ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Проект направлен на создание методом селекции генетических линий мышей, различающихся по проявлению когнитивных способностей с целью создания важных для нейробиологии и медицины новых генетических моделей.
The study of genetic basis of animal cognitive processes is the current one as it is the fundamental neurobiological problem – the investigation of CNS function in laboratory animals. Although it is important as the serious problem of translational medicine, as the creation of genetic models of human brain diseases will promote the search of therapeutic correction of such states. At present most scientists use the term "animal cognition" to describe all behavioral plasticity phenomena, memory and learning (with discrimination learning and reversals) being the most common topics. Less attention is paid to animal ability to solve the elementary logic tasks. The selection of mice and rats for different learning success was demonstrated rather long ago, while actually no selection experiments were performed for the different ability to solve the urgent problem solution, when animal has no analogous previous experience. Thus the project topic looks currently important – the study of behavior differences in mice selected for high and low scores of elementary logic task solution and in two mouse genetic strains selected for high and low relative brain weight. Animals will be tested for understanding “object permanence” rule (which is - when the object, previously seen, is perceived any more, it could be searched for). This test was introduced by French scientist J. Piajet. The success or failure in solution of this test will be compared with scores of other tests measuring anxiety, attention, sociality, instrumental learning. The current importance of project topic is determined as well by the possibility to evaluate the plausible differential effect of pharmacological agents on mice displaying different expression of traits connected with cognitive abilities. The data to be obtained could be important for the development of the general knowledge, concerning genetic grounds of animal cognition, and they would permit to delineate the neurochemical processes, participating in the development of high and low scores levels of respective abilities in the laboratory mice. As no selection experiments were performed for different levels of cognitive abilities (elementary logic task solution) the project proposed is really novel.
Предполагается тестирование мышей 2 пар линий (линий БМ и ММ, а также линий «плюс» и «минус») в батарее тестов, которые адресованы и оценке «когнитивных» признаков, и «общим» проявлениям поведения (тревожности, исследовательской активности, склонностью к развитию депрессии, «охотничьему» поведению, социальному доминированию). И тревожность животного, и исследовательская реакция животного- это достаточно сложные по своей структуре признаки, для оценки которых в настоящее время используют батарею тестов, поскольку это дает возможность делать более обоснованные заключения об особенностях этих форм поведения. Первая группа тестов – оценка когнитивных способностей мышей «плюс» и «минус» - будут оцениваться в 5 вариантах экспериментов. Со всеми животными каждого из новых поколений селекции мышей линий «плюс» и «минус» будет проведен тест на поиск входа в укрытие, т.е. когнитивный тест на «неисчезаемость», результаты которого учитываются при селекции. За 2 года выполнения проекта предполагается получить 4-5 новых поколений этой селекции, суммарно по 120 мышей в каждом. Часть мышей каждого поколения селекции будет тестирована в батарее тестов: в новом тесте на внимание (основанном на прослеживании животным перемещения объекта, помещенного в поле зрения животного). Успешность выполнения теста – наличие движений прослеживания движущегося в поле зрения объекта), и по доле животных, обнаруживших такую реакцию в каждой из линий; повторный тест на поиск входа в укрытие для проверки сохранения следа долговременной памяти о решении теста на поиск входа в укрытие через 3-4 недели после его первого предъявления. Динамика изменений латентного периода решения будет рассматриваться как показатель формирования долгосрочной памяти выполнения теста; будет проведен тест на обучение пищедобывательному навыку в Т-образном лабиринте, поскольку важно оценить особенности проявления когнитивных способностей при тестировании животных на основе пищевой, а не только оборонительной мотивации и тест на гипонеофагию (реакция голодной мыши на новую пищу, обычно сыр) в новой (но не пугающей) обстановке. Поведение мышей линий БМ и ММ следующих поколений (эти линии разводятся в режиме свободного внутрилинейного скрещивания) будет выборочно исследовано в указанных выше тестах с целью получения данных о существовании корреляций между признаками, характеризующими разные проявления когнитивных способностей, общими особенностями поведения и относительным весом мозга. Будет проведена оценка различий в числе клеточных элементов в гиппокампе и префронтальной коре у мышей БМ и ММ. Вторая группа тестов (анализ общих особенностей поведения мышей 4 линий) позволит охарактеризовать уровни экспрессии признаков общей тревожности животных в их соотношении с исследовательским поведением. Будет проведен тест «приподнятого крестообразного лабиринта» (ПКЛ), тест «открытое поле», батарея тестов «закрытый крестообразный лабиринт (ЗКЛ), акустическая стартл-реакция и неизбегаемая скользкая воронка» (НСВ)» (далее – тест «лабиринт-щелчок-воронка»). Тестирование в ЗКЛ оценивает исследовательскую реакцию мыши в среде, не вызывающей испуга животного (в отличие от теста «открытое поле»). Оценка сенсорной реактивности (стартл-реакции на звуковой щелчок) особенно важна при исследовании эффектов действия фармакологических препаратов. Характеристика типов поведения мыши в тесте НСВ (являющегося аналогом теста Порсолта) позволяет оценить предрасположенность животного к формированию поведения, сходного с депрессией. Характер корреляции показателей этих тестов с успешностью экспрессии когнитивных признаков даст значимую информацию о возможных различиях в «структуре» поведенческого фенотипа мышей исследуемых линий. Агрессию хищника, как активное проявление пищевого поведения мыши, оценивают у голодного животного, которому предлагают живую «добычу» - сверчка. В ходе теста мышь может не реагировать на «добычу», но может ее поймать и съесть, затратив на это большее или меньшее время. Показатели этого теста могут быть сопоставлены и с тестом на обучение пищедобывательному навыку, и с тестом на гипонеофагию, что позволит охарактеризовать консумматорное поведение животных более подробно. Проведение теста на социальное доминирование (тест в трубке) даст информацию для более подробной характеристики различий в поведении между линиями БМ-ММ и между линиями «плюс-минус». В этом тесте в узкую прозрачную трубку помещают двух животных и наблюдают проявление доминирования одного из них в виде «выталкивания» соперника из трубки. К числу физиологических тестов следует отнести оценку болевой чувствительности животных методом tail-flick, при раздражении области хвоста концентрированным световым лучом с автоматической регистрацией времени реакции. Эта оценка важна для более полной характеристики межлинейных различий животных анализируемых линий. Результаты, ожидаемые к получению в 2023 году, будут содержать конкретные данные по межлинейным различиям в использованных тестах у мышей новых поколений, которые позволят обоснованно трактовать влияние генотипа (БМ и ММ) и процесса селекции на решение когнитивного теста (мыши «плюс-минус») на соотношение уровней экспрессии разных признаков поведения в адаптивных реакциях мышей.
Научный задел коллектива состоит во владении методами и подходами селекционной работы с мышами, а также в публикациях по поведению мышей разных генотипов в тестах для оценки когнитивных способностей и общих особенностей поведения. Публикации, подтверждающие наличие научного задела по проекту: Перепелкина О.В., Огиенко Н.А., Сулейманова А.Д., Полетаева И.И.Стресс иммобилизации и поведение мышей с разным весом мозга. Журн. ВНД им. И. П. Павлова, 2021, том 71, № 1, с. 100-109 Перепелкина О.В., Полетаева И.И.Селекция лабораторных мышей на успешность когнитивного теста и на неспособность к его решению. ДАН, Науки о жизни, 2021, том 499, с. 39-43 Перепелкина О.В., Тарасова А.Ю., Огиенко Н.А., Лильп И.Г., Полетаева И.И.Вес мозга и когнитивные способности лабораторной мыши. Усп. совр. биол., 2019, том 139, № 5, с. 434-445 Полетаева И.И., Перепелкина О.В., Огиенко Н.А., Тарасова А.Ю., Лильп И.Г., Кошлань И.В., Павлова Г.В., Ревищин А.В. Влияние облучения протонами на решение мышами когнитивного теста на поиск входа в укрытие и нейрогенез взрослого мозга. Радиац.биол.,радиоэкология, 2019, том 59, № 5, с. 512-516 Perepelkina O.V., TarassovaA.Yu, Surina N.M., Lilp I.G., Golibrodo V.A., Poletaeva I.I.Intermale aggression in laboratory mice, selected for the cognitive traitInternational Journal Genetic Sciens ISSN 2018, Online: 2377-4274, том 5, № 1, с. 1-8 Опыт реализации совместных проектов у научного коллектива имеется – проведение совместных исследований в рамках проекта по влиянию облучения на сложные формы поведения мышей, статья - Полетаева И. И. Перепелкина, О.В. , Огиенко Н. А. и др. Влияние облучения протонами на решение мышами когнитивного теста на поиск входа в укрытие и нейрогенез взрослого мозга. Рад.биология. Радиоэкология. 2019. Т. 59, № 5. С. 512–516.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Генетические исследования когнитивных способностей животных на модели лабораторной мыши |
Результаты этапа: Приводятся полученные в 2023 году данные по 22 и 23 поколениям линий БМ и ММ, поддерживающихся без отбора (F44 и 45 от начала селекции, различия в весе мозга в F45 достоверны р<0.001) и данные по F7 и F8 линий мышей,селектированных на успешное решение и не-решение теста на «неисчезаемость». Тест на поиск входа в укрытие (puzzle-box) основан на оперировании животным правила «неисчезаемости». Это когнитивный тест perse, он для его выполнения не требуется аналогичный опыт. Мыши БМ достоверно быстрее, чем ММ, решали тест в 1-м и 2-м предъявлениях. Доли животных, решивших предъявления теста с пробкой были также достоверно выше у мышей БМ (р<0.001). ЛП первого подхода к открытому лазу (который характеризует преобладание исследовательского поведения над «осторожностью»), был короче у мышей БМ (БМ – 26.1±9.6 с, ММ – 47.3±10.4 с, р<0.01), он был короче и в тесте с пробкой (для 1-го предъявления теста с пробкой: БМ - 40.3±13.7 с, ММ – 110.3±16.6 с, р<0.01). Среднее число подходов к лазу, которое животное совершило до выполнения решения теста (или до окончания условного времени, выделенного для решения) было меньше у БМ, поскольку их ЛП были короче (при 1-м предъявлении лаза, закрытого пробкой, БМ – 5.0±0.5, ММ – 1.5±0.4, р<-0.001, и при втором предъявлении этого варианта теста БМ – 2.5±0.4, ММ – 0.8±0.4, р<0.01). Это показывает более четко выраженное целенаправленное поведение мышей БМ. Число стоек в этом тесте при открытом лазе, различалось недостоверно, но оно было выше у мышей БМ, но при лазе, закрытом пробкой, число стоек (т.е., до решения теста) различалось достоверно (БМ – 11.3±1.4, ММ – 1.9±1.3, р<0.001). Поскольку число стоек отражает не только уровень исследовательской активности, но и общую активацию поведения, различия в этом показателе можно интерпретировать как отражение разного уровня «стремления» животного решить тест. Таким образом, у мышей линии БМ способность к решению когнитивного теста была выше. Тест на внимание с предметами, мыши БМ и ММ, F45, был впервые использован в настоящих экспериментах. Реакции мышей на 1-й и 5-й предметы различались это проявилось в различиях по ЛП 1-го контакта с предметом был короче у мышей БМ, чем у ММ (p<0.01),число таких контактов и число также были у них выше, чем у ММ. Различия в показателях реакции мышей на предметы, показанные последними (т.е. пятыми) были противоположными «по знаку» - ЛП 1-го контакта с «последним» предметом у ММ был короче, чем у БМ (тенденция, p=0.051), и выше было число контактов с ним. Эти новые данные говорят о сложном «рисунке» межлинейных различий, при этом можно заключить, что поведение мышей БМ оказалось адекватным ситуации (снижение внимания к последнему предмету). В тестах на гипонеофагию и на тревожность выявились различия (БМ vs ММ, F45) свидетельствующие о более высокой тревожности и поведения «осторожности» у мышей ММ. В тесте на агрессию хищника, когда голодной мыши давали возможность поймать (и съесть) сверчка более активное поведение было у мышей БМ, тогда как в тесте на социальное доминирование межлинейных различий в числе побед и поражений выявлено не было. Предварительные данные (F44, по 6 мышей каждой линии) по морфологии мозга позволили увидеть межлинейные различия (БМ vs ММ) в норадренергическом ядре ствола – голубом пятне (locuscoeruleus), нейроны которого проецируются в структуры новой коры и гиппокампа. Среднее число клеток, обнаруживших иммунореактивность к тирозингидроксилазе, ТГ (ферменту синтеза катехоламинов), в срезах мозга мышей БМ было достоверно больше (р<0.05, критерий Манна-Уитни), чем у мышей ММ. Относительная яркость соответствующей окраски в этой области среза (в пикселях), превышающую яркость «фона», была (недостоверно) выше также у мышей БМ, что указывает на необходимость оценки этого показателя на большей выборке. Эксперименты с мышами линий, которые селектируются по признакам «решение» (линия «плюс») и «не-решение» (линия «минус») когнитивного теста на неисчезаемость (поиск входа в укрытие) были проведены на животных F7 и F8. Исходной популяцией для данной селекции были мыши F20 линии ЭКС, ранее селектированной на успешность решения когнитивного теста на экстраполяцию направления движения пищевого стимула, исчезнувшего из поля зрения. В селекции мышей на решение теста на «неисчезаемость» (линия «плюс») в размножение брали мышей, решивших тест с пробкой за 1-1.5 мин, а для селекции «не-решающих» мышей - животных с «нулевыми» показателями такого решения. У мышей F7 и F8 этих линий, у мышей линии «плюс» были более короткие ЛП решения 1-го и 2-го предъявлений теста и более высокие доли решения теста с пробкой, как это было и в предыдущих поколениях. Таким образом, искусственный отбор мышей по выбранным признакам был успешным. У мышей линии «плюс» были выше показатели краткосрочной рабочей памяти, тогда как успешность решения теста через 2.5 мес. после 1-го опыта (долговременная память) была такой же, как в 1-м эксперименте. Однако «воспоминание» об обстановке данного теста у мышей обеих линий было выявлено – число эпизодов замирания (как аверсивной реакции на помещение в камеру) при повторном тесте было достоверно ниже, чем в 1-м эксперименте. Межлинейные различия («плюс» vs«минус») в тесте на неофагофобию были незначительными, и они показывают меньшую боязнь мышей «плюс» обстановки опыта (больше стоек, подходов к пище и время, занятое едой). Данные нового теста на внимание (с движущимися предметами) были сходными с таковыми по линиям БМ и ММ - мыши «плюс» активнее реагировали на предмет, показанных первым, чем мыши «минус», а к пятому предмету их активность снижалась, т.е. межлинейные различия в этом случае имели «обратный знак». В приподнятом крестообразном лабиринте (ПКЛ, тест на тревожность) оценивали поведение еще и мышей неселектированной популяции КоЭКС. Время, проведенное мышами «плюс» в светлых частях ПКЛ было длиннее, чем у мышей «минус» (р<0.001), но оно было достаточно большим и у мышей КоЭКС, хотя у них «неуспех» в решении когнитивного теста устойчиво проявлялся. Это может быть знаком того, что успешность решения когнитивного теста не связана напрямую с уровнем тревожности у мышей этих групп. Эксперименты с введением фармакологических препаратов мышам линий БМ, ММ, «плюс» и «минус». Введение атомоксетина (АТ, блокатор норадереналинового транспортера, в.бр. инъекции, 7 дн, 2 мг/кг, контроль – введение физ. р-ра) дало принципиально новые результаты. Основной из них - дифференциальное влияние АТ на успешность решения когнитивного тестау мышей БМ и ММ. Введение АТ вызвало замедление решения теста у БМ (р<0.001), по сравнению с контролем, а доля мышей, решивших стадии теста с пробкой была меньше (р<0.01). В контрольной группе мышей ММ ни одна мышь не решила теста с «пробкой», тогда как в группе после введения атомоксетина такие животные составили 18% (р<0.05). Иными словами, реакция мышей этих линий на успешность решения трудных стадий теста была противоположной. Двуфакторный ANOVA для показателей решения теста на «неисчезаемость» при лазе, закрытом пробкой (факторы «линия» и «воздействие») выявил не только влияние фактора "линия" (F1–2=27.75, p = 0.0000), но и достоверный уровень «взаимодействия факторов» (F1–2=36.31, p = 0.00000), что отражает противоположный эффект введения атомоксетина животным этих линий. Такая же закономерность обнаружилась и по суммарному числу эпизодов замирания во время теста на «неисчезаемость», их число у БМ было (р<0.001) выше после АТ, по сравнению с контролем, тогда как у мышей ММ в АТ-группе этот показатель был ниже (р<0.001) по сравнению с группой физ. р-ра. Это позволяет заключить, что между линиями мышей БМ и ММ существуют различия в организации норадренергических проекций (ствол мозга - передний мозг). Данные по введению АТ мышам «плюс» и «минус» (F8) из-за малой численности групп имеют предварительный характер, но, как и в случае линий БМ и ММ, основным эффектом АТ было его дифференциальное влияние на мышей и этих линий. После АТ у мышей «плюс» средние ЛП решения когнитивного теста были (недостоверно) дольше, и было меньше число подходов к лазу, тогда как у линии «минус» в группе после АТ показатели решения теста были выше (недостоверно). Иными словами, «рисунок» эффекта АТ был сходен с таковым у мышей БМ и ММ. Это позволяет предположить, что у обеих пар контрастных линий (БМ vs ММ и «плюс» vs «минус») система норадренергических проекций может иметь различия. При этом, по всей видимости, у мышей линии БМ и линии «плюс» существует некоторая ассоциация более успешного решения когнитивного теста и «знака» реакции на АТ – некоторое снижение успешности решения теста. Таким образом,использование двух пар линий мышей, контрастных по экспрессии способности к решению теста на «неисчезаемость» может быть перспективным в оценке генотипических особенностей на эффекты фармакологических препаратов.Отметим, что показатели теста на «внимание» после АТ имели такие же особенности. Было проведено сравнение влияния на решение мышами БМ и ММ (F 45) когнитивного теста прегабалина (влияние на ГАМК-ергическую систему, 10 мг/кг в/бр., предварительные данные). Показано ослабление успешности решения теста у мышей БМ и в незначительное улучшение успешности его решения у ММ. Введение фенибута (ФБ), действующего как агонист ГАМК, анализировали у мышей F8 линий «плюс» и «минус». ЛП решения 1-го предъявления теста с пробкой был несколько короче в группах после введения ФБ, причем у мышей «минус» - достоверно (р< 0.05). В группе «минус» после ФБ были мыши, решившие тест, тогда как у мышей этой линии в контрольной группе (физ. р-р) их не было ни одной. Следует также отметить, что межлинейные различия в контроле были достоверными. Эффекты введения АТ оценивали также в тесте «закрытого крестообразного лабиринта» (ЗКЛ). Был обнаружен целый ряд достоверных отличий поведения мышей ММ после АТ по сравнению с БМ, а общим заключением является то, что введение АТ сильнее изменило поведение мышей ММ в ЗКЛ, поскольку у них можно было заметить признаки «заторможенности» поведения, чего не наблюдалось у БМ. У мышей БМ и ММ оценивали влияние введения ФБ в тестах ЗКЛ и «скользкая воронка» (СВ) (последний является аналогом теста Порсолта). Полученные данные содержат подробную информацию об особенностях поведения мышей ММ после ФБ, однако общим заключением может быть то, что этот препарат вызывает усиление тревожности мышей ММ в обстановке ЗКЛ. В то же время в тесте СВ (который связан с помещением мыши в воду в горловине большой стеклянной воронки), в котором фиксировали 2 типа реакций на эту среду – пассивный и активный, более сильно выраженные реакции связанные со стремлением избавиться от пребывания в воде были зарегистрированы у мышей БМ после ФБ. Таким образом, как и в выполнении мышами 4 линий когнитивного теста, так и тестах, ориентированных на более «простые» проявления поведения, выявилось дифференциальное влияние препаратов, действующих на НА-ергическую систему (АТ) и на ГАМК-ергическую систему (ПГБ и ФБ). Заключение. На основании данных, полученных в экспериментах, результаты которых приведены выше, можно сделать ряд предварительных выводов. 1) У линий мышей с контрастными значениями успешности решения когнитивного теста на «неисчезаемость» (линии БМ vs MM и линии «плюс» vs «минус») данные различия обнаруживают значительную устойчивость в поколениях. Линии БМ и ММ (сохраняющие различия в весе мозга при разведении без поддерживающего отбора) различаются не только по способности к решению когнитивного теста на «неисчезаемость», но и, по-прежнему, обнаруживают различия в поведении, связанном с тревожностью. Новый тест на внимание с движущимися предметами позволил выявить межлинейные различия в успешности прослеживания движущегося предмета, проявляющиеся, в частности, в более адекватных изменениях реакции внимания у мышей БМ (у которых произошло снижение внимания к предмету, предъявленному последним). 2) Линии мышей «плюс» и «минус» в поколениях селекции обнаруживают не только устойчивые различия в успешности решения этого теста, а также обнаруживают более четкое проявление кратковременной рабочей памяти, а также (как и мыши БМ) более четко выраженное внимание в тесте с движущимися предметами. 3) Эксперименты с введением фармакологических препаратов разных групп (атомоксетин, прегабалин и фенибут) выявили дифференциальную реакцию мышей исследованных линий в ряде тестов. Это выразилось, в частности, в несколько большей реактивности (и позитивном влиянии на решение теста) у мышей двух линий, более слабо решающих когнитивный тест на «неисчезаемость» (т.е. у мышей линий ММ и «минус»). Поскольку атомоксетин прегабалин и фенибут (по данным медицинской фармакологии) имеют разные механизмы влияния на функцию ЦНС, данные результаты, несмотря на их предварительный характер, представляются перспективными, поскольку поддерживают современные представления о важности генотипических различий в оценке эффектов биологически активных соединений. | ||
2 | 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. | Генетические исследования когнитивных способностей животных на модели лабораторной мыши |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".