes, mechanisms of the oocyte-mediated SERT-dependent effect of fluoxetine on the expansion of cumulus, delayed the influence of SERT activity on oocyte maturation, SERT-independent side effects of fluoxetine, as well as the expression of targets of antidepressants of various groups in the ovary. As a result of this task, new data will be obtained for the first time on the mechanisms of side effects of antidepressants (primarily SSRIs) on female reproductive function, the degree of the negative effect of taking antidepressants on the reproductive health of women will be assessed, and conclusions will be drawn about the possible consequences of their intake for subsequent embryonic development. Also, specific results will be obtained on the effect of serotonin on the course of oogenesis in vitro, which will be of practical importance.
По итогам первого года реализации проекта будут получены следующие результаты. Будут получены данные о динамике экспрессии и клеточной локализации в яичнике на разных сроках его развития мишеней различных групп антидепрессантов - транспортера норадреналина NET, транспортера дофамина DAT, моноаминоксидаз MAOA и MAOB, альфа-адренорецепторов, серотониновых рецепторов 5-HT2 и 5-HT3, мелатониновых рецепторов MT1 и MT2, а также декарбоксилазы ароматических аминокислот DDC. Будут получены данные о корреляции активности захвата серотонина ооцитами с морфофункциональными показателями состояния фолликулов – морфологическими параметрами фолликула, маркерами пролиферации, апоптоза, автофагии, уровнем экспрессии рецепторов гонадотропинов в клетках гранулезы, экспрессии ооцитарных факторов роста, и стероидогенной активностью. Будут получены данные о влиянии флуоксетина на Wnt-сигнальный путь в модели in vivo. Будут отработаны модели модуляции содержания серотонина в GV- и MII-ооцитах и получены данные о влиянии содержания серотонина на морфологические параметры ооцитов. Будет выявлена продолжительность сохранения накопленного серотонина в ооците. Будут получены культуры клеток гранулезы для исследования SERT-независимых побочных эффектов флуоксетина. Будут отработаны модели экспансии кумулюса in vitro для исследования опосредованного ооцитом SERT-зависимого влияния флуоксетина на фолликулярные клетки. Будут опубликованы три статьи в международных рецензируемых журналах, индексируемых международной аналитической базой Web of Science.
Руководитель имеет научный задел по заявленной теме. В предшествующих работах было показано наличие экспрессии компонентов серотонинергической системы в ооцитах и фолликулярных клетках на разных стадиях фолликулогенеза (Никишин и др., 2018б). Была выявлена временная динамика экспрессии мРНК этих компонентов в клетках гранулезы в ходе фолликулогенеза, и среди них были выделены маркеры фолликулиновой и лютеиновой стадий (Никишин и др., 2017а). Экспрессия и функциональная активность Sert в ооцитах показана как в культуре изолированных фолликулов (Никишин и др., 2018а), так и в экспериментах in vivo (Никишин и др., 2017б). Была выявлена роль мембранного захвата серотонина ооцитами растущих овариальных фолликулов как основного механизма, ответственного за аккумуляцию серотонина в яичнике (Nikishin et al., 2019). Проведены методические работы по оптимизации количественных исследований экспрессии генов в клетках яичника мыши и человека методом ПЦР в реальном времени (Nikishin et al., 2018; Filatov et al., 2019). В работах, выполненных на первичной культуре клеток гранулезы и культуре изолированных овариальных фолликулов выявлены Sert-зависимые эффекты серотонина на экспрессию маркеров функциональной зрелости клеток гранулезы (Никишин и др., 2021). Руководитель и члены коллектива владеют всеми заявленными в проекте методами. В предшествующих исследованиях были отработаны все модельные подходы, необходимые для выполнения проекта – от работы с животными до культуры клеток гранулезы, изолированных фолликулов и фрагментов яичника. Методически отработано определение функциональной активности клеток гранулезы по количественному исследованию экспрессии маркеров методом ПЦР в реальном времени. В отдельном исследовании подобраны оптимальные для работы референсные гены, стабильно экспрессирующиеся в яичнике мыши. Отработан протокол получения библиотек кДНК из малого количества (10-30) ооцитов.
В результате выполнения поставленной задачи будет не только оценена степень негативного эффекта приема антидепрессантов на репродуктивную функцию, но также будут сделаны выводы о возможных последствиях их приема для последующего эмбрионального развития. Кроме того, будут получены конкретные результаты о влиянии серотонина на ход оогенеза в культуре in vitro, который может иметь прикладное значение.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 29 июля 2022 г.-30 июня 2023 г. | Молекулярные механизмы побочного действия антидепрессантов на репродуктивное здоровье женщин |
Результаты этапа: В ходе первого года выполнения проекта проведено исследование корреляции активности SERT в ооците с маркерами функционального состояния и потенциала развития овариальных фолликулов. Cоокрашивание овариальной ткани антителами против серотонина и маркеров пролиферации, апоптоза и аутофагии показало, что различия активности захвата серотонина в ооцитах не коррелируют с показателями пролиферации и апоптоза в фолликуле, но находятся во взаимосвязи с морфо-функциональными показателями, отражающими стадию зрелости фолликула. Выявлено, что по мере созревания ооцита происходит рост активности SERT в ооцитах. Анализ методом Вестерн блоттинга показал, что в зрелых MII-ооцитах наблюдается более высокий уровень экспрессии активной гликозилированной формы транспортера серотонина SERT, нежели в незрелых GV-ооцитах. Таким образом, полученные в рамках данной задачи данные позволяют сделать вывод о том, что активность системы транспорта серотонина в ооците является показателем его зрелости. Проведено исследование влияния флуоксетина на функциональное состояние овариальной ткани в модели in vivo, которая предполагает высокую дозировку, но недолгосрочное воздействие, что позволяет исключить длительно развивающиеся побочные эффекты, связанные с влиянием на метаболизм. В эксперименте наблюдается существенное снижение экспрессии нескольких генов, которые являются показателями активности фолликулогенеза в яичнике - ароматазы Cyp19a1, рецептора ФСГ, рецептора ЛГ, и ооцитарных факторов роста Gdf9 и Bmp15, играющих существенную роль в поддержании фолликулогенеза. Выявлено, что в опыте экспрессия мРНК гена мишени флуоксетина Sert тоже снижается, что говорит о наличии в яичнике положительной обратной связи между захватом серотонина и экспрессией мембранного транспортера. Выполнено исследование экспрессии мишеней различных групп антидепрессантов в яичнике. Выявлено, что в ходе оогенеза и на ранних стадиях развития наблюдается высокая экспрессия ферментов первых этапов синтеза серотонина и дофамина Th и Tph2, а также моноаминоксидазы обоих типов и катехол-О-метилтрансфераза. Выявлено,что в оогенезе и раннем доимплантационном развитии два транспортера - мембранный транспортер серотонина Sert и везикулярный транспортер моноаминов Vmat2 - и несколько моноаминергических рецепторов обладают выраженной экспрессией: рецепторы серотонина Htr1d, Htr5a, Htr5b, Htr7, рецептор дофамина Drd3, адренорецепторы Adra2b, Adra2c и Adrb3, а также ядерный рецептор мелатонина Rora. Проведено исследование пространственного распределения серотонина, везикулярного транспортера моноаминов Vmat2 и рецепторов серотонина Htr1d и Htr2a в GV-ооцитах и эмбрионах на разных стадиях доимплантационного развития мыши. Выявлено, что как сам серотонин, так и его везикулярный транспортер Vmat2 локализуются в большей степени в кортикальном слое ооцитов и ранних эмбрионов, выявляясь в виде мелких гранул одинакового размера. Это может свидетельствовать об активности серотонина как посредника межклеточной сигнализации на поздних стадиях оогенеза и в процессе межбластомерного взаимодействия на ранних стадиях развития. Паттерн распределения Htr1d- и Htr2a-иммунопозитивных частиц резко различается: Htr1d выявляется в примембранном слое ооцитов, тогда как Htr2a окрашивается по всей цитоплазме в составе очень крупных гранул. Эти данные могут свидетельствовать в пользу того, что рецепторы выполняют различные функции: рецептор Htr1d может быть связан с межклеточной коммуникацией на ранних стадиях развития, а Htr2a – с метаболическими процессами во внутриклеточных структурах. В отчетный период проведен анализ содержания серотонина в незрелых GV-ооцитах из яичников и зрелых постовуляторных MII-ооцитов из яйцеводов, выделенных из контрольных мышей и из самок, подвергавшихся воздействию флуоксетина в течение 7 дней. Выявлено, что содержание серотонина в MII-ооцитах контрольных самок в среднем в 4 раза выше, чем в GV-ооцитах, тогда как у опытных самок уровень содержания серотонина в GV- и MII-ооцитах не различается, и соответствует уровню контрольных GV-ооцитов. Полученные результаты подтверждают предположение о том, что активный захват серотонина происходит после овуляции зрелыми ооцитами, и практически не реализован в составе созревающих фолликулов. Проведен анализ зависимости содержания накопленного в ооцитах серотонина от концентрации его в среде. Выявлено, что ооциты достоверно увеличивают внутриклеточное содержание серотонина при его концентрации в окружающей среде от 25 нМ, и при удалении серотонина из среды его содержание в ооцитах постепенно снижается, достигая базового уровня через 24-36 ч. Таким образом подобраны оптимальные условия протоколов, в результате которых будут получены ооциты с повышенным и пониженным содержанием серотонина, которые в дальнейшем будут исследованы на предмет изменений морфологических и функциональных характеристик, в каждом подходе, по сравнению с контрольными гаметами. Изучена динамика изменения содержания серотонина в культуральной среде Выявлено, что концентрация серотонина снижается медленно, не более, чем на 20% через 24 часа инкубации. Изучено влияние серотонина на функциональное состояние клеток гранулезы в первичной культуре. Выявлено, что три гена достоверно изменяют уровень экспрессии мРНК в ответ на серотонин: маркеры клеток кумулюса Has2 и Ptrgs2, и регулятор клеточного цикла циклин D (Ccnd1). Исследована активность систем мембранного транспорта и деградации серотонина в первичной культуре клеток гранулезы. Выявлено, что в клетках гранулезы происходит захват серотонина мембранным транспортером SERT и последующая активная деградация серотонина моноаминоксидазами. | ||
2 | 1 июля 2023 г.-30 июня 2024 г. | Молекулярные механизмы побочного действия антидепрессантов на репродуктивное здоровье женщин |
Результаты этапа: В ходе второго года реализации проекта завершено исследование влияния флуоксетина на функциональное состояние овариальной ткани in vivo. В экспериментах на взрослых и препубертатных самках выявлено снижение в яичнике экспрессии мРНК генов ферментов стероидогенеза Cyp19a1, Cyp17a1, Cyp11a1, рецептора фолликулостимулирующего гормона Fshr и лютеинизирующего гормона Lhr, ооцитарных факторов роста Gdf9, Bmp6 и Bmp15, и мишени флуоксетина, мембранного транспортера серотонина Sert. Методом Вестерн-блоттинга выявлено снижение содержания белков SERT, CYP19A1 и GDF9, что подтверждает данные ПЦР в реальном времени. Проведен анализ экспрессии мРНК предшественников ФСГ и ЛГ в гипофизе, который не выявил различий между контрольными и экспериментальными самками. Проведено исследование содержания ФСГ и ЛГ в крови методом ИФА, которое также не выявило различий в уровне гонадотропных гормонов между двумя группами самок. На основе полученных результатов сделано заключение о том, что краткосрочное применение флуоксетина приводит к подавлению процесса фолликулогенеза, способствует менее зрелому статусу фолликулов и ооцитов и сниженной функциональной активности фолликулярных клеток. Выявлено, что эффекты флуоксетина реализуются не через гипофизарные гормоны, а прямо на яичник, а основной мишенью флуоксетина в яичнике являются именно ооциты. Проведен анализ иммунолокализации в ооцитах и ранних эмбрионах нескольких мишеней антидепрессантов, экспрессия которых выявлена в результате анализа транскриптомов – мембранных рецепторов серотонина Htr1b, Htr2b, Htr5a и Htr7 и фермента деградации моноаминов Maoa. Выявлена локализация и компонентов в ооцитах и бластомерах, проведен сравнительный анализ размера иммунореактивных частиц, выявляемых антителами. Проведены эксперименты по выявлению активности везикулярного транспорта моноаминов в ооцитах мыши. Анализ показал, что блокатор везикулярного транспорта резерпин вызывает снижение содержания серотонина как в GV-, так и в MII-ооцитах, при этом исчезает характерный паттерн выявления серотонина в многочисленных гранулах в примембранном слое ооцита. Полученные результаты говорят о том, что в период созревания ооцитов выявляемый в них Vmat2 активен и необходим для накопления серотонина в везикулярном примембранном компартменте. Проведены эксперименты по выявлению активности мембранного транспорта и моноаминоксидазы в доимплантационных эмбрионах. Получены результаты, свидетельствующие о том, что к стадии бластоцисты в клетках сохраняется способность захватывать серотонин из внешней среды, но в них высока активность системы деградации моноаминов, которая эффективно окисляет трансмиттер. Полученные результаты позволяют заключить, что в доимплантационный период эмбрионального развития мыши комплекс белков, составляющих полноценную серотонинергическую сигнальную систему, вместе с серотонином, основным источником которого в ооцитах и ранних эмбрионах является захват из окружающих тканей внутренней среды с помощью мембранного транспортера Sert, может потенциально осуществлять серотонинергическую сигнализацию как на межклеточном, так и на внутриклеточном уровне. Проведено исследование влияния применения флуоксетина на количественные и качественные показатели женской репродуктивной функции. Выявлено, что после 7-дневного применения флуоксетина количество овулировавших MII-ооцитов снижается на 13%. Выявлено, что полученные после воздействия флуоксетина зрелые MII-ооциты морфологически не отличаются от контрольных. Проведено функциональное исследование способности к развитию ооцитов, созревших при воздействии флуоксетина. Анализ показал, что ооциты развиваются в гораздо меньшем проценте, чем в контроле. Проведен протеомный анализ с целью поиска механизмов, чувствительных к воздействию флуоксетина, на белковом уровне. В результате анализа идентифицировано 2322 белка, для которых проведена оценка дифференциальной экспрессии. Для 31 белка показано увеличение экспрессии под влиянием флуоксетина более, чем в 2 раза. 79 белков снижают экспрессию в МII-ооцитах под действием флуоксетина в 2 раза и более. Проведен анализ генных онтологий, который показал, что в ооцитах, созревших под воздействием флуоксетина, статистически значимо изменяется содержание белков, связанных с механизмами процессинга и сплайсинга мРНК, клеточного цикла и митотического деления, окислительного фосфорилирования и активностью митохондрий. Среди сигнальных путей, компоненты которых представлены в полученном списке генов, выявлены компоненты каскадов mTOR и Rho GTPаз. Проведены эксперименты по приему флуоксетина до и во время беременности с последующим анализом принесенного потомства. Выявлено, что количество новорожденных мышат, принесенных самками, принимающими флуоксетин, меньше, чем в контроле, при этом их размер и вес соответствует норме. Проведено исследование влияния флуоксетина на процессы формирования кумулюса и созревания ооцитов на экспериментальной модели экспансии кумулюса in vitro. Показано, что после 7-дневного воздействия флуоксетина экспансию претерпевает меньшая доля ооцит-кумулюсных комплексов. Молекулярно-генетический количественный анализ показал существенно более низкую экспрессию генов Has2 и Ptgs2 в ооцит-кумулюсных комплексах, которые получены от экспериментальных животных. По результатам работы в отчетный период опубликована статья в журнале Биологические мембраны и статья в журнале International Journal of Molecular Sciences (Q1). Кроме того, по итогам второго года выполнения проекта подготовлены материалы для публикации двух статей в журналах, индексируемых международной аналитической базой Web of Science (Q1) в 2024 г. Также в ходе второго года выполнения проекта получен научный задел для как минимум двух статей, которые планируется завершить и подготовить к публикации в международных рецензируемых журналах, индексируемых Web of Science, в 2025 г. | ||
3 | 1 июля 2024 г.-30 июня 2025 г. | Молекулярные механизмы побочного действия антидепрессантов на репродуктивное здоровье женщин |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".