ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Проект направлен на разработку научной платформы для оптимизации свойств новых многофункциональных флуоресцентных биомаркеров на основе углеродных наночастиц (УНЧ) с целью их применения в медицине. Это подразумевает изучение молекулярных взаимодействий и механизмов взаимного влияния матрицы-растворителя и наночастиц на свойства друг друга, а также поиск подходов к управлению оптическими, сорбционными, суспензионными и др.свойствами в суспензиях и биосистемах для решения задач диагностики и терапии в медицине. Актуальность планируемых в данном проекте научных исследований непосредственно связана с уникальными свойствами углеродных наночастиц, обеспечивающими широкие возможности их применения в биологии и медицине. В отличие от органических красителей и полупроводниковых квантовых точек, используемых в качестве флуоресцентных маркеров, такие УНЧ, как наноалмазы (НА) и углеродные квантовые точки (УКТ, или окисленные графитовые нанокластеры), являются биосовместимыми и нетоксичными, обладают интенсивной фотостабильной флуоресценцией при комнатной температуре и способностью к модификации их поверхности в соответствии с конкретной решаемой задачей. Эти свойства обуславливают возможность создания хорошо диспергируемых углеродных нанокомпозитов, которые обладают высокой вместимостью лекарств, позволяют проводить тонкую настройку на адресное лечение, сохраняя при этом стабильные флуоресцентные свойства. Эти свойства делают УКТ и НА гораздо более привлекательными в качестве биомедицинских агентов по сравнению с другими наноматериалами – металлическими, керамическими, полимерными. Поэтому УНЧ постепенно становятся основным материалом для создания нетоксичных и фотостабильных флуоресцентных маркеров, адсорбентов, носителей лекарственных препаратов. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в области бионаномедицины за последнее десятилетие, проблема оптимизации свойств УНЧ для получения максимального терапевтического эффекта и их безопасности остается чрезвычайно актуальной на сегодняшний день. Очевидно, что проблемы оптимизации свойств УНЧ и управления ими могут быть решены только в результате всестороннего изучения природы флуоресцентных и сорбционных свойств УНЧ, механизмов взаимодействия и взаимного влияния матрицы-растворителя и наночастиц на свойства друг друга. Понимание механизмов взаимодействия УНЧ и окружающих биомакромолекул позволит решить основную задачу проекта - создать научную платформу для разработки новых наноагентов на основе УНЧ, сочетающих в себе одновременно свойства флуоресцентного биомаркера и адсорбента/носителя лекарств. Помимо оптимизации свойств УНЧ, необходимых для максимального тераностического эффекта и разработки методов управления ими, в рамках данного проекта будет решена задача оптической визуализации углеродных наноагентов в биологическом материале. Для этого планируется привлечь адаптивные методы анализа данных, в частности, технику искусственных нейронных сетей. Разработанные методы визуализации УНЧ в биосистемах позволят сделать выводы о пространственном и временном распределении наночастиц в биологическом материале, об эффективности адресной доставки лекарственных препаратов, о выведении наночастиц из организма. Наконец, эти методы позволят решать проблемы применения наночастиц и оценки их токсичного влияния на здоровье человека и окружающую среду, которые становятся актуальными в связи с широким применением нанотехнологий. Для решения поставленных задач в рамках данного проекта планируется следующее: 1. Изучение физико-химических и оптических свойств УНЧ в водных суспензиях и биологических системах, что включает в себя: 1.1. Исследование природы флуоресцентных свойств УНЧ 1.2. Установление механизмов адсорбции ионов и биомакромолекул на поверхность углеродных наночастиц, изучение конкурирующих адсорбционных процессов в растворах и сложных биологических системах. 1.3. Изучение взаимодействий функциональных поверхностных групп УНЧ и нанокомпозитов с растворителем и биомакромолекулами, а также влияния молекулярных взаимодействий на оптические, адсорбционные и суспензионные свойства наночастиц. Такие исследования будут проводиться методами оптической спектроскопии - корреляционной спектроскопии, спектроскопии поглощения, флуоресцентной спектроскопии, спектроскопии комбинационного рассеяния (КР) и ИК поглощения света. 2. Разработка принципов целенаправленной модификации функциональной поверхности УНЧ и синтеза на их основе новых нанокомпозитов с управляемыми свойствами флуоресценции, адсорбции, диспергируемости. 3. Разработка методов эффективного детектирования флуоресцирующих наноматериалов в биологических объектах: решение обратных задач оптической визуализации по флуоресценции УНЧ на фоне аутофлуоресценции биоматериала с помощью искусственных нейронных сетей. 4. Апробация новых наноматериалов в биологических объектах в качестве флуоресцентных биомаркеров и носителей лекарств/адсорбентов. В рамках данного проекта впервые поставлена задача научного подхода к созданию многофункционального биомаркера на основе углеродных наночастиц, сочетающего в себе одновременно свойства флуоресцентного маркера и адсорбента/носителя лекарств. Имеющийся у исполнителей проекта – групп Физического факультет МГУ, ИОФ РАН и НИИЯФ МГУ - опыт и научный задел в области колебательной и флуоресцентной спектроскопии и решении обратных задач, материальная база и результаты исследований последних лет являются залогом успешного выполнения данного проекта.
The project is aimed to elaboration of scientific platform for optimization of properties of new multifunctional fluorescence biomarkers on the basis of carbon nanoparticles (CNP) for application in medicine. It assumes a study of molecular interactions and mechanisms of mutual influence of matrix-solvent and nanoparticles on properties of each other and also a search of approaches to control of optical, sorption, suspension and other properties of CNP in suspensions and biosystems for solution of problems of diagnostics and therapy in medicine. Urgency of planned in the given project scientific researches is connected directly with the unique properties of CNP which provide wide opportunities of their application in biology and medicine. In contrast with organic dyes and semiconductor quantum dots used as fluorescence markers such CNP as nanodiamonds (ND) and carbon quantum dots (CQD) are biocompatible and non-toxic, they have intensive stable fluorescence at the room temperature and their surface can be modified in accordance with concrete task. These properties provide a possibility of creation of easily dispersed nanocomposites on the base of mentioned CNP which have high drug capacity and are targeted on certain cells. They allow one to perform fine tuning for targeted therapy while keeping fluorescence properties. These properties make CQD and ND much more attractive as biomedical agents in comparison with the other nanomaterials – metallic, ceramic, polymeric. That is why CNP gradually become the main material for creation nontoxic and photostable fluorescent markers, adsorbents, drug-carriers. Despite significant progress achieved in the field of biomedicine during last decade, the problem of optimization of CNP properties for obtaining maximal therapeutic effect and their safety is very actual now. It is obvious that the problems of optimization of CNP properties and their control can be solved only as a result of complete study of nature of fluorescence and sorption properties of CNP, mechanisms of interactions and mutual influence of matrix-solvent and nanoparticles on these properties of nanoparticles. Understanding of mechanisms of interaction of CNP and surrounding biomacromolecules will allow one to solve the basic problem of the project – to create the scientific platform for elaboration of new nanoagents on the basis of CNP combining simultaneously the properties of fluorescence biomarker and adsorbent/drug carrier. Besides the optimization of properties of CNP which are necessary for maximal theranostic effect, and the elaboration of the methods of control of them, within the frameworks of the given project the problem of optical visualization of carbon nanoagents in biological material will be solved. For this it is planned to apply adaptive methods of data analysis, in particular, the technique of artificial neural networks. Elaborated methods of visualization of CNP in biosystems will allow one to make conclusions about spatial and temporal distribution of nanoparticles in biological material, about efficiency of targeted drug delivery, about excretion of nanoparticles from the organism. At last, these methods will allow one to solve the problems of use of nanoparticles and estimation of their toxic influence on environment and human health, which become actual in connection with wide application of nanotechnologies. For solution of the specified task it is necessary the following: 1. Study of physical-chemical and optical properties of CNP in water suspensions and biological systems which includes: 1.1. Study of nature of fluorescence properties of CNP. 1.2. Establishment of mechanisms of absorptions of ions and biomacromolecules on the surface of carbon nanoparticles, study of competing absorption processes in suspensions and complex biological systems. 1.3. Study of interactions of surface functional groups of CNP and nanocomposites with solvent and biomacromolecules and also influence of molecular interactions on optical, adsorption, and suspension properties of nanoparticles. These studies will be carry out using methods of optical spectroscopy – correlation spectroscopy, absorption spectroscopy, fluorescence spectroscopy, Raman spectroscopy and spectroscopy of IR absorption. 2. Elaboration of principles of targeted modification of functional surface of CNP and synthesis on their basis of new nanocomposites with controllable fluorescence, adsorption, dispersion properties . 3. Elaboration of methods of effective detection of fluorescence nanomaterials in biological objects: solution of inverse problems of optical visualization using fluorescence of CNP on the background of autofluorescence of biomaterial with the help of artificial neural networks. 4. Approbation of new nanomaterials in biological objects as fluorescence biomarkers and drug carrier/adsorbent.
В рамках выполнения работ по проекту будет разработана научная платформа для создания новых многофункциональных агентов на основе углеродных наночастиц (УНЧ) с целью их применения в медицине. В результате проведенных исследований по изучению молекулярных взаимодействий и механизмов взаимного влияния матрицы-растворителя и наночастиц на свойства друг друга будут разработаны принципы целенаправленной модификации поверхности УНЧ, позволяющей управлять этими свойствами в суспензиях и биосистемах. Это позволит синтезировать новые УНЧ и нанокомпозиты с заданными адсорбционными и флуоресцентными свойствами. В настоящее время в мировой науке не существует научной платформы для управления уникальными свойствами УНЧ. В рамках данного проекта будут также разработаны методы оптической визуализации тераностических агентов в биологических системах. Впервые такие обратные задачи будут решены с помощью искусственных нейронных сетей. Результаты работ по выполнению проекта будут опубликованы в журналах (планируется публикация 14 статей) и доложены на международных конференциях; включены в курсы лекций, семинаров и практических работ на физическом факультете МГУ. Результаты научных исследований, проведенных в рамках данного проекта, будут способствовать решению фундаментальных проблем современной физики наноструктур - выяснению природы оптических и сорбционных свойств углеродных наночастиц. Помимо этого, в процессе выполнения проекта будут разработаны новые нанотехнологии, новые наноматериалы и новые методы оптической визуализации, которые позволят изучать возможности транспорта биомакромолекул и веществ с помощью наночастиц-носителей через мембраны к биологическим мишеням; изучать влияние наночастиц-адсорбентов на сложноорганизованные биологические системы, развивать сверхчувствительные и высокопроизводительные методы быстрой детекции белков, генов, клеток.
В результате совместной работы исполнителей проекта было сделано следующее: 1. Установлено, что УНЧ взаимодействуют с молекулами протонных растворителей в суспензиях, изменяя силу и динамику водородных связей. Эти взаимодействия проявляются в изменении положения и формы валентных полос растворителей воды в спектрах КР. Обнаружено, что сила взаимодействий УНЧ с растворителями зависит от функционализации поверхности УНЧ. Водородные связи, образующиеся между поверхностью УНЧ и молекулами растворителя, существенным образом изменяют флуоресцентные свойства УНЧ: чем сильнее водородные связи, тем слабее флуоресценция УНЧ в суспензии. 2. Экспериментально исследованы адсорбционные свойства и определены количественно адсорбционные активности исходных и модифицированных детонационных НА по отношению к ионам тяжелых металлов с помощью методов корреляционной спектроскопии, спектроскопии поглощения, спектроскопии КР и ИК поглощения. Выяснены механизмы адсорбции наночастиц: при адсорбции катионов превалирующую роль играет физическая адсорбция, а при адсорбции анионов – химическая адсорбция. 3. Разработан новый метод управляемого синтеза нанокомпозитов «алмаз-мезопористый оксид кремния» заданного размера на основе различных классов детонационных и флуоресцентных наноалмазов. 4. Разработаны методики получения спектров флуоресценции наночастиц алмаза и нанокомпозитов «алмаз-мезопористый оксид кремния», введенных в живую клетку. 5. Разработан новый метод функционализации УКТ, обеспечивающий надежное удержание лекарственных препаратов на поверхности УКТ. Разработаны методики получения спектров флуоресценции УКТ с прикрепленными лекарствами, введенных в живую клетку. 6. Впервые методом высокого давления синтезированы сильно-легированные бором наноалмазы с размером кристаллитов менее 10 нм. Обнаружены особенности во взаимодействиях НА, легированных бором, с молекулами воды по сравнению с детонационными НА.
Основной задачей Проекта являлась выработка рекомендаций по созданию углеродных наночастиц (УНЧ) с оптимальными суспензионными, фотолюминесцентными и сорбционными свойствами для их применения в качестве тераностических наноагентов в биомедицине. В качестве объектов исследования выступали: 1) наноалмазы (НА) детонационного метода синтеза (ДНА) - необработанные; очищенные посредством кипячения в смеси кислот – ДНАн с разными функциональными группами на поверхности (ДНА-поли, ДНА-СООН, ДНА-ОН, ДНА-Н); 2) наноалмазы RayND, полученные методом лазерной абляциии - необработанные; очищенные посредством кипячения в смеси кислот; 3) наноалмазы размером 20 нм ND20, полученные методом дробления CVD алмазов; 4) наноалмазы, декорированные углеродными точками (ДНА+УТ1); 5) углеродные точки типа 1 (УТ1) – оксиды нанографена, полученные методом Хаммерса; углеродные точки типа 2 (УТ2) – углеродные точки, синтезированные из лимонной кислоты (УТ2-Л) или транс-аконитовой кислоты (УТ2-ТА) и водного раствора аммиака. Все УНЧ в порошкообразном виде были охарактеризованы с помощью просвечивающих электронных микроскопов, конфокальной спектроскопии комбинационного рассеяния (КР) и фотолюминесцентной спектроскопии. Функциональный покров УНЧ исследовался методом спектроскопии ИК поглощения. Для всех приготовленных суспензий УНЧ методом динамического светорассеяния (ДСР) определялись размеры наночастиц в суспензии, измерялись дзета-потенциал и показатель рН. Полученные результаты свидетельствуют о хорошей коллоидной стабильности всех УНЧ в воде, этаноле и метаноле на протяжении, как минимум, полугода. На основании результатов, полученных в рамках выполнения Проекта, можно сформулировать следующие принципы оптимизации свойств УНЧ и управления ими. 1. Фотолюминесцентные свойства УНЧ. 1.1. Интерфейс «алмазное ядро – неалмазная фаза углерода». Были исследованы фотолюминесцентные свойства НА различного метода синтеза, поверхность которых очищалась различными способами: посредством кипячения в смеси серной и азотной кислот, в хлорной кислоте, отжига, озонирования. Изменение количества неалмазной фазы углерода (НФУ) на поверхности НА контролировалось с помощью конфокальной спектроскопии КР и спектроскопии ИК поглощения. Расчеты показали, что чем больше на поверхности НФУ, тем сильнее ФЛ образцов. Измерения квантовых выходов ФЛ НА в воде, подвергшихся различному времени очистки поверхности, а также УНЧ с различным содержанием НФУ на поверхности – ДНА+УТ1 и УТ1 - также подтвердили существенную зависимость интенсивности ФЛ УНЧ от количества НФУ на поверхности наночастиц. Как следует из полученных результатов, для усиления ФЛ свойств ДНА в процессе очистки их поверхности целесообразно обеспечить большое количество НФУ на поверхности наночастиц. Это подтверждают проведенные исполнителями Проекта эксперименты и сравнительный анализ суспензионных, адсорбционных и фотолюминесцентных свойств ДНА и ДНАн. Было установлено, что большее количество НФУ на поверхности ДНАн не только усиливает ФЛ ДНА, но и обеспечивает высокие адсорбционные и суспензионные свойства новых наночастиц. Варьируя количеством НФУ на поверхности наноалмаза, можно управлять его ФЛ. Для этого нужно подобрать соответствующие условия очистки наночастиц: например, для кипячения в смеси кислот необходимо установить оптимальные соотношение кислот, время и температуру кипячения. Это уже самостоятельная многопараметрическая задача. 1.2. Интерфейс «алмазное ядро/НФУ – функциональные группы на поверхности». Для исследования влияния на ФЛ УНЧ функционального покрова были получены спектры КР и ФЛ водных суспензий ДНА-поли, ДНА-СООН, ДНА-ОН, ДНА-Н в широком диапазоне концентраций ДНА. Рассчитанные зависимости параметров ФЛ F0 (отношение площадей под кривыми ФЛ и валентной полосы КР воды) от концентрации наночастиц показали, что ФЛ ДНА зависит от типа функциональных поверхностных групп, а именно, для ДНА в водных суспензиях можно построить следующий ряд по уменьшению ФЛ ДНА в зависимости от поверхностного покрова: ДНА-Н >> ДНА-ОН ≥ ДНА-поли > ДНА-СООН (1) Зависимость (1) была объяснена с точки зрения суперпозиции индуктивного и мезомерного электронных эффектов при образовании ковалентной связи между атомами с различной электроотрицательностью и подтверждена теоретическими расчетами. Для сравнения степени влияния НФУ и типа функциональных поверхностных групп на ФЛ УНЧ были измерены значения квантовых выходов ФЛ водных суспензий 1) ДНА и ДНА+УТ1 в процессе очистки их поверхности и 2) водных суспензий ДНА-поли, ДНА-СООН, ДНА-ОН, ДНА-Н. Результаты показали, что посредством очистки квантовый выход можно изменить от минимального до возможно максимального, а изменением типа функциональных групп - примерно на 30-35 %. Таким образом, зависимость ФЛ УНЧ от типа поверхностных функциональных групп менее существенна по сравнению с зависимостью ФЛ наночастиц от количества НФУ на их поверхности. В соответствии с результатами объяснения поверхностной ФЛ УНЧ с точки зрения проявления суперпозиции индуктивного и мезомерного электронных эффектов при ковалентном связывании функциональных групп и поверхности ДНА для усиления ФЛ УНЧ следует учитывать электроотрицательность атомов конкретных функциональных групп. То есть, выбирая функциональные группы с соответствующей электроотрицательностью, можно управлять ФЛ функционализированных УНЧ. 1.3. Интерфейс «функциональные группы – молекулы окружения» Было обнаружено, что окружающие в суспензии УНЧ молекулы влияют на ФЛ наночастиц. Более того, сами УНЧ при суспензировании изменяют структуру и связанность молекул в растворителе, а молекулы окружения, взаимодействуя с поверхностными группами УНЧ, в свою очередь, изменяют ФЛ наночастиц. В воде в присутствии УНЧ существенно изменяется сила водородных связей. В результате теоретических расчетов и проведенных экспериментов было установлено, что это взаимовлияние также является результатом суперпозиции индуктивного и мезомерного электронных эффектов при ковалентном связывании функциональных групп и поверхности ДНА. 1.4. Эксперименты по исследованию ФЛ УНЧ в биоматериале (куриный белок, урина) показали, что многие биомолекулы и ферменты хорошо адсорбируются на поверхность УНЧ. При этом ФЛ УНЧ возрастает благодаря экранированию поверхности УНЧ от молекул воды, которая является мощным тушителем ФЛ. 2. Адсорбционные свойства ДНА, ДНАн, ДНА+УТ1 и УТ1. Если УТ обладают более интенсивной ФЛ по сравнению с ДНА, ДНАн и ДНА+УТ1, то ДНА, ДНАн и ДНА+УТ1 обладают более высокими адсорбционными свойствами (по отношению к ионам, ферментам, биомолекулам, лекарствам) по сравнению с УТ. К сожалению, причины такого различия в адсорбционных свойствах УТ и ДНА требуют дальнейшего исследования. Эксперименты и проведенный сравнительный анализ адсорбционной активности ДНА с различной функционализацией свидетельствуют о том, что ДНА, ДНАн и ДНА+УТ1 с поверхностными карбоксильными группами обладают более высокими адсорбционными свойствами, чем УНЧ с другой функционализацией. Они могут быть основой для комплексов на основе ДНА и ДНА+УТ, к которым посредством физической адсорбции прикрепляются лекарственные препараты и ферменты. 3. Суспензионные свойства ДНА и ДНА+УТ1. В результате проведенных исследований было установлено, что полярность растворителей слабо влияет на суспензионные свойства ДНА. Суспензионные свойства ДНА и ДНА+УТ1 резко повышаются при добавлении небольших количеств ПАВ в суспензию. При этом степень дезагрегации наночастиц зависит от того, гидрофобная или гидрофильная их поверхность. В суспензиях УНЧ с гидрофобной поверхностью дезагрегация происходит активнее. Установлено, что на уже образовавшиеся мицеллы в суспензиях наноалмазы не оказывают существенного влияния. Этот вывод свидетельствует о безопасности взаимодействия наноалмазов с клетками, т.к. можно ожидать, что они не будут разрушать бислои клеточных покровов. Исследования показали, что ДНАн с карбоксилированной поверхностью являются перспективными наноагентами для применения в биомедицине. Карбоксильные группы обладают наибольшей биосовместимостью, они обеспечивают наиболее высокие адсорбционные свойства по отношению к ионам тяжелых металлов, биомолекулам и лекарствам из всех исследованных групп, в том числе, надежно удерживают покрытия из сополимеров при синтезе нанокомпозитов. Наибольшее ослабление ФЛ УНЧ с карбоксилированной поверхностью в воде компенсируется увеличением ФЛ в биоткани. В рамках выполнения работ по Проекту были получены устойчивые фотолюминесцентные нанокомплексы: ДНА+лизоцим, ДНА+доксорубицин, (ДНА+УТ1)+доксорубицин, ДНА+дексаметазон и нанокомпозиты ДНА+SiО2+дексаметазон – и изучены их свойства. Была продемонстрирована устойчивость комплексов, отсутствие цитотоксичности, установлено, что интенсивность ФЛ УНЧ в комплексах возрастает по сравнению с ФЛ носителей. Проверка УНЧ на цитотоксичность проводилась на клетках MCF-7 с помощью колориметрического теста MTT. Были проведены исследования по сравнению ферментативной активности свободного и адсорбированного на поверхность ДНА лизоцима. Как следует из полученных результатов, лизоцим сохраняет ферментативную активность при адсорбции на поверхность ДНА как в один слой, так и менее чем в один слой. В результате исследований установлено, что все полученные нанокомплексы и нанокомпозиты являются достаточно перспективными для применения их в биомедицине. В процессе исследований проводились работы по оптической визуализации УНЧ в биоматериале с помощью конфокальной фотолюминесцентной микроскопии и STED. Полученные изображения ФЛ исследованных УНЧ в клетках HeLa и MDA-MB-231 демонстрируют их принципиальную применимость в качестве фотолюминесцентных маркеров в биоткани. В рамках выполнения Проекта был разработан метод контроля выведения из организма нанокомпозитов и их компонентов с уриной на примере нанокомпозита УТ1+соп+ФК (УТ1, покрытые сополимером (PEG) и полиэтиленимином (PEI), к которому прикреплена фолиевая кислота (ФК)). Сравнительный анализ квантовых выходов и параметров F0 показал, что покрытие УТ1 сополимером и ФК не вызывает тушения ФЛ наночастиц в воде. Для решения поставленной задачи применялись искусственные нейронные сети (ИНС): многослойный персептрон, вейвлет-анализ и самоорганизующаяся карта Кохонена. Наилучшие результаты в решении задачи обеспечила ИНС с архитектурой многослойного персептрона. Таким образом, был предложен новый подход к реализации оптической визуализации люминесцентных наночастиц в биоматериале с помощью искусственных нейронных сетей. Результаты работ по выполнению Проекта были опубликованы в 51 публикации. Этот список публикаций содержит: 18 статей, из которых 16 статей в журналах, индексированных в Web of Science, Scopus (14 статей в Web of Science, 14 статей в Scopus, 4 статьи в квартиле Q1), 18 статей в журналах, индексированных РИНЦ; 2 статьи в сборниках материалов конференции и 31 тезис на конференциях. Результаты были доложены в 36 докладах на 23 международных конференциях (4 приглашенных доклада, 11 устных и 21 постерный доклад), а также добавлены в лекции для студентов и аспирантов физического факультета МГУ.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 20 апреля 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Оптимизация свойств новых тераностических углеродных наноагентов - этап 2017 г. |
Результаты этапа: В отчетном году проводились работы по подготовке/характеризации углеродных наночастиц (УНЧ) к проведению запланированных исследований, а также сами исследования суспензионных, адсорбционных и флуоресцентных свойств УНЧ в зависимости от молекулярных взаимодействий УНЧ с окружающей средой. В рамках выполнения Проекта проводилась разработка метода оптической визуализации УНЧ в биоткани с помощью искусственных нейронных сетей (ИНС). В дополнение к запланированным на 2017 г. работам по созданию метода оптической визуализации УНЧ в биосистеме были не только получены базы экспериментальных данных для решения обратных задач флуоресцентной спектроскопии с помощью (ИНС), но и полностью решены задачи классификации и определения концентрации углеродных нанокомпозитов и их компонентов в биоткани. Были достигнуты следующие научные результаты: 1. Охарактеризованы и подготовлены к проведению запланированных исследований следующие углеродные наночастицы: детонационные наноалмазы (ДНА) с полифункциональной поверхностью (ДНА-пф) и с поверхностью, модифицированной следующими функциональными группами: СООН, ОН, Н, Cl; наноалмазы, легированные азотными вакансными центрами (НА-NV) и бором (НАЛБ); окислы графита - углеродные точки (УТ), синтезированные методом Хаммерса. Все образцы, использованные в исследованиях, проводимых в отчетном году, были проверены и охарактеризованы в порошкообразном виде с помощью просвечивающей электронной микроскопии, конфокальной спектроскопии КР и флуоресцентной спектроскопии. 2. Получены зависимости суспензионных, флуоресцентных и сорбционных свойств исходных и модифицированных УНЧ в суспензиях от характеристик наночастиц и окружающей среды. 2.1. В результате исследования суспензионных свойств УНЧ в зависимости от их концентрации, типа функциональных поверхностных групп ДНА, от полярности растворителей и концентрации поверхностно-активных веществ (ПАВ) в суспензии на данном этапе установлено следующее: а) Все исследованные наночастицы образуют стабильные суспензии в воде, этаноле и метаноле в диапазоне концентраций до 1-2 г/л. б) С увеличением концентрации НА от 0 до 1 г/л размеры наночастиц изменяются в пределах ошибки, а дзета-потенциалы наночастиц увеличиваются по модулю на 13-18%. в) Агрегация ДНА в суспензиях зависит от типа функциональных поверхностных групп НА. г) В этаноле и метаноле наблюдается незначительная агрегация ДНА. д) Присутствие ПАВ, в том числе, с концентрацией, большей концентрации мицеллообразования, оказывает существенное влияние на суспензионные свойства НА в воде. Результаты этих исследований описаны в публикациях: http://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/1536383X.2017.1354291 https://elibrary.ru/item.asp?id=29429640 2.2. В результате исследования зависимостей эффективности и стабильности флуоресцентных свойств исходных и модифицированных УНЧ в суспензиях от концентрации наночастиц, типа их поверхностных групп, полярности растворителей, а также от присутствия в суспензиях ионов и молекул ДНК, обнаружено следующее: 1) В водных суспензиях при изменении концентрации НА и УТ от 0 до 5 г/л интенсивность флуоресценции УНЧ не достигает насыщения: флуоресценция растет с ростом концентрации частиц. 2) Интенсивность флуоресценции ДНА зависит от типа функциональных поверхностных групп, а именно, получен следующий ряд по уменьшению флуоресценции ДНА в зависимости от поверхностного покрова: ДНА-Н > ДНА-СООН > ДНА-пф > ДНА-ОН > ДНА-Cl 3) Флуоресцентные свойства ДНА-СООН и УТ (обнаружено ранее) существенно зависят от полярности растворителя: при одной и той же концентрации УНЧ интенсивнее всего флуоресцируют в наименее полярном растворителе – этаноле/изопропаноле, а в самом полярном растворителе – воде – интенсивность их флуоресценции наименьшая. Результаты этих исследований описаны в публикациях: http://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/1536383X.2017.1354291 https://elibrary.ru/item.asp?id=29429640 4) В присутствии солей Cu(NO3)2, NaNO3, KNO3, Na2SO4 и CuSO4 в водных суспензиях ДНА-СООН флуоресценция наночастиц существенно увеличивается. Основное усиление флуоресценции ДНА обеспечивают анионы: нитрат-анионы усиливают флуоресценцию больше, чем сульфат-анионы. 5) В результате взаимодействия молекул ДНК с поверхностью ДНА-СООН 5, ДНА-СООН 10, НА-NV флуоресценция НА увеличивается на 1%, 49% и 15%, соответственно. Результаты этих исследований описаны в публикации: Vervald E.N., Laptinskiy K.A., Vlasov I.I., Shenderova O.A., Dolenko T.A. DNA-Nanodiamond Interaction Effect on Nanodiamond Fluorescence. Nanosystems: Physics, Chemistry, Mathematics (2018 г.) 2.3. Определена адсорбционная активность НА в суспензиях по отношению к ионам, в том числе, тяжелых металлов, и ДНК в зависимости от концентрации наночастиц и типа их поверхностных групп. 1) В результате исследования адсорбции солей NaNO3, KNO3, Cu(NO3)2, CuSO4 и Na2SO4 на поверхность ДНА-СООН установлено, что: а) Адсорбция катионов возрастает в ряду Cu2+>K+>Na+. б) Анионы гораздо активнее катионов адсорбируются на поверхность ДНА-СООН. в) Нитрат-анионы адсорбируются активнее сульфат-анионов. Дополнительно к запланируемым исследованиям был проведен анализ спектров ИК поглощения ДНА с адсорбируемыми ионами. Установлено, что при адсорбции нитрат-анионов превалирует химическая адсорбция, все остальные исследованные ионы взаимодействуют с поверхностью ДНА-СООН посредством физической адсорбции. Обнаружена корреляция между эффективностью адсорбции ионов на поверхность ДНА и изменением флуоресценции наночастиц: чем активнее ионы адсорбируются, тем интенсивнее флуоресценция детонационных наноалмазов в воде. 2) В результате изучения взаимодействий ДНК с поверхностью ДНА-СООН 10, ДНА-СООН 5 и НА-NV оценена активность взаимодействия ДНА с каждым из указанных НА. Установлено, что активнее всего с ДНК взаимодействует НА-NV. Обнаружена корреляция между эффективностью взаимодействия и изменением флуоресценции ДНА: чем активнее ДНК взаимодействуют с ДНА, тем интенсивнее флуоресценция ДНА в воде. Дополнительно к запланированным исследованиям проведен анализ спектров ИК провзаимодействовавших ДНК и ДНА. Установлено, что молекулы ДНК и наноалмазы взаимодействуют посредством физической адсорбции. Результаты этих исследований описаны в публикации: Vervald E.N., Laptinskiy K.A., Vlasov I.I., Shenderova O.A., Dolenko T.A. DNA-Nanodiamond Interaction Effect on Nanodiamond Fluorescence. Nanosystems: Physics, Chemistry, Mathematics (2018 г.) 2.4. С помощью лазерной спектроскопии КР исследованы межмолекулярные взаимодействия функциональных поверхностных групп НА с растворителем и биомакромолекулами, а также влияние молекулярных взаимодействий на оптические, сорбционные и суспензионные свойства наночастиц. На основании сравнительного анализа зависимостей количественных характеристик валентных полос ОН-групп водных суспензий исходных и модифицированных ДНА от их концентрации получен следующий ряд по степени ослабления ими водородных связей в воде: ДНА-Н > ДНА-СООН > ДНА-пф > ДНА-ОН > ДНА-Cl. Установлено, что: а) Наноалмазы ослабляют силу водородных связей в воде, причём, гидрофобные наноалмазы делают это значительно эффективнее гидрофильных. б) Растворённый в воде ПАВ экранирует влияние наноалмазов на объёмную воду: эффект проявляется для гидрофильных наноалмазов до мицеллообразования, для гидрофобных – при образовании мицелл. Результаты этих исследований описаны в публикации: Vervald A.M., Burikov S.A., Vlasov I.I., Shenderova O.A., Dolenko T.A. Interactions of Nanodiamonds and Surfactants in Aqueous Suspensions Nanosystems: Physics, Chemistry, Mathematics (2018 г.) Установленные закономерности влияния различных функциональных поверхностных групп ДНА на водородные связи в суспензии позволили объяснить обнаруженные изменения флуоресцентных свойств наночастиц в зависимости от характеристик наночастиц и их окружения. 3. На основании сравнительного анализа исследованных свойств УНЧ и обнаруженных закономерностей на данном этапе выработаны предложения по целенаправленному модифицированию функционального покрова НА для оптимизации сорбционных, суспензионных и флуоресцентных свойств наночастиц в суспензиях и биологических системах. Из всех исследованных образцов на данный момент наиболее оптимальным с точки зрения применения в медицине является ДНА-СООН. 4. С помощью искусственных нейронных сетей решены задачи мониторинга выведения из организма нанокомпозитов на основе УТ и их компонентов. На данном этапе выполнения Проекта была не только получена база экспериментальных данных, как было запланировано, но и полностью решены две задачи мониторинга выведения из организма нанокомпозитов и их всевозможных компонентов. С помощью нейросетевых методов определялось, какие наночастицы – сами нанокомпозиты и/или его компоненты (задача классификации) - и в каком количестве (задача регрессии) находятся в человеческой урине. В качестве объекта исследования использовались не просто наночастицы, а нанокомпозиты на основе УТ, представляющие собой УТ, покрытые сополимером - полиэтиленгликолем (PEG) и полиэтиленимином (PEI), к которому прикреплена фолиевая кислота (ФК). Фолиевая кислота играет роль блокатора раковой экспрессии мембранного белка - рецепторов фолиевой кислоты альфа. Применение искусственных нейронных сетей для решения задачи классификации нанокомпозитов и их компонентов в урине обеспечивает процент правильного распознавания, усредненный по всем пяти классам, равный 72.3%. Результаты описаны в публикации: http://dx.doi.org/10.1007/978-3-319-63940-6/_24 Наилучшая средняя абсолютная ошибка определения концентрации наночастиц в урине, полученная с помощью нейросетевого метода, составила 0.26 мг/л для нанокомпозита УТ+соп+ФК, 0.41 мг/л для УТ+соп, 0.45 мг/л для ФК. Это составляет 12.1%, 19.1% и 20.9% от максимального содержания наночастиц в урине, соответственно. Результаты описаны в публикации: http://dx.doi.org/10.21469/22233792.3.4.01 http://jmlda.org/papers/doc/2017/no4/Isaev2017Estimation.pdf 5. В отчетном году были опубликованы/приняты к печати 14 печатных работ по результатам выполнения Проекта, в том числе, 1 статья опубликована в журнале, индексируемом Web of Science/Scopus и РИНЦ, 2 статьи приняты к печати в журналах, индексируемых Web of Science и РИНЦ, 1 статья опубликована в трудах международной конференции, индексируемой Scopus и РИНЦ, 1 статья опубликована в журнале, индексируемом РИНЦ, 1 статья опубликована в трудах международной конференции, индексируемой РИНЦ, 8 тезисов докладов на международных конференциях. Полученные в ходе выполнения Проекта результаты были представлены на 7 международных конференциях в 10 докладах, из них 1 – приглашенный доклад, 3 – устных доклада, 6 – стендовых. | ||
2 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Оптимизация свойств новых тераностических углеродных наноагентов - этап 2018 г. |
Результаты этапа: Были достигнуты следующие научные результаты: 1. К проведению запланированных исследований подготовлены следующие УНЧ: Серия 1: Детонационные наноалмазы (ДНА) с полифункциональной поверхностью (ДНА-пф) и с поверхностными функциональными группами СООН, ОН, Н. Серия 2: Наноалмазы линии RayND, полученные лазерной абляцией, с различной функционализацией поверхности. Серия 3: Наноалмазы, легированные азотными вакантными центрами (НА-NV) с размерами 16 нм и бором (НАЛБ). Образец 4: Наноалмазы, декорированные углеродными точками (ДНА+УТ), по рекомендации исполнителей Проекта с целью совместить интенсивные фотолюминесцентные свойства УТ с селективными адсорбционными свойствами ДНА. 1.1. Все образцы, использованные в исследованиях, проверены и охарактеризованы в порошкообразном виде с помощью просвечивающей электронной микроскопии, конфокальной спектроскопии КР и спектроскопии ИК поглощения. 1.2.-1.3. Исследованы суспензионные, сорбционные и фотолюминесцентные (ФЛ) свойства водных суспензий всех образцов и проведен сравнительный анализ этих свойств. Обнаружено, что НА, полученные лазерной абляцией, сильнее агрегируют в воде по сравнению с ДНА. Значения дзета-потенциалов всех УНЧ в воде свидетельствуют о возможности приготовления водных суспензий исследованных УНЧ с высокой стабильностью. Добавление ПАВ в суспензию оказывает существенное, но различное влияние на суспензионные свойства НА с гидрофильной и гидрофобной поверхностями. Анализ результатов фотолюминесцентной спектроскопии и спектроскопии КР водных суспензий ДНА-пф и RayND показал, что 1) интенсивность ФЛ не зависит от метода синтеза НА; 2) ФЛ НА зависит от способа очистки наночастиц; 3) интенсивность ФЛ наночастиц в воде зависит от степени взаимодействий их поверхностных функциональных групп с молекулами воды, а именно, от силы водородных связей в среде. Теоретически и экспериментально были рассчитаны численные значения изменения энергии водородных связей в водных суспензиях ДНА в результате взаимодействий различных функциональных поверхностных групп ДНА с молекулами воды. Результаты этих исследований описаны в публикации: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jrs.5524 В результате изучения адсорбционных свойств образцов Серий 1,2 и 4 в воде по отношению к ионам солей Cu(NO3)2, Pb(NO3)2, Cu(CH3COO)2 и Pb(CH3COO)2 и молекулам ДНК была определена адсорбционная активность НА в суспензиях по отношению к каждому адсорбату. Адсорбционная активность зависит от функционализации поверхности. Обнаружено, что анионы адсорбируются на поверхность НА гораздо активнее катионов. Эффективность адсорбции катионов металлов и нитрат-анионов во на поверхность ДНА выше, чем на поверхность НА линии RayND. Однако НА линии RayND эффективнее взаимодействуют с молекулами ДНК по сравнению с ДНА и ДНА+УТ. Теоретические расчеты показали, что комплементарные пары адсорбируются на поверхность НА-СООН посредством образования водородных связей, при этом разрыва водородных связей в комплементарной паре не происходит. Результаты этих исследований описаны в публикации: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jpcc.7b12618 2. Были получены и изучены нанокомплексы детонационных наноалмазов с лизоцимом (НА+лиз) и доксорубицином (НА+докс). 2.1. В результате исследования комплексов с помощью спектроскопии ИК поглощения установлено, что молекулы лизоцима и доксорубицина взаимодействуют с НА посредством физической адсорбции. При взаимодействии с поверхностью НА изменяется конформация лизоцима. 2.2. Были проведены исследования ФЛ биомакромолекул в процессе их адсорбции на поверхность ДНА. Обнаружено тушение ФЛ лизоцима и доксорубицина наноалмазами. В результате исследования свойств ФЛ наноалмазов в комплексах ДНА+лизоцим обнаружено, что при образовании комплекса происходит небольшое увеличение интегральной интенсивности ФЛ ДНА. Результаты этих исследований описаны в публикации: https://www.spiedigitallibrary.org/conference-proceedings-of-spie/10685/106853E/Fluorescent-properties-of-nanodiamonds-in-result-of-interactions-of-nanodiamonds/10.1117/12.2306592.short 2.3. В результате экспериментов по сравнению ферментативной активности адсорбированного и свободного лизоцима по отношению к штамму E.coli 4S установлено, что лизоцим сохраняет ферментативную активность при адсорбции на поверхность ДНА как в один слой, так и менее чем в один слой. Таким образом, на данном этапе было показано, что комплексы НА с лизоцимом и доксорубицином, полученные посредством физической адсорбции, хорошо суспензируются в воде, НА сохраняют свои ФЛ свойства, а лизоцим сохраняет ферментативную активность в адсорбированном состоянии. 3. Были синтезированы, охарактеризованы и исследованы нанокомпозиты ДНА+SiО2+дексаметазон и УТ+сополимер+фолиевая кислота, а также были получены комплексы ДНА+декс посредством адсорбции. В результате экспериментов по высвобождению лекарственного препарата с поверхности нанокомплексов ДНА+SiО2+декс и ДНА+декс в зависимости от времени и от количества удерживаемого лекарства обнаружено, что по сравнению с комплексами НА+декс синтезированные ДНА+SiО2+декс способны переносить большее количество лекарства (на единицу веса) и обеспечивать при этом его пролонгированную отдачу. 4. Установлено, что покрытие УТ сополимером и ФК не привело к появлению токсичности нанокомпозитов. Напротив, эта процедура незначительно повысила биосовместимость и ФЛ наночастиц. В конфокальном флуоресцентном микроскопе были получены изображения клеток HeLa, инкубированных суспензией УТ+Соп+ФК. В микроскопе хорошо видна ФЛ нанокомпозитов в клетках, а также наблюдается локализация раковых клеток. Эти нанокомпозиты могут использоваться одновременно в качестве фотолюминесцентных маркеров и носителей лекарств. Результаты этих исследований описаны в публикации: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1549963418300716?via%3Dihub 5. На основании полученных результатов в 2017-2018 гг. выдвинута гипотеза о природе фотолюминесценции УНЧ. Согласно выдвинутой гипотезе, ФЛ НА обусловлена оксидизацией неалмазной фазы углерода на поверхности наночастиц, которая может быть усилена/ускорена определенным способом очистки поверхности, например, кипячением в хлорной кислоте. В результате анализа зависимости спектров ФЛ гуминовых кислот угольного происхождения и УТ от длины волны возбуждения сделано предположение о наличии в них схожих флуорофорных групп. Выдвинутая гипотеза требует дальнейшей проработки. Результаты этих исследований описаны в публикации: http://www.eproceedings.org/static/vol17_1/17_1_khundzhua1.pdf?SessionID=f414ba5b0520c878c90 6. С помощью спектроскопии ИК поглощения и теоретических расчетов по теории функционала плотности были выяснены механизмы адсорбции ионов и биомакромолекул на поверхность углеродных наночастиц. При адсорбции анионов на поверхность УНЧ превалирующую роль играет химическая адсорбция, а при адсорбции катионов - физическая адсорбция. Биомакромолекулы адсорбируются на поверхность НА посредством кулоновского взаимодействия, по большей мере, за счет образования водородных связей. 7. Была продолжена дальнейшая разработка метода оптической визуализации нанокомпозитов УТ+Соп+ФК в биоматериале с помощью искусственных нейронных сетей на примере решения задачи контроля выведения нанокомпозитов и их компонентов с уриной. В результате применения ВНС были получены точности определения концентрации наночастиц в урине: 3.4 мг/л для УТ+соп+ФК, 0.46 мг/л для УТ+соп, 4.1 мг/л для ФК. Напомним, что многослойный персептрон с 8 и 4 нейронами в скрытых слоях обеспечивал следующие ошибки определения концентрации наночастиц на экзаменационном: 0.26 мг/л для УТ+соп+ФК, 0.41 мг/л для УТ+соп, 0.45 мг/л для ФК. Как видно, применение ВНС обеспечило сопоставимый с классической нейронной сетью результат только для определения концентрации УТ+соп. Это доказывает возможность использования вейвлет-нейронных сетей для спектроскопии, однако для этого требуется комплексное исследование по определению оптимальной топологии и параметров сети. Результаты этих исследований описаны в публикации: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1549963418300716?via%3Dihub https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1877050918323226 http://repo.ssau.ru/handle/Informacionnye-tehnologii-i-nanotehnologii/Opticheskaya-vizualizaciya-i-kontrol-vyvedeniya-teranosticheskih-fluorescentnyh-nanokompozitov-iz-organizma-s-pomoshu-iskusstvennyh-neironnyh-setei-69618 | ||
3 | 1 января 2019 г.-15 декабря 2019 г. | Оптимизация свойств новых тераностических углеродных наноагентов - этап 2019 г. |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".