Разработка мультиплексных систем для мониторинга поствакцинального иммунитета птицыНИР

Development of multiplex systems for monitoring post-vaccination immunity of poultry

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 августа 2022 г.-30 июня 2023 г. Разработка мультиплексных систем для мониторинга поствакцинального иммунитета птицы
Результаты этапа: На первом этапе проводимых работ были выделены и очищены антигены возбудителей инфекционных заболеваний кур из инактивированной вирусосодержащей суспензии, предоставленной НПП «Авивак». В качестве антигенов были использованы вирусные суспензии возбудителей болезни Ньюкасла, инфекционного бронхита и инфекционной бурсальной болезни кур. Для очистки вирусных суспензий использовали различные методы, такие как солевое осаждение, диализ, гель-фильтрация, ультра-фильтрация. Было показано, что наиболее эффективным и простым является способ очистки вирусных частиц с помощью диализа против дистиллированной воды с последующим перерастворением осажденных частиц, что снижало содержание балластных белков в препарате (рис. 1). Количество вирусных частиц оценивали с помощью анализа траекторий наночастиц. Очищенный диализом и переосаждением антиген содержал (4,84 ±0,85)х1011 частиц/мл с основной фракцией частиц размером 78 нм (рис. 2). Остальные антигены очищали по аналогичной методике. Для оптимизации условий сорбции антигенов в лунках полистиролового планшета помимо способа предварительной очистки антигена варьировали также его концентрацию, pH и состав буфера для сорбции. Контроль неспецифической сорбции проводили с использованием конъюгата антивидовых антител с пероксидазой хрена и субстратного раствора, содержащего 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ) для колориметрической детекции. Неспецифическое связывание антивидового конъюгата в реакции с антигеном снижалось с использованием кислотных буферов (рис. 3). Однако, ввиду того, что целевой сигнал также заметно снижался при уменьшении pH сорбционного буфера, оптимум соотношения сигнал/шум был достигнут при использовании слабокислотных буферов с pH=6.0. Наименьшее неспецифическое связывание антигена с антивидовым конъюгатом наблюдалось при использовании раствора антигена, очищенного диализом против дистиллированной воды, что также подтверждает наибольшую степень очистки суспензии вирусных частиц от балластных белков, в том числе антител с которыми реагирует антивидовой конъюгат. В дальнейшей работе для создания двухстадийного иммуноферментного анализа для сорбции всех трех антигенов использовали буфер с pH 6,0. При изучении взаимодействия сорбированных антигенов и специфических антител было выявлено, что IgY в составе сыворотки кур имеют высокую степень неспецифического связывания с поверхностью полистиролового планшета, которое можно значительно снизить, используя рабочий буфер, содержащий детергент. При использовании рабочего буфера с концентрацией Твин-20 более 0,1% от объема наблюдалась минимальная величина неспецифического связывания IgY на лунках планшета (рис. 4). Помимо присутствия детергента в рабочем буфере на величину неспецифического связывания IgY оказывало значение pH среды (рис. 5), поэтому в качестве рабочего буфера для связывания антител использовали буфер с pH 6.0, содержащий 0,1% Твин-20. Во избежание проявления неспецифического связывания IgY время проведения реакции было снижено до 30 минут. Оптимальное разведение сыворотки для проведения иммуноферментной реакции составило 500 раз. Таким образом, были подобраны условия для создания двухстадийного иммуноферментного анализа в классическом формате 96-луночного планшета для прямого выявления специфических поствакцинальных антител кур к возбудителям болезни Ньюкасла, бурсальной болезни и инфекционного бронхита кур. Измерение сывороток с различным уровнем специфических антител в подобранных условиях позволило получать сигнал в широком диапазоне значений оптических плотностей от 0,1 до 2,2 (рис. 6), выявляя как высокие, так и низкие титры специфических антител с возможностью группировать сыворотки по уровню содержания антител (титрогруппа), что важно для характеризации сывороток и оценки эффективности проводимой вакцинации в птицехозяйствах. Совместно с НПП «Авивак» из птицеводческого хозяйства для анализа были отобраны 75 образцов сыворотки и соответствующих образцов цельной крови вакцинированных кур, высушенной на впитывающих стекловолоконных носителях размером 5*90 мм, разделенных на зоны по 5 мм для дозирования сухого образца. Парные образцы жидкой сыворотки крови и сухой цельной крови были охарактеризованы с использованием коммерческих ИФА тест-систем фирмы IDEXX (США) и ВНИИЗЖ (Россия) на три инфекционных заболевания (болезнь Ньюкасла, инфекционный бронхит, бурсальная болезнь кур). Для элюирования сухих образцов с носителя использовали рабочий буфер, содержащий 0,1% Твин-20, а также рабочие буферы для разведения сывороток из коммерческих тест-систем. Во всех случаях наблюдалась эффективная экстракция сухого образца в раствор в течение 10-15 минут. Для каждой из 6 тест-систем наблюдалась высокая корреляция результатов между сухими и жидкими образцами (рис. 7). Стоит отметить, что тест-системы ВНИИЗЖ обладают большей дисперсностью результатов по сравнению с системами IDEXX, что приводит к снижению сходимости результатов между собой (рис. 8). Полученные результаты позволяют судить о том, что сухие образцы цельной крови можно использовать наравне с образцами жидкой сывороткой на всем диапазоне титров антител с высокой степенью достоверности результатов (табл. 1). Разработанные подходы при создании классического иммуноферментного анализа к инфекционным заболеваниям кур были использованы для разработки иммунохимического теста в формате иммуночипа с целью последующего создания мультиплексных тест-систем. При установке определенного порогового уровня оптической плотности (например, на уровне положительного контроля) за счет варьирования концентрации сорбируемого антигена можно достичь реализации градиентного иммуноанализа с фиксацией количества окрашенных лунок (рис. 9). Данный принцип также использовали для получения градиентного анализа в формате микрозон на лунке планшета. Для нанесения дискретных зон на лунку полистиролового планшета использовали прибор XactII™ Compact Microarray System (LabNEXT, США). Для получения пятна, позволяющего после проведения иммунохимической реакции и окрашивания с помощью сканирования оценить интенсивность, либо визуально оценить количество окрашенных зон, концентрацию раствора специфического антигена, используемого для нанесения на поверхность, увеличивали на порядок по сравнению с классическим ИФА. Для оптимизации формы пятна и воспроизводимости его нанесения варьировали ряд параметров (рис. 10). Полученный после этого иммуночип использовали для проведения иммунохимической реакции. Время проведения реакции связывания антигена с антителами, а также инкубации с антивидовым пероксидазным конъюгатом составляло 30 минут. Далее проводили окрашивание зон с помощью субстрата ТМБ, содержащего 0,5% декстрансульфата, в течение 20 минут для получения нерастворимого окрашенного комплекса и осаждения на поверхность в месте локализации иммунохимических комплексов. Были выбраны оптимальные концентрации вирусных антигенов, наносимых на аналитическую поверхность в виде круговых микрозон с градиентно увеличивающейся концентрацией, для получения соответствующего предела обнаружения специфических к трем инфекционным заболеваниям антител. При градиентном нанесении антигенов было достигнуто наличие различного количества окрашенных зон в зависимости от титра специфических антител, присутствующих в исследуемой пробе (рис. 11) Для численной оценки полученных при таких условиях микрозон лунки сканировали и рассчитывали интенсивность окрашивания пятен с помощью программы ImageJ (National Institutes of Health, США) для количественного сопоставления интенсивности окраски с титром исследуемых проб. При количественной оценке интенсивности окрашивания микрозон получены хорошие корреляции с классическим ИФА для всех трех антигенов. Пример корреляции приведен на рисунке 12. При сравнении жидкой сыворотки и соответствующих образцов сухой цельной крови результаты численной обработки окрашенных зон находились в высокой корреляции (>0,9). Использование градиентного нанесения вирусных антигенов позволяет соотносить количество окрашенных зон после проведения анализа со значением титра искомых антител в исследуемой сыворотке и сухой цельной крови кур, т.е. оценивать результат полуколичественно (таблица 2). Результаты полуколичественной оценки (число наблюдаемых окрашенных микрозон) для парных образцов сухой крови и жидкой сыворотки с использованием иммуночипов совпадали. Таким образом, были получены сопоставимые данные, полученные методом ИФА и разработанного градиентного иммуноанализа в формате микрозон для трех инфекций. Использование данного типа иммуноанализа позволяет полуколичественно оценить напряженность иммунитета кур по числу окрашенных зон (нулевой, низкий, средний, высокий и очень высокий уровень иммунного ответа) и проводить скрининг поголовья кур для оценки эффективности проведения иммунизации к определенному типу возбудителя инфекционного заболевания. Было показано, что в качестве биопроб для количественного и полуколичественного определения титра или диапазона титров антител в формате иммуночипа возможно использование сухих образцов цельной крови.
2 1 августа 2023 г.-30 июня 2024 г. Разработка мультиплексных систем для мониторинга поствакцинального иммунитета птицы
Результаты этапа: Получены и охарактеризованы наночастицы золота (НЧЗ) размером от 10 до 30 нм. Характеристика полученных НЧЗ проводилась спектрофотометрическим методом, методом электронной микроскопии и методом динамического светорассеяния. Были получены биотинилированные антивидовые антитела против IgY кур путем реакции с производным биотина с активированной карбоксильной группой. Оптимизированы условия сорбции антител (небиотинилированных и биотинилированных антивидовых антител против IgY кур) на поверхности коллоидных НЧЗ различного размера для получения стабильных комплексов НЧЗ-антитела. Полученные НЧЗ и комплексы НЧЗ с антителами изучены спектрофотометрическим методом и методом динамического светорассеяния. Изучены условия образования агломератов с участием комплексов «биотинилированные антивидовые антитела против IgY кур-НЧЗ» и стрептавидина методом динамического светорассеяния. Была изучена связывающая способность образующихся агломератов со стрептавидином и биотином, сорбированным на поверхности аналитической мембраны и их использование для определения концентрации IgY кур. Изучена возможность усиления аналитического сигнала в проточном иммуноанализе при использовании конъюгата антивидовых антител с НЧЗ и системы стрептавидин-биотин. Была изучена связывающая способность комплексов НЧЗ-анти IgY Ат с IgY кур в проточном мембранном анализе. Изучены условия проведения мембранного проточного иммуноанализа с организацией потока реагентов в горизонтальном (латеральном) и поперечном относительно аналитической мембраны направлении. Для проведения проточного иммуноанализа с целью определения поствакцинальных антител был выбран иммунофильтрационный анализ (ИФиА). Оптимизированы концентрации антигенов возбудителей НБ, ИБК, ИББ для сорбции на поверхность аналитической мембраны в виде дискретных зон с последовательно изменяющейся концентрацией в формате иммуночипа для обеспечения градиентного формата проведения мембранного проточного анализа, условия нанесения антигенов на поверхность мембраны, условия проведений стадий анализа. Изучено использование конъюгатов антивидовых антител с пероксидазой и с НЧЗ для мультиплексного анализа, проведена сравнительная характеристика определения IgY кур на поверхности аналитической мембраны. Оптимизированы условия проведения градиентного ИФиА в формате иммуночипа (6*10). Разработанный иммуночип при одновременном определении поствакцинальных антител к возбудителям трех инфекций позволяет определять титр специфических антител в нескольких диапазонах: нулевой (<1000), низкий (1000-2500), средний (2500-5000) и (5000-8000), высокий титр (>8000). Проведена сравнительная характеристика результатов параллельного определения поствакцинальных антител против возбудителей болезни НБ, ИБК, ИББ в ИФА в классическом формате, формате иммуночипа на лунке полистиролового планшета и проточном иммуноанализа в формате иммуночипа (ИФиА) с использованием сывороток крови кур после иммунизации на несколько инфекций. Определены возможности и ограничения полуколичественного определения поствакцинальных антител птицы против возбудителей трех инфекций с использованием разработанных иммуночипов.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".