ИСТИНА

Проект направлен на разработку научной платформы для оптимизации свойств новых многофункциональных флуоресцентных биомаркеров на основе углеродных наночастиц (УНЧ) с целью их применения в медицине. Это подразумевает изучение молекулярных взаимодействий и механизмов взаимного влияния матрицы-растворителя и наночастиц на свойства друг друга, а также поиск подходов к управлению оптическими, сорбционными, суспензионными и др.свойствами в суспензиях и биосистемах для решения задач диагностики и терапии в медицине. Актуальность планируемых в данном проекте научных исследований непосредственно связана с уникальными свойствами углеродных наночастиц, обеспечивающими широкие возможности их применения в биологии и медицине. В отличие от органических красителей и полупроводниковых квантовых точек, используемых в качестве флуоресцентных маркеров, такие УНЧ, как наноалмазы (НА) и углеродные квантовые точки (УКТ, или окисленные графитовые нанокластеры), являются биосовместимыми и нетоксичными, обладают интенсивной фотостабильной флуоресценцией при комнатной температуре и способностью к модификации их поверхности в соответствии с конкретной решаемой задачей. Эти свойства обуславливают возможность создания хорошо диспергируемых углеродных нанокомпозитов, которые обладают высокой вместимостью лекарств, позволяют проводить тонкую настройку на адресное лечение, сохраняя при этом стабильные флуоресцентные свойства. Эти свойства делают УКТ и НА гораздо более привлекательными в качестве биомедицинских агентов по сравнению с другими наноматериалами – металлическими, керамическими, полимерными. Поэтому УНЧ постепенно становятся основным материалом для создания нетоксичных и фотостабильных флуоресцентных маркеров, адсорбентов, носителей лекарственных препаратов. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в области бионаномедицины за последнее десятилетие, проблема оптимизации свойств УНЧ для получения максимального терапевтического эффекта и их безопасности остается чрезвычайно актуальной на сегодняшний день. Очевидно, что проблемы оптимизации свойств УНЧ и управления ими могут быть решены только в результате всестороннего изучения природы флуоресцентных и сорбционных свойств УНЧ, механизмов взаимодействия и взаимного влияния матрицы-растворителя и наночастиц на свойства друг друга. Понимание механизмов взаимодействия УНЧ и окружающих биомакромолекул позволит решить основную задачу проекта - создать научную платформу для разработки новых наноагентов на основе УНЧ, сочетающих в себе одновременно свойства флуоресцентного биомаркера и адсорбента/носителя лекарств. Помимо оптимизации свойств УНЧ, необходимых для максимального тераностического эффекта и разработки методов управления ими, в рамках данного проекта будет решена задача оптической визуализации углеродных наноагентов в биологическом материале. Для этого планируется привлечь адаптивные методы анализа данных, в частности, технику искусственных нейронных сетей. Разработанные методы визуализации УНЧ в биосистемах позволят сделать выводы о пространственном и временном распределении наночастиц в биологическом материале, об эффективности адресной доставки лекарственных препаратов, о выведении наночастиц из организма. Наконец, эти методы позволят решать проблемы применения наночастиц и оценки их токсичного влияния на здоровье человека и окружающую среду, которые становятся актуальными в связи с широким применением нанотехнологий. Для решения поставленных задач в рамках данного проекта планируется следующее: 1. Изучение физико-химических и оптических свойств УНЧ в водных суспензиях и биологических системах, что включает в себя: 1.1. Исследование природы флуоресцентных свойств УНЧ 1.2. Установление механизмов адсорбции ионов и биомакромолекул на поверхность углеродных наночастиц, изучение конкурирующих адсорбционных процессов в растворах и сложных биологических системах. 1.3. Изучение взаимодействий функциональных поверхностных групп УНЧ и нанокомпозитов с растворителем и биомакромолекулами, а также влияния молекулярных взаимодействий на оптические, адсорбционные и суспензионные свойства наночастиц. Такие исследования будут проводиться методами оптической спектроскопии - корреляционной спектроскопии, спектроскопии поглощения, флуоресцентной спектроскопии, спектроскопии комбинационного рассеяния (КР) и ИК поглощения света. 2. Разработка принципов целенаправленной модификации функциональной поверхности УНЧ и синтеза на их основе новых нанокомпозитов с управляемыми свойствами флуоресценции, адсорбции, диспергируемости. 3. Разработка методов эффективного детектирования флуоресцирующих наноматериалов в биологических объектах: решение обратных задач оптической визуализации по флуоресценции УНЧ на фоне аутофлуоресценции биоматериала с помощью искусственных нейронных сетей. 4. Апробация новых наноматериалов в биологических объектах в качестве флуоресцентных биомаркеров и носителей лекарств/адсорбентов. В рамках данного проекта впервые поставлена задача научного подхода к созданию многофункционального биомаркера на основе углеродных наночастиц, сочетающего в себе одновременно свойства флуоресцентного маркера и адсорбента/носителя лекарств. Имеющийся у исполнителей проекта – групп Физического факультет МГУ, ИОФ РАН и НИИЯФ МГУ - опыт и научный задел в области колебательной и флуоресцентной спектроскопии и решении обратных задач, материальная база и результаты исследований последних лет являются залогом успешного выполнения данного проекта.

The project is aimed to elaboration of scientific platform for optimization of properties of new multifunctional fluorescence biomarkers on the basis of carbon nanoparticles (CNP) for application in medicine. It assumes a study of molecular interactions and mechanisms of mutual influence of matrix-solvent and nanoparticles on properties of each other and also a search of approaches to control of optical, sorption, suspension and other properties of CNP in suspensions and biosystems for solution of problems of diagnostics and therapy in medicine. Urgency of planned in the given project scientific researches is connected directly with the unique properties of CNP which provide wide opportunities of their application in biology and medicine. In contrast with organic dyes and semiconductor quantum dots used as fluorescence markers such CNP as nanodiamonds (ND) and carbon quantum dots (CQD) are biocompatible and non-toxic, they have intensive stable fluorescence at the room temperature and their surface can be modified in accordance with concrete task. These properties provide a possibility of creation of easily dispersed nanocomposites on the base of mentioned CNP which have high drug capacity and are targeted on certain cells. They allow one to perform fine tuning for targeted therapy while keeping fluorescence properties. These properties make CQD and ND much more attractive as biomedical agents in comparison with the other nanomaterials – metallic, ceramic, polymeric. That is why CNP gradually become the main material for creation nontoxic and photostable fluorescent markers, adsorbents, drug-carriers. Despite significant progress achieved in the field of biomedicine during last decade, the problem of optimization of CNP properties for obtaining maximal therapeutic effect and their safety is very actual now. It is obvious that the problems of optimization of CNP properties and their control can be solved only as a result of complete study of nature of fluorescence and sorption properties of CNP, mechanisms of interactions and mutual influence of matrix-solvent and nanoparticles on these properties of nanoparticles. Understanding of mechanisms of interaction of CNP and surrounding biomacromolecules will allow one to solve the basic problem of the project – to create the scientific platform for elaboration of new nanoagents on the basis of CNP combining simultaneously the properties of fluorescence biomarker and adsorbent/drug carrier. Besides the optimization of properties of CNP which are necessary for maximal theranostic effect, and the elaboration of the methods of control of them, within the frameworks of the given project the problem of optical visualization of carbon nanoagents in biological material will be solved. For this it is planned to apply adaptive methods of data analysis, in particular, the technique of artificial neural networks. Elaborated methods of visualization of CNP in biosystems will allow one to make conclusions about spatial and temporal distribution of nanoparticles in biological material, about efficiency of targeted drug delivery, about excretion of nanoparticles from the organism. At last, these methods will allow one to solve the problems of use of nanoparticles and estimation of their toxic influence on environment and human health, which become actual in connection with wide application of nanotechnologies. For solution of the specified task it is necessary the following: 1. Study of physical-chemical and optical properties of CNP in water suspensions and biological systems which includes: 1.1. Study of nature of fluorescence properties of CNP. 1.2. Establishment of mechanisms of absorptions of ions and biomacromolecules on the surface of carbon nanoparticles, study of competing absorption processes in suspensions and complex biological systems. 1.3. Study of interactions of surface functional groups of CNP and nanocomposites with solvent and biomacromolecules and also influence of molecular interactions on optical, adsorption, and suspension properties of nanoparticles. These studies will be carry out using methods of optical spectroscopy – correlation spectroscopy, absorption spectroscopy, fluorescence spectroscopy, Raman spectroscopy and spectroscopy of IR absorption. 2. Elaboration of principles of targeted modification of functional surface of CNP and synthesis on their basis of new nanocomposites with controllable fluorescence, adsorption, dispersion properties . 3. Elaboration of methods of effective detection of fluorescence nanomaterials in biological objects: solution of inverse problems of optical visualization using fluorescence of CNP on the background of autofluorescence of biomaterial with the help of artificial neural networks. 4. Approbation of new nanomaterials in biological objects as fluorescence biomarkers and drug carrier/adsorbent.

В рамках выполнения работ по проекту будет разработана научная платформа для создания новых многофункциональных агентов на основе углеродных наночастиц (УНЧ) с целью их применения в медицине. В результате проведенных исследований по изучению молекулярных взаимодействий и механизмов взаимного влияния матрицы-растворителя и наночастиц на свойства друг друга будут разработаны принципы целенаправленной модификации поверхности УНЧ, позволяющей управлять этими свойствами в суспензиях и биосистемах. Это позволит синтезировать новые УНЧ и нанокомпозиты с заданными адсорбционными и флуоресцентными свойствами. В настоящее время в мировой науке не существует научной платформы для управления уникальными свойствами УНЧ. В рамках данного проекта будут также разработаны методы оптической визуализации тераностических агентов в биологических системах. Впервые такие обратные задачи будут решены с помощью искусственных нейронных сетей. Результаты работ по выполнению проекта будут опубликованы в журналах (планируется публикация 14 статей) и доложены на международных конференциях; включены в курсы лекций, семинаров и практических работ на физическом факультете МГУ. Результаты научных исследований, проведенных в рамках данного проекта, будут способствовать решению фундаментальных проблем современной физики наноструктур - выяснению природы оптических и сорбционных свойств углеродных наночастиц. Помимо этого, в процессе выполнения проекта будут разработаны новые нанотехнологии, новые наноматериалы и новые методы оптической визуализации, которые позволят изучать возможности транспорта биомакромолекул и веществ с помощью наночастиц-носителей через мембраны к биологическим мишеням; изучать влияние наночастиц-адсорбентов на сложноорганизованные биологические системы, развивать сверхчувствительные и высокопроизводительные методы быстрой детекции белков, генов, клеток.

В результате совместной работы исполнителей проекта было сделано следующее: 1. Установлено, что УНЧ взаимодействуют с молекулами протонных растворителей в суспензиях, изменяя силу и динамику водородных связей. Эти взаимодействия проявляются в изменении положения и формы валентных полос растворителей воды в спектрах КР. Обнаружено, что сила взаимодействий УНЧ с растворителями зависит от функционализации поверхности УНЧ. Водородные связи, образующиеся между поверхностью УНЧ и молекулами растворителя, существенным образом изменяют флуоресцентные свойства УНЧ: чем сильнее водородные связи, тем слабее флуоресценция УНЧ в суспензии. 2. Экспериментально исследованы адсорбционные свойства и определены количественно адсорбционные активности исходных и модифицированных детонационных НА по отношению к ионам тяжелых металлов с помощью методов корреляционной спектроскопии, спектроскопии поглощения, спектроскопии КР и ИК поглощения. Выяснены механизмы адсорбции наночастиц: при адсорбции катионов превалирующую роль играет физическая адсорбция, а при адсорбции анионов – химическая адсорбция. 3. Разработан новый метод управляемого синтеза нанокомпозитов «алмаз-мезопористый оксид кремния» заданного размера на основе различных классов детонационных и флуоресцентных наноалмазов. 4. Разработаны методики получения спектров флуоресценции наночастиц алмаза и нанокомпозитов «алмаз-мезопористый оксид кремния», введенных в живую клетку. 5. Разработан новый метод функционализации УКТ, обеспечивающий надежное удержание лекарственных препаратов на поверхности УКТ. Разработаны методики получения спектров флуоресценции УКТ с прикрепленными лекарствами, введенных в живую клетку. 6. Впервые методом высокого давления синтезированы сильно-легированные бором наноалмазы с размером кристаллитов менее 10 нм. Обнаружены особенности во взаимодействиях НА, легированных бором, с молекулами воды по сравнению с детонационными НА.

Основной задачей Проекта являлась выработка рекомендаций по созданию углеродных наночастиц (УНЧ) с оптимальными суспензионными, фотолюминесцентными и сорбционными свойствами для их применения в качестве тераностических наноагентов в биомедицине. В качестве объектов исследования выступали: 1) наноалмазы (НА) детонационного метода синтеза (ДНА) - необработанные; очищенные посредством кипячения в смеси кислот – ДНАн с разными функциональными группами на поверхности (ДНА-поли, ДНА-СООН, ДНА-ОН, ДНА-Н); 2) наноалмазы RayND, полученные методом лазерной абляциии - необработанные; очищенные посредством кипячения в смеси кислот; 3) наноалмазы размером 20 нм ND20, полученные методом дробления CVD алмазов; 4) наноалмазы, декорированные углеродными точками (ДНА+УТ1); 5) углеродные точки типа 1 (УТ1) – оксиды нанографена, полученные методом Хаммерса; углеродные точки типа 2 (УТ2) – углеродные точки, синтезированные из лимонной кислоты (УТ2-Л) или транс-аконитовой кислоты (УТ2-ТА) и водного раствора аммиака. Все УНЧ в порошкообразном виде были охарактеризованы с помощью просвечивающих электронных микроскопов, конфокальной спектроскопии комбинационного рассеяния (КР) и фотолюминесцентной спектроскопии. Функциональный покров УНЧ исследовался методом спектроскопии ИК поглощения. Для всех приготовленных суспензий УНЧ методом динамического светорассеяния (ДСР) определялись размеры наночастиц в суспензии, измерялись дзета-потенциал и показатель рН. Полученные результаты свидетельствуют о хорошей коллоидной стабильности всех УНЧ в воде, этаноле и метаноле на протяжении, как минимум, полугода. На основании результатов, полученных в рамках выполнения Проекта, можно сформулировать следующие принципы оптимизации свойств УНЧ и управления ими. 1. Фотолюминесцентные свойства УНЧ. 1.1. Интерфейс «алмазное ядро – неалмазная фаза углерода». Были исследованы фотолюминесцентные свойства НА различного метода синтеза, поверхность которых очищалась различными способами: посредством кипячения в смеси серной и азотной кислот, в хлорной кислоте, отжига, озонирования. Изменение количества неалмазной фазы углерода (НФУ) на поверхности НА контролировалось с помощью конфокальной спектроскопии КР и спектроскопии ИК поглощения. Расчеты показали, что чем больше на поверхности НФУ, тем сильнее ФЛ образцов. Измерения квантовых выходов ФЛ НА в воде, подвергшихся различному времени очистки поверхности, а также УНЧ с различным содержанием НФУ на поверхности – ДНА+УТ1 и УТ1 - также подтвердили существенную зависимость интенсивности ФЛ УНЧ от количества НФУ на поверхности наночастиц. Как следует из полученных результатов, для усиления ФЛ свойств ДНА в процессе очистки их поверхности целесообразно обеспечить большое количество НФУ на поверхности наночастиц. Это подтверждают проведенные исполнителями Проекта эксперименты и сравнительный анализ суспензионных, адсорбционных и фотолюминесцентных свойств ДНА и ДНАн. Было установлено, что большее количество НФУ на поверхности ДНАн не только усиливает ФЛ ДНА, но и обеспечивает высокие адсорбционные и суспензионные свойства новых наночастиц. Варьируя количеством НФУ на поверхности наноалмаза, можно управлять его ФЛ. Для этого нужно подобрать соответствующие условия очистки наночастиц: например, для кипячения в смеси кислот необходимо установить оптимальные соотношение кислот, время и температуру кипячения. Это уже самостоятельная многопараметрическая задача. 1.2. Интерфейс «алмазное ядро/НФУ – функциональные группы на поверхности». Для исследования влияния на ФЛ УНЧ функционального покрова были получены спектры КР и ФЛ водных суспензий ДНА-поли, ДНА-СООН, ДНА-ОН, ДНА-Н в широком диапазоне концентраций ДНА. Рассчитанные зависимости параметров ФЛ F0 (отношение площадей под кривыми ФЛ и валентной полосы КР воды) от концентрации наночастиц показали, что ФЛ ДНА зависит от типа функциональных поверхностных групп, а именно, для ДНА в водных суспензиях можно построить следующий ряд по уменьшению ФЛ ДНА в зависимости от поверхностного покрова: ДНА-Н >> ДНА-ОН ≥ ДНА-поли > ДНА-СООН (1) Зависимость (1) была объяснена с точки зрения суперпозиции индуктивного и мезомерного электронных эффектов при образовании ковалентной связи между атомами с различной электроотрицательностью и подтверждена теоретическими расчетами. Для сравнения степени влияния НФУ и типа функциональных поверхностных групп на ФЛ УНЧ были измерены значения квантовых выходов ФЛ водных суспензий 1) ДНА и ДНА+УТ1 в процессе очистки их поверхности и 2) водных суспензий ДНА-поли, ДНА-СООН, ДНА-ОН, ДНА-Н. Результаты показали, что посредством очистки квантовый выход можно изменить от минимального до возможно максимального, а изменением типа функциональных групп - примерно на 30-35 %. Таким образом, зависимость ФЛ УНЧ от типа поверхностных функциональных групп менее существенна по сравнению с зависимостью ФЛ наночастиц от количества НФУ на их поверхности. В соответствии с результатами объяснения поверхностной ФЛ УНЧ с точки зрения проявления суперпозиции индуктивного и мезомерного электронных эффектов при ковалентном связывании функциональных групп и поверхности ДНА для усиления ФЛ УНЧ следует учитывать электроотрицательность атомов конкретных функциональных групп. То есть, выбирая функциональные группы с соответствующей электроотрицательностью, можно управлять ФЛ функционализированных УНЧ. 1.3. Интерфейс «функциональные группы – молекулы окружения» Было обнаружено, что окружающие в суспензии УНЧ молекулы влияют на ФЛ наночастиц. Более того, сами УНЧ при суспензировании изменяют структуру и связанность молекул в растворителе, а молекулы окружения, взаимодействуя с поверхностными группами УНЧ, в свою очередь, изменяют ФЛ наночастиц. В воде в присутствии УНЧ существенно изменяется сила водородных связей. В результате теоретических расчетов и проведенных экспериментов было установлено, что это взаимовлияние также является результатом суперпозиции индуктивного и мезомерного электронных эффектов при ковалентном связывании функциональных групп и поверхности ДНА. 1.4. Эксперименты по исследованию ФЛ УНЧ в биоматериале (куриный белок, урина) показали, что многие биомолекулы и ферменты хорошо адсорбируются на поверхность УНЧ. При этом ФЛ УНЧ возрастает благодаря экранированию поверхности УНЧ от молекул воды, которая является мощным тушителем ФЛ. 2. Адсорбционные свойства ДНА, ДНАн, ДНА+УТ1 и УТ1. Если УТ обладают более интенсивной ФЛ по сравнению с ДНА, ДНАн и ДНА+УТ1, то ДНА, ДНАн и ДНА+УТ1 обладают более высокими адсорбционными свойствами (по отношению к ионам, ферментам, биомолекулам, лекарствам) по сравнению с УТ. К сожалению, причины такого различия в адсорбционных свойствах УТ и ДНА требуют дальнейшего исследования. Эксперименты и проведенный сравнительный анализ адсорбционной активности ДНА с различной функционализацией свидетельствуют о том, что ДНА, ДНАн и ДНА+УТ1 с поверхностными карбоксильными группами обладают более высокими адсорбционными свойствами, чем УНЧ с другой функционализацией. Они могут быть основой для комплексов на основе ДНА и ДНА+УТ, к которым посредством физической адсорбции прикрепляются лекарственные препараты и ферменты. 3. Суспензионные свойства ДНА и ДНА+УТ1. В результате проведенных исследований было установлено, что полярность растворителей слабо влияет на суспензионные свойства ДНА. Суспензионные свойства ДНА и ДНА+УТ1 резко повышаются при добавлении небольших количеств ПАВ в суспензию. При этом степень дезагрегации наночастиц зависит от того, гидрофобная или гидрофильная их поверхность. В суспензиях УНЧ с гидрофобной поверхностью дезагрегация происходит активнее. Установлено, что на уже образовавшиеся мицеллы в суспензиях наноалмазы не оказывают существенного влияния. Этот вывод свидетельствует о безопасности взаимодействия наноалмазов с клетками, т.к. можно ожидать, что они не будут разрушать бислои клеточных покровов. Исследования показали, что ДНАн с карбоксилированной поверхностью являются перспективными наноагентами для применения в биомедицине. Карбоксильные группы обладают наибольшей биосовместимостью, они обеспечивают наиболее высокие адсорбционные свойства по отношению к ионам тяжелых металлов, биомолекулам и лекарствам из всех исследованных групп, в том числе, надежно удерживают покрытия из сополимеров при синтезе нанокомпозитов. Наибольшее ослабление ФЛ УНЧ с карбоксилированной поверхностью в воде компенсируется увеличением ФЛ в биоткани. В рамках выполнения работ по Проекту были получены устойчивые фотолюминесцентные нанокомплексы: ДНА+лизоцим, ДНА+доксорубицин, (ДНА+УТ1)+доксорубицин, ДНА+дексаметазон и нанокомпозиты ДНА+SiО2+дексаметазон – и изучены их свойства. Была продемонстрирована устойчивость комплексов, отсутствие цитотоксичности, установлено, что интенсивность ФЛ УНЧ в комплексах возрастает по сравнению с ФЛ носителей. Проверка УНЧ на цитотоксичность проводилась на клетках MCF-7 с помощью колориметрического теста MTT. Были проведены исследования по сравнению ферментативной активности свободного и адсорбированного на поверхность ДНА лизоцима. Как следует из полученных результатов, лизоцим сохраняет ферментативную активность при адсорбции на поверхность ДНА как в один слой, так и менее чем в один слой. В результате исследований установлено, что все полученные нанокомплексы и нанокомпозиты являются достаточно перспективными для применения их в биомедицине. В процессе исследований проводились работы по оптической визуализации УНЧ в биоматериале с помощью конфокальной фотолюминесцентной микроскопии и STED. Полученные изображения ФЛ исследованных УНЧ в клетках HeLa и MDA-MB-231 демонстрируют их принципиальную применимость в качестве фотолюминесцентных маркеров в биоткани. В рамках выполнения Проекта был разработан метод контроля выведения из организма нанокомпозитов и их компонентов с уриной на примере нанокомпозита УТ1+соп+ФК (УТ1, покрытые сополимером (PEG) и полиэтиленимином (PEI), к которому прикреплена фолиевая кислота (ФК)). Сравнительный анализ квантовых выходов и параметров F0 показал, что покрытие УТ1 сополимером и ФК не вызывает тушения ФЛ наночастиц в воде. Для решения поставленной задачи применялись искусственные нейронные сети (ИНС): многослойный персептрон, вейвлет-анализ и самоорганизующаяся карта Кохонена. Наилучшие результаты в решении задачи обеспечила ИНС с архитектурой многослойного персептрона. Таким образом, был предложен новый подход к реализации оптической визуализации люминесцентных наночастиц в биоматериале с помощью искусственных нейронных сетей. Результаты работ по выполнению Проекта были опубликованы в 51 публикации. Этот список публикаций содержит: 18 статей, из которых 16 статей в журналах, индексированных в Web of Science, Scopus (14 статей в Web of Science, 14 статей в Scopus, 4 статьи в квартиле Q1), 18 статей в журналах, индексированных РИНЦ; 2 статьи в сборниках материалов конференции и 31 тезис на конференциях. Результаты были доложены в 36 докладах на 23 международных конференциях (4 приглашенных доклада, 11 устных и 21 постерный доклад), а также добавлены в лекции для студентов и аспирантов физического факультета МГУ.