ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Потепление климата, связанное с ростом концентрации парниковых газов в атмосфере, представляет насущную проблему современности. Природная эмиссия СO2 при минерализации растительных остатков (60 Гт С/год), основу которых составляет лигноцеллюлоза, многократно превышает эмиссию, вызванную антропогенной деятельностью (9 Гт С/год). Основными механизмами стабилизации биомолекул органических остатков в аэробных условиях являются гумификация и органо-минеральные взаимодействия, в почвах эти процессы во многом взаимосвязаны. Накопление устойчивых соединений почвенного гумуса (1-2 Гт С/год)обеспечивает долговременный (тысячелетия) вывод углерода из биологического круговорота,регулирует газовый состав атмосферы, способствует накоплению кислорода и является необходимым условием аэробной жизни. Гумус составляет главный резервуар Сорг в биосфере (1500 Гт), с ним связано появление почв как плодородного слоя, становление наземных экосистем и их дальнейшая эволюция. Рост глобальных температур и аридизация способствуют биодеградации гумуса, что может быть особенно ощутимо для экосистем холодного гумидного климата (почвы тундр, бореальных лесов, включая торфяники), в которых сосредоточено около 40% запасов Сорг почв планеты, 80% запасов углерода торфов и большая часть углерода почв России. Изучение биохимических процессов, регулирующих естественный баланс потоков CO2 между почвой и атмосферой, является актуальной задачей, решение которой необходимо для прогнозов эмиссий парниковых газов, разработки стратегий устойчивого землепользования,способствующих переводу углерода из активного пула в пассивный. Проект направлен на установление роли грибных фенолоксидаз – лакказ, в образовании и трансформации гуминовых веществ (ГВ) – темноокрашенных продуктов гумификации, составляющих основу гумуса. В проекте будет использован уникальный комплексный подход заключающийся в привлечении методов биохимии и молекулярной биологии к решению проблемы гумификации, масштаб которой определяется геологическим отрезком времени и экосистемным охватом – от появления первых темноокрашенных веществ ароматической природы (не менее 1 млрд лет назад) до современных почв тундровых, лесных и травянистых экосистем. Будет проведено моделирование реакций синтеза и трансформации ГВ в присутствие широко распространенного в почвах фермента лакказы, катализирующего как образование, так и разрыв ковалентных связей в фенольных субстратах за счет молекулярного кислорода. Лакказа продуцируется бактериями, лигнолитическими базидиальными грибами, микромицетами, а также,как установлено авторами проекта, автотрофными симбиотическими организмами – лишайниками.Лишайники составляют доминирующий покров 6% поверхности суши (тундры, высокогорья, сосняки-беломошники) и являются организмами-пионерами на минеральных субстратах, играя важнейшую роль в первичном почвообразовании. Современные почвы под лишайниками авторами проекта предлагается рассматривать как актуалистическую модель древней долигниновой биосферы. Лакказа у лишайников обладает необычной олигомерной структурой и сохраняет активность внутри воздушно-сухих талломов в течение многих лет при комнатной температуре, по нашим предварительным данным стабильность зависит от связывания с неизвестными компонентами лишайника. Для всестороннего решения проблемы участия лакказ в гумификации планируются следующие направления исследований: 1) изучение каталитической активности фермента в почвах различных экосистем – от тундры до степей, изучение параметров адсорбции лакказы минеральными фазами и влияния этого процесса на свойства фермента;.2) развитие предложенной авторами концепции гетерогенного биокатализа как приоритетного механизма образования ГВ из мономерных предшественников - моделирование конденсационных реакций в присутствие иммобилизованных лакказ в динамическом режиме, имитирующем почвенные соотношения твердой и жидкой фаз и концентрации растворенных веществ – предшественников;3) изучение деполимеризующей способности лакказ почвенных грибов и лишайников в отношении выделенных из почв гумусовых веществ: выявление особенностей их трансформации лакказамипо сравнению с лигнолитическими пероксидазами и целлюлазами, изучение устойчивостимакромолекулярных фрагментов ГВ к перечисленным ферментам, действующим на С-С и С-Oсвязи; 4) изучение возможности участия лакказ в гумификации в различные периодыгеологической истории Земли путем секвенирования генов лакказ у лишайников и сравнения сопубликованными геномами лакказ свободноживущих грибов; 5) изучение физико-химическихсвойств и трехмерной структуры (после кристаллизации) лакказ пельтигеровых лишайников по сравнению с лакказами свободноживущих грибов; исследование природы веществ, стабилизирующих и модифицирующих лакказу и влияющих на ее функционирование внутри и внеталломов. Предполагается, что исследования внесут весомый вклад в решение фундаментальных и прикладных проблем почвоведения, биогеохимии и биохимии. Планируемые эксперименты позволят сделать вывод о роли биокатализаторов, свободнорадикальных реакций и ковалентныхвзаимодействий в образовании и молекулярной организации веществ гумуса, позволят подтвердить или опровергнуть возможность новообразования ГВ как специфических почвенных соединений, а также расширят представления о реакционной способности и биосферных функциях лакказ – наиболее распространенных окислительных ферментов цикла углерода. Впервые будет исследована роль лакказ почвенных микромицетов и лишайников в гумификации. У этих организмов лакказа является главным ферментом лигнолитического комплекса, что предполагает ее важную роль в секвестрации органического углерода как в историческом аспекте (синтез и деструкция ГВ до появления лигнина и разрушающих его грибов, 400 млн лет назад), так и в современных почвах, когда ограничена активность лигнолитических пероксидаз – основных катализаторов деструкции фенольных полимеров. Впервые будут исследованы гены и структура лакказ симбиотических автотрофных организмов, проведено сравнение с генами и структурой лакказ свободноживущих органотрофных грибов. Это внесет большой вклад в представления о функционирования фермента у разных продуцентов, его структуре, происхождении и эволюции. Планируемые исследования являются абсолютно новым подходом к проблеме и опережают мировой уровень.
Climate warming associated with increasing greenhouse gas concentrations in the atmosphere is the vital problem of our time. Natural emission of CO2 by mineralization of lignocellulosic plant residues (60 GT C/year) is many times higher than emission due to anthropogenic activities (9 GT C/year). Humification and organo-mineral interactions are the main stabilization mechanisms of plant-derived carbon under aerobic conditions. These processes are largely interrelated in soils. Accumulation of recalcitrant compounds of soil humus (1-2 GT C/year) provides long-time (thousands of years) sink of CO2 and contributes to oxygen accumulation in the atmosphere. Humus is a major reservoir of SOC in the biosphere (1500 GT). It forms the basis for terrestrial life, marks the appearance of soils as a fertile layer, is vital for the establishment of terrestrial ecosystems and their future evolution. The rise of global mean temperatures and increasing aridity contribute to biodegradation of humus. Mineralization process can be especially noticeable in cold humid climate (soils of tundra, boreal forests, including peat), which holds about 40% of the soil reserves of Corg of the planet, 80% of the peat C and most of the carbon in soils of Russia. The study of biochemical processes regulating the natural fluxes of CO2 between soils and atmosphere, is an actual task of our days, because knowledge of these processes enables projections of greenhouse gas emissions, and allow to develop strategies for sustainable land use, facilitating transfer of carbon from active pool to the passive. The aim of the project is to establish the role of fungal phenoloxidase – laccases, in the formation and transformation of humic substances (HS) – dark-colored products of humification, major components of humus. A unique integrated approach combining methods of soil science, biochemistry and molecular biology will be used to address the problem of humification. The scope of the task is defined by geological time interval and ecosystem scale – from the emergence of the first dark-colored substances of aromatic nature (at least 1 billion years ago) to the modern soils of tundra, forest and steppe ecosystems. We will model the reactions of synthesis and transformation of HS in the presence of widespread soils enzyme laccase which catalyses both formation and destruction of covalent bonds in phenolic substrates in presence of molecular oxygen. Laccase is produced by bacteria, ligninolytic basidiomycetes, cellulolytic micromycetes and by symbiotic autotrophic organisms – lichens as well. Lichens form the dominant cover of 6% of the land surface (tundra, high mountains, pine forests) and are the pioneer organisms on mineral substrates, playing a crucial role in initial soil formation. We are suggesting that modern soils under lichen communities can be considered as actualistic model of ancient pre-lignin biosphere. Laccase in lichens is unusual by its oligomeric structure as well as ability of long-time (several years) maintainance of activity inside the thalli at room temperature. According to our preliminary data, the stability depends on binding with unknown components of the lichen. In order to establish the role of laccase in humification the following research will be done: 1) study of catalytic activity of the enzyme in soils of different ecosystems – from tundra to steppes, study of the parameters of the adsorption of laccase by mineral phases and the effects of this process on the properties of the enzyme;.2) development of heterogeneous biocatalysis concept proposed by the authors: modelling condensation of monomers in the presence of immobilized laccase in a dynamic mode, simulating the soil conditions with respect to the ratio of solid and liquid phases and the concentration of dissolved precursor substances; 3) study of depolimerizing ability of soil fungi and lichens in relation to HS isolated from soils: identifying features of their transformation by laccase in comparison with manganese-dependent peroxidase and cellulase, study of the stability of macromolecular fragments of HS to the mentioned enzymes acting on C-C and C-O bonds; 4) study of the laccase potential participation in humification in different periods of the geological history of the Earth Заявка № 17-14-01207 Страница 4 из 51 by sequencing of laccase genes from lichens and comparison with published genomes of free-living fungi; 5) study of physicochemical properties and three-dimensional structures (after crystallisation) of laccases from peltigerous lichens and comparing with published data on free-living fungi; study of the nature of substances, stabilizing and modifying lichens laccase and affecting its functioning inside and outside the thalli. It is expected that the research will contribute significantly to fundamental and applied problems in soil science, biogeochemistry and biochemistry. The results will allow to make a conclusion about the role of biocatalysts, the free radical reactions and covalent interactions in the formation and molecular organization of the humic substances, will allow to confirm or not the possibility of synthesis of HS as specific soil compounds as well as enhance our understanding of the reactivity and biospheric functions of laccases – the most common oxidizing enzymes of the carbon cycle. For the first time the role of micromycete-derived laccase in humification will be investigated. Laccase of these organisms lacking ligninolytic peroxidases is the major ligninolytic enzyme. This suggests important role of laccase in sequestration of organic carbon in historical perspective (synthesis and degradation of HS before the after appearance of lignin and its decomposing fungi 400 million years ago) as well as in modern soils when ligninolytic peroxidases activity is limited. Laccase genes will be investigated for the first time. The structure of laccases of these symbiotic autotrophic organisms will be compared with the genes and the structure of laccases of free-living organotrophic fungi. This will make a significant contribution to the understanding of the functioning of the enzyme from different producers, enzyme structure, origin and evolution. Overall, the project will use completely new approach to the humification problem and goes significantly ahead of the world level.
В ходе выполнения работ в рамках проекта предполагается получение следующих основных результатов. 1) Будет определена каталитическая активность лакказы в почвах различных экосистем – от тундры до степей, установлены особенности функционирования фермента при адсорбции минеральными фазами 2) Впервые будет установлена принципиальная возможность новообразования темноокрашенных гетерополимеров при воздействии иммобилизованных на минералах лакказ на мономерные соединения-предшественники в динамическом проточном режиме, имитирующем почвенные условия, включая соотношения твердой и жидкой фаз и низкие концентрации растворенных веществ 3) Будет определена молекулярная устойчивость экстрагируемых щелочью полимерных веществ гумуса к важнейшим ферментам гумификации, действующим на ковалентные связи фенольных и углеводных фрагментов – лакказе, лигнолитической пероксидазе, целлюлазе. Впервые будет установлена роль лакказ грибов-целлюлолитиков (к которым относится 80% культивируемого микробного населения почв) в секвестрации органического вещества почв. 4) Впервые будут секвенированы и клонированы гены лакказ лишайников, что позволит оценить правомерность рассмотрения лишайников как реликтовых организмов-гумусообразователей долигниновой биосферы. Впервые будет установлена возможность участия лакказ в гумификации в различные периоды геологической истории Земли. На основе анализа генов свободноживущих и симбиотических грибов будет построено эволюционное древо для лишайниковых лакказ. 5) Будет проведена сравнительная характеристика физико-химических свойств и трехмерной структуры лакказ свободноживущих грибов и лишайников. Впервые будет исследована структура лакказ лишайников, химическая природа веществ лишайников, модифицирующих фермент и влияющих на функционирование внутри и вне талломов. В рамках работы возможно создание новых подходов для хранения ферментных препаратов. 6) Будут сформулированы основные принципы гумификации в присутствие гетерогенных фаз (минералы или грибной мицелий) и лакказы как биокатализатора, показана роль лакказы в конденсационных процессах и ресинтезе гетерополимеров в почвенных условиях, определена возможная деполимеризующая активность лакказ небазидиальных грибов в отношении фенольных субстратов, что существенно расширит представления о функциях фермента в секвестрации углерода в отсутствие лигнолитических пероксидаз (период развития почв до появления лигнина 400 млн лет назад и минеральные горизонты современных почв). Уровень ожидаемых результатов сопоставим с мировым. Более того, по ряду позиций ожидаемые результаты можно назвать опережающими. Помимо научной новизны и интереса для решения фундаментальных проблем почвоведения, биогеохимии и биохимии, комплекс проведенных исследований может быть востребован в социально значимой сфере – для разработки стратегий устойчивого землепользования, способствующих секвенированию углерода в почвах, для прогнозов отклика органического вещества почв на наблюдаемый рост температур и аридизацию,для производства гуминовых удобрений, разработки способов хранения ферментных препаратов, улучшения функционирования лакказы при использовании этого фермента в биотехнологиях.
Доказана возможность образования гумусоподобных веществ в присутствие иммобилизованной лакказы (Zavarzina 2006; 2011). Предложена гипотеза гетерофазного биокатализа (Zavarzina 2011). Изучена активность лакказ и пероксидаз в подзолах и подзолистых почвах лесной зоны. Впервые установлено, что лакказа базидиомицета белой гнили древесины способна к деполимеризации ГК почвы in vitro (Zavarzina et al., 2004) и в погруженной культуре. Обнаружены лакказы и тирозиназы в лишайниках разных систематических групп (Заварзина и Заварзин, 2006), показано, что лакказы обладают необычными свойствами (Lisov et al., 2007, 2012). предложен актуалистический подход к изучению гумусообразования в ранней биосфере (Zavarzina and Zavarzin, 2013). В лишайниках изучены водорастворимые фенольные соединения, установлена корреляция с продукцией лакказ (Загоскина и др 2011; 2013), обнаружены фенолы-дериваты лигнина (Заварзина и др 2015). показано, что лакказы лишайников способны деполимеризовывать почвенные гуминовые вещества in vitro (Lisov et al., 2012). Проведен анализ литературы по исследуемой проблеме, написаны обзоры (Заварзина 2010; Zavarzina 2011; Zavarzina et al 2011; Beckett et al., 2013). Разработаны подходы и методы к изучению роли окислительных ферментов в гумификации (Zavarzina 2006; Zavarzina et al 2004),Разработан метод вещественного анализа почв, илов и донных отложений в динамическом режиме во вращающихся спиральных колонках (Fedotov et al., 2002). Разработан способ получения лакказ лишайников (Lisov et al. 2012). Исследованы лакказы дереворазрушающих грибов (Lisova et al. 2010), производилось исследование бактериальных лакказ, в том числе рекомбинантных (Lisov et al 2015). авторы проводили исследования трёхмерной структуры лакказ различных организмов (Tishchenko et al 2015). Разработаны методы получения, определения активности, а также создания рекомбинантных продуцентов глюкогидролаз бактерий и дереворазрушающих грибов (Lisov et al 2014, Belova et al 2014).
Проект был направлен на решение масштабной проблемы почвоведения и биогеохимии, связанной с образованием, молекулярной устойчивостью и трансформацией темноокрашенных полифенольных соединений гумуса - гуминовых кислот (ГК), являющихся продуктом деструкции растительных остатков и составляющих 50-70% почвенного гумуса. Процесс гумификации является вторым по масштабу после фотосинтеза, определяет углеродный баланс экосистем, однако пути преобразования органических остатков в гумус до сих пор не установлены, макромолекулярная структура ГК является предметом дискуссий (Piccolo 2001; Sutton and Sposito, 2005), подвергается сомнению факт их биохимической устойчивости (von Lutzow et al, 2006), существования как отдельного класса природных геомолекул и возможность образования в результате окислительной конденсации в почвах (Lehmann and Kleber, 2015). Оригинальным подходом к проблеме гумификации стало моделирование реакций синтеза и деструкции ГК в присутствии лакказы. Лакказа, катализирующая окисление фенольных субстратов молекулярным кислородом, является удобным инструментом для установления молекулярной структуры ГК, их устойчивости и процессов образования. Фермент катализирует конденсацию и деполимеризацию фенольных субстратов по свободнорадикальному механизму с образованием или разрывом ковалентных связей и широко распространена в почвах - продуцируется базидиомицетами, микромицетами, лишайниками и бактериями. Фермент бактерий эволюционно более древний, чем фермент грибов. Таким образом, изучение лакказ различных продуцентов и их взаимодействия с ГК и их предшественниками позволяет изучить биохимическую природу и молекулярную структуру ГК и проследить роль фермента в гумусообразовании в эволюционном аспекте и геологическом масштабе времени. Для установления роли лакказ в деградации ГК проведены реакции их взаимодействия с лакказами и другими оксидоредуктазами почвенных базидиомицетов, аскомицетов и бактерий, в том числе в целлюлолитических условиях (впервые). Возможность синтеза полимерных фракций ГК из мономеров была впервые изучена в динамическом проточном режиме, характерном для почв гумидного климата, при почвенных концентрациях субстратов и активностях лакказы. Впервые исследованы гены лакказ лишайников как предполагаемых древних продуцентов фермента, изучены механизмы взаимодействия ГК с лакказой на основе анализа трехмерных структур ферментов грибов и бактерий. Привлечение методов биохимии и молекулярной биологии к проблеме гумификации позволило получить данные, не имеющие аналогов в мировых исследованиях и существенно дополняющие представления о механизмах образования ГК, их структуре и устойчивости. В результате проведенных в ходе выполнения проекта работ, можно утверждать, что вещества щелочных экстрактов из почв, осаждаемые кислотой (гуминовые кислоты) и составляющие до 50% Сорг, содержат высокомолекулярные полифенольные компоненты, деполимеризующиеся под воздействием окислительных ферментов, действующих на ковалентные связи в фенольных субстратах. Это опровергает мнение о сугубо низкомолекулярной природе почвенного ОВ (Piccolo et al., 2001; 2018). Установлено, что вещества щелочных экстрактов биохимически неустойчивы и подвергаются окислительной деструкции в присутствии окислительных ферментов грибов как в лигнолитических, так и в целлюлолитических условиях, в присутствии ферментов с относительно низким редокс потенциалом (лакказы). Это не согласуется с классическими представлениями о высокой молекулярной устойчивости ГК и их селективном накоплении в почвах (Stevenson, 1994; Орлов, 1990). На примере изучения лакказ широкого ряда продуцентов – дереворазрушающих и подстилочных грибов, аскомицетов, лишайников, бактерий, доказана важная роль фермента лакказы в деградации и синтезе ароматических веществ почвенного гумуса. Показано, что деградация ГК (обесцвечивание и деполимеризация) свойственна в основном лакказам базидиомицетов, происходит при кислых значениях рН и наиболее активно в культурах грибов, а не препаратами ферментов. Впервые установлена возможность эффективной деградации ГК в целлюлолитических условиях за счет действия окислительного фермента целлобиозо дегидрогеназы (ЦДГ), катализирующего окисление целлобиозы хинонами или кислородом с образованием гидрохинонов и перекиси. Доказана роль радикалов и реакции Фентона, запускаемой ЦДГ, в деградации ГК. Эта реакция может повсеместно протекать в почвах, поэтому полученные данные расширяют наши представления о функциях грибов-продуцентов фермента и о деградации ГК грибами. Установлено взаимное влияние лакказы и ЦДГ при деструкции ГК в целлюлолитических условиях – ЦДГ снижала полимеризующее действие лакказы, а лакказа снижала деполимеризующее действие ЦДГ. Особый интерес представляют лакказы аскомицетов и бактерий, т.к. эти организмы не продуцируют линолитических пероксидаз и лакказы у них являются единственным ферментом так называемого “лигнолитического комплекса”. Кроме того, ферменты этих организмов эволюционно более ранние, чем дереворазрушающих грибов, поэтому их участие в гумификации представляет интерес в эволюционном аспекте. Для почвенных микромицетов, выделенных из широкого ряда почв, показана продукция лакказы на агаризованных средах и способность к обесцвечиванию ГК. Однако, способность к обесцвечиванию не всегда коррелировала с продукцией лакказы, поэтому однозначного вывода о роли этого фермента в деградации ГК аскомицетами сделать не удалось и требуются дальнейшие исследования. Впервые изучена трансформация ГК эволюционно древней формой лакказы – двухдоменной лакказой бактерий рода Streptomyces, повсеместно распространенных в почвах. Эти лакказы необычны щелочным рН оптимумом окисления фенольных субстратов, термостабильностью и устойчивостью к ингибиторам. Установлено, что при щелочных рН происходит только полимеризация ГК и их фракций. Без фермента полимеризации ГК в щелочных условиях не наблюдали, что свидетельствует о том, что даже в щелочных условиях процесс полимеризации каталитический и что высокомолекулярные компоненты щелочных экстрактов из почв не являются артефактом экстракции. Особый интерес в плане первичного гумусообразования представляют лишайники как пионеры на минеральных субстратах, организмы-продуценты лакказ (Zavarzina and Zavarzin, 2006) и растворимых фенольных соединений (Загоскина и др., 2013, Zavarzina et al., 2018). Лакказы лишайников необычны наличием двух форм фермента – мономерной и олигомерной, способной трансформироваться в мономерную (Lisov et al., 2007, 2012). Проведены работы по очистке и характеристике лакказ цианолишайников, установлено, что в структуру олигомерной формы модифицируют алифатические соединения. Установлено, что лакказы лишайников полимеризовали ГК и фенольные кислоты in vitro. Из этого следует потенциально важная роль лакказ этих продуцентов в окислительных конденсационных процессах синтеза веществ гумуса. Косвенным свидетельством ранней эволюции лакказ у лишайников являются данные полногеномного секвенирования талломов двух лишайников порядка Peltigerale, и изучения генов лакказ, что явилось долгой и трудоемкой работой, не имеющей аналогов в мировых исследованиях. Впервые секвенированы и клонированы гены лакказ двух пельтигеровых лишайников, показано, что гены лакказ лишайников эволюционно далеко отстоят от генов лакказ наиболее близких грибов-аскомицетов, давно обособились от них и эволюционировали независимо. Впервые построена модель взаимодействия ГК и фенольных соединений с лакказой, на основе получения кристаллов и изучения трехмерных структур трехдоменной лакказы гриба и двухдоменных лакказ бактерий. Установлено, что организация T1 центра лакказ, отвечающая за связывание фермента с субстратом, сходна у обоих форм фермента. На основе анализа окружения Т1 центра установлено, что размер молекул, которые могут подходить к активному центру лакказы и непосредственно с ним взаимодействовать не должен превышать 10 А. Для ГК опубликованы гораздо большие размеры - от 20 до 100 А (Stevenson, 1994). Однако, и высокомолекулярные и низкомолекулярные фракции ГК окисляются лакказами (Lisov et al., 2018; Zavarzina et al., 2018). Видимо, в ГК существуют структуры, размер которых не превышает 10 А, за счёт окисления которых и происходит трансформация гуминовых веществ лакказами. Трансформация (деградация) компонентов ГК размером > 10 А возможна за счет активных форм кислорода, генерируемых лакказами в гидрохинон редокс цикле (Gomez-Toribio et al., 2009). На основе уникального подхода, заключающегося в моделировании реакций гумификации в проточном режиме при характерных для почв концентрациях субстратов и уровнях активности ферментов (активность лакказы была измерена в профилях широкого ряда почв), установлены ограничения для конденсационных процессов в почвах. Такими ограничениями являются низкие концентрации субстрата и сорбционные взаимодействия с минералами. В результате конденсация останавливается на стадии образования димеров. Полимеризация возможна при локально высоких концентрациях субстратов и застойном режиме. Установлено, что в гетерогенных системах в присутствие лакказы намного более глубоко протекают реакции окислительной трансформации фенольных субстратов, чем в гомогенных системах за счет сорбции продуктов реакции и смещения равновесия реакции в сторону образования продуктов. В результате, в присутствие лакказы происходит эффективная секвестрация ароматических соединений на минеральной фазе, что способствует накоплению ароматического углерода в почвах. На примере реакций феруловой кислоты с отмытым и разрушенным грибным мицелием, показано, что мицелий препятствует полимеризации фенольного соединения лакказой и направляет реакцию димеризации по пути образования продуктов, отличных от реакции без мицелия. Это существенно расширяет представления о метаболизме фенольных соединений грибами, однако механизм реакции требует дальнейшего изучения. Работы, выполненные в рамках проекта, вносят существенный вклад в понимание механизмов протекания окислительных реакций в почвах, в представления о молекулярной структуре и устойчивости гуминовых веществ как группы соединений, широко распространенных в почвах, осадках и природных водах. Доказана ключевая роль лакказы – окислительного фермента, наиболее распространенного в почвенных продуцентах, в синтезе и деструкции полифенольных ароматических компонентов почвенного гумуса. Впервые предложены модели взаимодействия фенольных субстратов и ГК с лакказой на основе анализа трехмерных структур фермента, накладывающие ограничения на размер реагирующих веществ. Клонированы гены лакказ лишайников, что не имеет аналогов в мировых исследованиях. Все запланированные по проекту работы выполнены. Дополнительно проведены исследования по изучению роли двухдоменных бактериальных лакказ в гумификации, существенно дополняющие представления о трансформации ГК при щелочных рН.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 30 апреля 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Экспериментальное обоснование роли лакказы в гумификации - определение активности в природных объектах и потенциала к модификации высокомолекулярных фракций почвенных гуминовых кислот |
Результаты этапа: Целью отчетного этапа исследований было экспериментальное обоснование роли лакказы в гумификации - определение активности фермента в природных объектах и потенциала к модификации почвенных гуминовых кислот. В результате проведенных работ получены данные об активности лакказы по сравнению с пероксидазами в типичных почвах горных тундр Севера европейской части России, почвах северной и южной тайги и лесостепи. Установлено, что активность и лакказ и пероксидаз максимальна в подстилках и снижается вниз по профилю, коррелируя с содержанием органического углерода. Активность лакказ в большинстве образцов почв была в 2-10 раз выше активности пероксидаз. Полученные данные позволяют судить о важной роли лакказ в окислительных процессах в почвах. Данные о природных величинах активности будут использованы в модельных экспериментах по синтезу гуминовых кислот на следующих этапах исследований. Проведены работы по изучению условий продукции лакказы и потенциала к деструкции гуминовых кислот у почвенных аскомицетов и базидиомицетов. В ходе работы с почвенными аскомицетами проведен поиск продуцентов лакказ в почвах зонального ряда путем посева материала водных вытяжек на агаризованную среду, содержащую субстрат лакказ – АБТС. Проведены видовая идентификация и оценка численности грибов в профилях почв. Установлено, что численность микромицетов была наибольшей в слое 0-10 см и снижалась вниз по профилю, коррелируя с содержанием углерода и активностью лакказ. Подстилка и гумусовые горизонты почв отличались большим видовым разнообразием по сравнению с нижележащими горизонтами, а луговые биоценозы - большим разнообразием, чем лесные. Численность грибов, окисляющих АБТС, составляла значительную часть от общей численности микромицетов в верхнем (0-10 см) слое почв. Наиболее часто встречаются и широко распространены в изученных почвах Acremonium (Gliomastix) murorum (Corda) W. Gams, Oidiodendron griseum Robak и Isaria fumosorosea Wize. Изучены условия продукции лакказы и взаимосвязь с деструкцией ГК у 9 штаммов. Установлено, что присутствие индукторов, в том числе ГК, не влияет на внеклеточную продукцию лакказы у изученных аскомицетов. Лакказы у аскомицетов оказались в основном конститутивные, продукция лакказы в жидкой среде выявлена только у Botritis cinerea (слабая и только без индукторов и ГК) и у А.murorum Z1710. Этот гриб одинаково активно продуцировал лакказу как без индукторов, так и в присутствии ГК. Установлено обесцвечивание ГК некоторыми штаммами микромицетов как на агаризованной, так и в жидкой среде. Однако, оно не всегда коррелировало с продукцией лакказы. Например, грибы Cladosporium allicinum Z1708, Isaria fumosorosea Z1709 и I. fumosorosea Z1704 обесцвечивали ГК в жидкой среде на 81%, 67% и 54% соответственно, но не продуцировали лакказу. Несмотря на самую высокую продукцию лакказы в жидкой среде, гриб А.murorum Z1710 обесцвечивал ГК в меньшей степени (43%), чем B.cinerea (62%), у которого продукция лакказы была незначительной. Тем не менее, впервые установлена однозначная корреляция между продукцией лакказы в жидкую среду и деструкцией ГК у представителя почвенных аскомицетов – гриба A. murorum. Роль лакказы и других окислительных систем микромицетов в деструкции ГК требует дальнейшего изучения. В ходе работы с почвенными базидиомицетами проведен поиск эффективных продуцентов окислительных ферментов (лакказа, пероксидазы) среди грибов, полученных из Всероссийской коллекции микроорганизмов. Обнаружено, что самыми активными продуцентами лакказы являются грибы Coprinus comatus F-2940 и Stropharia rugosoannulata F-3134, при этом самым эффективным индуктором фермента являлись ионы меди в концентрации 0.5 мМ. Дополнительно к продукции лакказы гриб S. rugosoannulata так же продуцировал Mn-пероксидазу в лигнинолитических условиях (рост в условиях голодания культуры по азоту, наличие в среде культивирования иоинов Mn2+). Впервые изучен относительный вклад целлюлолитических и окислительных ферментов в деструкцию ГВ почвенными базидиомицетами C. comatus и S. rugosoannulata в условиях их роста на целлюлозе и глюкозе. В ходе роста на средах, содержащих целлюлозу в качестве источника углерода, грибы проявляли высокую целлюлазную и целлобиозо дегидрогеназную (ЦДГ) активности. Обнаружено, что трансформация ГК зависит от условий культивирования грибов. В условиях продукции грибами лакказы на среде с глюкозой наблюдалась деполимеризация ГК в культурах обоих грибов, при этом в ходе роста грибов в целлюлолитических условиях деполимеризация ГК лакказой происходила в меньшей степени. Для установления роли ферментов в трансформации ГК исследована реакция деполимеризации ГК культуральной жидкостью грибов, выращенных в целлюлолитических условиях и обладающей целлюлазной, лакказной и ЦДГ активностью. Активности отдельных ферментов ингибировали. В результате установлено, что гидролитические ферменты (целлюлазы, гемицеллюлазы) не трансформируют ГК. Установлена ключевая роль лакказы в деполимеризации ГК. Наблюдаемое в целлюлолитических условиях снижение деполимеризации ГК лакказой было вызвано активностью ЦДГ, которая восстанавливает окисленные ГК в нативное состояние в ходе окисления целлобиозы. Аналогично лакказе, в лигнинолитических условиях ключевым ферментом, отвечающим за трансформацию ГК, являлась Mn-пероксидаза. Под воздействием Mn-пероксидазы ГК также подвергались деполимеризации, но, в целлюлолитических условиях, деполимеризация была снижена, что так же обуславливалось активностью ЦДГ. Таким образом, установлена ведущая роль окислительных ферментов в деструкции ГВ и доказана роль лакказ почвенных базидиомицетов в этом процессе. Установлено, что почвенные ГК вне связи с минеральной матрицей неустойчивы к действию окислительных ферментов. Их деполимеризация в присутствие лакказ и Мn-зависимой пероксидазы, т.е. ферментов, действующих на ковалентные связи фенольных субстратов, доказывает важную роль С-С связей в формировании макромолекулярной структуры гумусовых веществ. Дополнительно к запланированным работам изучено взаимодействие с ГК двухдоменной лакказой (2д лакказой), широко распространённой среди почвенных бактерий и считающейся эволюционным предшественником грибных лакказ. Была получена рекомбинантная 2д лакказа бактерии Streptomyces anulatus VKM Ac-728, которую очистили до электрофоретически гомогенного сотояния и провели реакцию с ГК при оптимальном значении рН 9.0. Обнаружено, что 2д лакказа способна полимеризовать ГК - как её высокомолекулярную фракцию, так и низкомолекулярную. Такое свойство 2д лакказы указывает на широкий адаптивный потенциал бактерий рода Streptomyces, а также на то, что в эволюционном плане бактерии раньше грибов начали трансформировать ГК. Проведен обзор трехмерных структур лакказ, депонированных в базе PDB. Так как нами была обнаружена активность 2д лакказ в отношении ГК, обзор проводился как для структур трёхдоменных лакказ грибов (3д лакказы), так и 2д лакказ. Показано, что активный центр 3д и 2д лакказ построен аналогичным способом – состоит из Т1 и Т2/Т3 медьсодержащих центров. Связывание субстратов происходит возле Т1 медьсодержащего центра. Восстановление кислорода происходит в Т2/Т3 медьсодержащем центре. Доступ кислорода к функциональному центру осуществляется по Т3-каналу, а перенос протонов идёт по Т2-каналу. С поверхности молекулы фермента к Т2/Т3 центру проходят внутримолекулярные каналы, по которым в активный центр попадает кислород и удаляется продукт реакции – вода. Обнаружено, что внутримолекулярные каналы 3д лакказ и 2д лакказ существенно различаются. У 3д лакказ каналы широкие, у 2д лакказ каналы менее доступные, поскольку прикрыты боковыми группами некоторых аминокислотных остатков. Разница строения внутримолекулярных каналов, вероятно, объясняет различия каталитических свойств 2д и 3д лакказ. Показано, что в настоящее время не описано структур как 3д, так и 2д лакказ с полифенольными соединениями, описано очень мало структур фермент-субстратных комплексов лакказы. Тем не менее, на основании существующих структур возможно построение моделей взаимодействия лакказ с ГВ. Проведен анализ последовательностей генов, кодирующих лакказы. В результате были определены консервативные медьсвязывающие участки генов лакказы различных организмов. На основании обнаруженных участков генов был разработан набор праймеров, и проведена ПЦР с тотальной ДНК из таллома лишайников. Была разработана методика, обеспечивающая получение ДНК из талломов необходимого для ПЦР качества, что оказалось нетривиальной задачей. На основании анализа количества генов рРНК в тотальной ДНК было обнаружено, что в полученных препаратах ДНК присутствует как ДНК цианобионта, так и микобионта лишайника. Для оценки количества специфической ДНК в препаратах тотальной ДНК талломов использован метод полуколичественного ПЦР со специфическими праймерами к генам рибосомальной РНК(рРНК) цианобактерий и микобионтов. Обнаружено, что в полученных препаратах тотальной ДНК талломов содержание ДНК микобионтов составляет около 10%, что достаточно для дальнейшей работы. Проведена ПЦР для участков генов лакказы 9 лишайников порядка Peltigerales. Получены и клонированы продукты ПЦР. Первичные результаты показали, что в талломах лишайников содержится несколько генов лакказы, кодирующих разные формы фермента. Изучены параметры удерживания модельных минеральных фаз во вращающихся спиральных колонках (ВСК) и микроколонках, которые мы считаем перспективными системами для изучения процессов гетерогенного синтеза гуминовых веществ в динамических условиях. В связи с техническими трудностями удерживания образцов глин в ВСК, для моделирования реакций гумификации выбраны проточные микроколонки. Проведена иммобилизация лакказы базидиомицета Cerrena unicolor (фермент был наработан и очищен до электрофоретически гомогенного состояния) на немодифицированном каолините и каолините, на котором был осажден гидроксид алюминия. Установлено, что активность лакказы лучше сохранялась на каолините-Al(OH)х, и этот носитель был выбран для дальнейших исследований. Проведена оценка эффективности проточных колонок для изучения процессов сорбции предшественников гуминовых веществ минеральной фазой. Изучена сорбция модифицированным каолинитом смеси фенольных кислот – галловой, протокатеховой, п-оксибензойной, ванилиновой, сиреневой и феруловой в проточном режиме (эта работа была запланирована на второй год исследований). Параллельно проводили сорбцию в традиционных статических условиях, используя различные концентрации раствора смеси кислот. Установлено, что сорбция галловой и протокатеховой кислот, содержащих ОН-группы в орто-положении, на порядок превышает сорбцию п-оксибензойной кислоты и метоксилированных кислот – ванилиновой, сиреневой и феруловой. Изучение сорбции в динамическом (проточном) режиме дало уникальную возможность показать конкуренцию кислот за центры связывания на каолините-Al(OH)х. Сорбирующаяся галловая кислота вытесняла остальные кислоты, которые переходили в раствор в следующем порядке п-оксибензойная > ванилиновая > сиреневая >> феруловая > протокатеховая. Установленные закономерности сорбции свидетельствуют о важной роли орто-замещенных гидроксибензойных кислот в формировании состава органического вещества почв, тогда как п-оксибензойная, ванилиновая и сиреневая кислоты имеют большее значение для формирования состава почвенных растворов и природных вод. Результаты эксперимента планируется учитывать при выборе соединений-предшественников гуминовых кислот в экспериментах по моделированию синтеза ГВ. Таким образом, все работы, запланированные на 2017 год, выполнены в полном объеме. Все намеченные результаты достигнуты. Помимо этого, проведен ряд дополнительных исследований. В частности, изучено взаимодействие ГК 2д лакказой, которая, как было показано, способна полимеризовать как высокомолекулярную, так и низкомолекулярную фракцию ГК. В динамическом режиме изучена конкурентная сорбция смеси фенольных кислот модифицированным каолинитом. | ||
2 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Развитие концепции гетерогенного биокатализа в гумусообразования и изучение роли лакказы свободноживущих грибов в формировании и модификации макромолекулярной структуры гумусовых веществ in vivo |
Результаты этапа: Темноокрашенные аморфные продукты деструкции органических остатков (гуминовые вещества) относятся к самым распространенным геомолекулам в биосфере, процесс их образования второй по масштабу в цикле углерода после фотосинтеза, а накопление в почвах приводит к формированию пула органического углерода, втрое превышающего таковой в биомассе. При этом, молекулярная структура, биохимическая устойчивость и время появления в биосфере ГВ остаются невыясненными. За отчетный период решены три крупные задачи: 1) установлено отсутствие модифицирующего влияния кислорода на молекулярно-массовые распределения и структурно-функциональные свойства ГВ, экстрагируемых из почв щелочными растворителями; 2) установлена важная роль лакказ почвенных грибов и бактерий в формировании и модификации макромолекулярной структуры гуминовых веществ (ГВ) in vitro. При этом, выбор продуцентов, эволюционировавших в ранние эпохи – микроскопических грибов, лишайников и бактерий, позволил проследить роль лакказы в гумификации в геологическом масштабе времени; 3) на основе изучения процессов сорбции и окислительной трансформации фенольных кислот на каталитически активной минеральной фазе в динамическом режиме, имитирующем почвенные условия, обоснованы ограничения концепции гетерофазного биокатализа в гумусообразовании, предложенной авторами проекта. Проведено сравнение физико-химических свойств препаратов ГК, выделенных из почв 0.1 M NaOH с продувкой инертным газом (аргоном) и без его использования. Изучали ГК из горизонтов A1 двух контрастных по условиям гумусообразования типов почв – дерново-подзолистой и чернозема, являющихся зональными почвами южной тайги и степи. Проводили сравнение препаративного выхода гуминовых веществ (по Сорг), элементного, структурно-группового, функционально-группового и молекулярно-массового состава ГК, парамагнитных свойств, а также спектров поглощения в видимой, ультрафиолетовой и ИК областях. Для обеих изученных почв установлено отсутствие статистически значимых различий в количественном выходе, молекулярно-массовом распределении, спектрах поглощения в УФ, видимой и ИК областях между препаратами ГК, выделенными щелочной экстракцией в атмосфере аргона и без его использования. В то же время элементный анализ, потенциометрическое титрование, спектроскопия ЯМР на ядрах 1H и 13С и электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) выявили, соответственно, более высокие отношения O:C, более высокое содержание хинонных и карбоксильных групп и существенно большее содержание свободных радикалов в препарате ГКД, выделенном без аргона, что может свидетельствовать о процессах окисления компонентов щелочной вытяжки из дерново-подзолистой почвы при экстракции в присутствии молекулярного кислорода. В ГКЧ указанных отличий не найдено, что может свидетельствовать о глубокой окислительной трансформации соединений органических остатков в процессе их гумификации в черноземах. В результате, щелочные условия и присутствие молекулярного кислорода не вызывают дальнейшего окисления ГК. Были выделены и очищены до электрофоретически гомогенного состояния лакказы почвенного микромицета Botritis cinerea, двухкомпонентных лишайников Peltigera canina и P.rufescens. Проведена реакция с гуминовыми кислотами при рН 4.5. Установлено, что ферменты этих продуцентов полимеризовали ГК. Изучена трансформация ГК эволюционно древней формой лакказы – двухдоменной лакказой бактерий. Получены электрофоретически гомогенные препараты рекомбинантной 2D лакказы распространенных в почвах бактерий рода Streptomyces, изучены их свойства. 2 D лакказы отличаются от грибных лакказ - обладают высокой термостабильностью (активность сохраняется при 90оС) и щелочным оптимумом (рН 8.5-8.9) при окислении фенольных субстратов. Установлено, что препараты 2D лакказ полимеризовали ГК дерново-подзолистой почвы, чернозёма, а также их высоко- и низкомолекулярные фракции, полученные высаливанием. Таким образом, установлено, что в щелочных условиях реакция трансформации ГК сдвинута в сторону полимеризации. В отсутствие лакказы полимеризацию ГК не наблюдали, что указывает на ведущую роль окислительных биокаталитических реакций в синтезе ГК. В рамках развития концепции гетерофазного биокатализа определены условия иммобилизации лакказ базидиомицета белой гнили L.tigrinus, подстилочного базидиомицета С.comatus и лишайника S.crocea на глинистых минералах, определены условия функционирования лакказ. Установлено, что при рН 4.5 фермент быстро, полностью и практически необратимо cорбируется минералами. Установлено, что каолинит, модифицированный аморфной гидроокисью алюминия, обладает наибольшей емкостью поглощения по отношению к лакказе, при этом активность лакказы сохраняется на 50-90%. Установлено, что при сорбции лакказа достаточно долго сохраняет активность. На основе изучения процессов конкурентной сорбции и окислительной трансформации фенольных кислот на модифицированном каолините в проточном режиме в присутствие и отсутствие иммобилизованной лакказы C.comatus, определены условия сорбции кислот и обоснованы ограничения концепции гетерофазного биокатализа в гумусообразовании. Установлено, что присутствие распространенных в почвах конкурирующих ионов, таких, как ацетат-ион, резко снижает сорбцию всех кислот минералом. Сорбция галловой и протокатеховой кислот почти на порядок превышала таковую остальных кислот, что предполагает селективность сорбции и важную роль ортозамещенных кислот в формировании пула стабильного углерода в почвах. Наличие инактивированной лакказы уменьшает количество доступных для связывания кислот активных центров приблизительно на 30-40%. Активная лакказа повышала сорбцию галловой, протокатеховой и сиреневой кислот. Установлено, что эти соединения быстро окисляются лакказой, что предполагает их первоочередную роль в гумификации. Таким образом, установлено отсутствие модифицирующего влияния кислорода на молекулярно-массовый и структурно-групповой состав ГК, выделенных из двух контрастных по условиям гумусообразования типов почв – яернозема и дерново-подзолистой почвы. Поэтому можно считать, что высокомолекулярные фракции ГК в щелочных экстрактах из почв не являются артефактом экстракции. Показано, что лакказа может принимать участие в синтезе ГВ как при кислых значениях рН (лакказа микромицетов и лишайников), так и в щелочной области рН (двухдоменная бактериальная лакказа). Результаты имеют первостепенное значение для понимания процесса гумификации как в эволюционном аспекте, так и в почвах с разными значениями рН. Факт полимеризации ГК в присутствие лакказ доказывает важную роль окислительных реакций в формировании структуры ГК, роль вторичных реакций конденсации (ныне отрицающихся) в образовании ГК. Показано, что вне связи с минеральной матрицей ГК неустойчивы к действию окислительных ферментов, что подтверждает концепцию о ведущей роли органо-минеральных взаимодействий в стабилизации органического углерода в почвах. Установлено, что в условиях динамического эксперимента (промывном режиме) и при низких концентрациях кислот (1 мМ) не происходит образования полимерных продуктов в гетерофазном биокатализе. Полимеризация скорее всего возможна в застойных статических условиях, как было показано нами ранее. Роль реакций гетерогенного биокатализа в синтезе ГВ требует дальнейшего изучения. | ||
3 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Изучение реакционной способности лакказ лишайников в отношении фенольных субстратов, изучение свойств лакказ, их структуры и происхождения. |
Результаты этапа: Название этапа было изменено, в связи со скорректированным планом работ 3 этап (2019 год). Изучение трехмерной структуры лакказ грибов и бактерий, моделирование реакций с фенольными соединениями и гуминовыми веществами, получение рекомбинантных лакказ лишайников, установление роли лакказ лишайников в гумусообразовании. Установление роли гетерофазных реакций в гумификации. В соответствии с планом работы на 2019 год решены следующие крупные задачи и получены соответствующие результаты: 1) на основе построения трехмерных структур лакказ и моделирования in silico установлены механизмы взаимодействия ГК с лакказами различных продуцентов, позволяющие судить о размере компонентов ГК, участвующих в реакциях с лакказой. Изучение двухдоменной лакказы бактерий, как наиболее древней формы фермента, позволило экстраполировать данные на геологический отрезок времени; 2) впервые проведено полногеномное секвенирование талломов двух лишайников порядка Peltigerales, обнаружено, что гены лишайников эволюционно далеко отстоят от генов лакказ наиболее близких грибов-аскомицетов и эволюционировали независимо; 3) установлено, что интактные талломы лишайников не способны к деструкции ГК, однако активно поглощают меченые соединения глюкозу и глицин, что свидетельствует о возможности органотрофного питания у этих автотрофных организмов; 4) впервые установлена модифицирующая в отношении продуктов реакции роль клеточных стенок грибов при окислении лакказой низкомолекулярных фенольных соединений, что существенно расширяет представления о метаболизме этих соединений грибами; 5) на основе изучения окислительной трансформации фенольных кислот в присутствии связанной с каолинитом лакказы в динамическом промывном режиме и при почвенных концентрациях мономеров установлено, что в этих условиях не происходит образования полимерных фракций, характерных для щелочных экстрактов из почв. Обоснованы ограничения для конденсационных процессов синтеза ГК в почвах. На основе рентгеноструктурного анализа кристаллов, полученных на этапе 2 исследований, с высоким разрешением (1,8 А, 2 А и 1,7 А соответственно) решены и описаны трехмерные структуры двухдоменных бактериальных лакказ из Streptomyces puniceus Ac-579 и S. griseoflavus Ac-993, а так же трёхдоменной лакказы базидиомицета Cerrena unicolor. Исходя из анализа размеров и окружения Т1 медьсодержащего центра двухдоменных и трёхдоменных лакказ, отвечающего за первичное окисление субстрата, проведено моделирование взаимодействия двухдоменной и трёхдоменной лакказы с гуминовыми кислотами in silico, Показано, что у обоих типов лакказы окружение Т1 центра устроено схожим образом, и позволяет им взаимодействовать с субстратами при условном диаметре молекулы 10 Å. При этом, окружение Т2/Т3 центра, размер каналов, ведущих с поверхности молекулы к этому центру, и их окружение у двухдоменных и трёхдоменных молекул кардинально отличаются. У двухдоменных лакказ каналы более узкие и формируются аминокислотами с отрицательными зарядами. Такая структура каналов определяет способность двухдоменных лакказ катализировать окисление фенольных субстратов при щелочных значениях рН и их устойчивость к ингибиторам, так как гидроксид ионам и ингибиторам сложнее проникнуть к Т2/Т3 медьсодержащему центру. Средний размер молекул гуминовых и фульвокислот, определенный по радиусам вращения при рН 3.5-7.0 составляет от 17-19 А до 60-100 А (Stevenson, 1994). Однако, нами показано, что как трёхдоменные, так и двухдоменные лакказы способны окислять высокомолекулярную и низкомолекулярную фракции ГК. Видимо, в ГК существуют структуры, размер которых меньше указанного. Таким образом, на основании анализа окружения T1 центра обеих типов установлен размер компонентов ГК (не более 10 А), которые могут подходить к этому центру и непосредственно с ним взаимодействовать. За счёт окисления этих компонентов происходит трансформация ГК лакказами. Трансформация (деградация) компонентов ГК размером > 10 А, происходит, видимо, за счет активных форм кислорода, генерируемых лакказами в гидрохинон редокс цикле. Для полного определения последовательности всех генов лакказы, содержащихся в геноме лишайников впервые проведено секвенирование тотальной геномной ДНК, выделенной из талломов двух лишайников P.canina и S.crocea по технологии «illumina». В результате получено около 2Gb первичных данных для каждого препарата ДНК. Восемь последовательностей клонированных на 2 этапе исследований генов лакказ использованы для поиска генов лакказ в полученных последовательностях. В результате, для образца тотальной ДНК P. canina обнаружены четыре, а для образца из S. crocea - два контига, имеющих участки с высокой степенью идентичности с клонированными ранее последовательностями лакказ. Гены лакказ лишайников не содержат особых гидрофобных последовательностей, отвечающих за связывание с мембраной, при этом известно, что большая часть лакказ в лишайниках связана с клеточной стенкой. Взаимодействие лакказы с мембранами происходит, видимо, за счёт низкомолекулярных алифатических соединений, связанных с лакказой (установлено в ходе работ на этапе 2) и превращающих мономерные лакказы в гетеромеры. Поиск гомологов клонированных генов лакказ позволил выявить лакказы с наиболее высокими показателями идентичности (51-56%) аминокислотных последовательностей, принадлежащих представителям родов Glonium, Fusarium, Hypoxylon, Microdochium и Metarhizium. Все представители данных родов значительно филогенетически удалены от лишайников порядка пельтигеровых. Эволюционный анализ показал, что филогенетическое расстояние между генами лакказ представителей семейства пельтигеровых, к которому относятся P. canina и S.crocea, меньше чем филогенетическое расстояние между ними и генами лакказ свободноживущих грибов. Наиболее близкие филогенетические кластеры формировали гены лакказ из различных лишайников, а не из одного и того же таллома. Это может указывать на наличие способности каждого штамма лишайника синтезировать несколько белков лакказ, по-видимому, обладающих различной специфичностью и свойствами. Проведены реакции интактного таллома Peltigera canina c мечеными по 13С глюкозой и глицином, а также синтезированными из них и фенольных соединений гуминовыми кислотами. Установлен активный транспорт глюкозы и глицина талломами P.canina и включение этих соединений в биомассу, что подтверждает исследования других авторов и свидетельствует о возможности органотрофного питания у лишайников. Однако, деградации высокомолекулярных соединений (ГК) и включения связанных с ними меченых низкомолекулярных веществ в биомассу не установлено. ГК сорбировались на клеточных стенках в области “жилок”, с которыми у лишайников ассоциированы лакказы. Установлено потемнение жилок с сорбированными ГК, что может свидетельствовать о полимеризующей функции лакказ, препятствующей проникновению низкомолекулярных компонентов ГК в таллом, как это предложено для лакказ дереворазрушающих грибов. Таким образом, установлено, что лакказы в лишайниках принимают участие скорее в синтезе ГК, чем в деструкции. В рамках исследований, направленных на установление роли гетерофазного биокатализа в гумификации, изучена трансформации ГК из дерново-подзолистой почвы лакказой, связанной с мицелием гриба C.unicolor. Установлено, что в ходе реакции не происходит изменения в молекулярной массе ГК как связанной с мицелием, так и в жидкой фазе реакционной смеси. Однако, при внесении в смесь лакказы этого гриба установлена полимеризация ГК - как фракции, связанной с мицелием, так и фракции, с мицелием не связанной. Таким образом, установлено, что связанные с клеточной стенкой лакказы слабо трансформируют ГК, в отличие от несвязанного фермента. Изучено влияние мицелия гриба С.unicolor на полимеризацию низкомолекулярных фенольных соединений на примере реакции лакказы с феруловой кислотой. Установлено, что первичными продуктами окисления феруловой кислоты лакказой без мицелия являются 5 диферуловых кислот, которые далее полимеризуются до водонерастворимого соединения. В присутствии мицелия феруловая кислота и продукты ее окисления сразу сорбируются на мицелии. Среди продуктов реакции диферуловые кислоты составляют 3-5% от количества, обнаруживаемого в реакционной смеси без мицелия, так же не происходит полимеризации феруловой кислоты. В качестве главного продукта реакции с помощью 1Н,13С-ЯМР идентифицирован продукт димеризации 3-метокси4-гидроксифенилэтинил-фурил-2окси-3-метокси4-гидроксифенил (МГФ). Таким образом, нами впервые установлено, что мицелий препятствует полимеризации фенольных соединений лакказой и направляет реакцию по пути образования продуктов, отличных от реакции без мицелия. Конкретный механизм данной реакции требует дальнейшего изучения. Изучена трансформация фенольных кислот лакказой, иммобилизованной на каолините, модифицированном гидроксидом алюминия, в условиях проточной колонки при разных количествах/активности фермента, скоростях потока и при почвенных концентрациях мономеров (0.01 мМ). Также проведены реакции фенольных кислот с лакказой в статических условиях с минералом и без для установления влияния минерала на скорость трансформации фенольных кислот. Установлено, что в присутствии лакказы существенно возрастало количество связанных с минералом галловой, феруловой и сиреневой кислот – соединений, наиболее активно окисляемых ферментом. В присутствии минерала скорость трансформации этих соединений (убыль исходных веществ) возрастала в 2 раза по сравнению с гомогенными системами (без минерала). Таким образом, установлено, что гетерогенные окислительные реакции являются важным фактором секвестрации ароматического углерода в почвах. Для изучения молекулярной массы продуктов гетерогенного биокатализа, сорбированных на минерале, на данном этапе исследований использовали их экстракцию 0.1 М HCl, т.к. ранее нами установлено, что 95% кислот, сорбируемых модифицированным каолинитом, связывается с гидроксидом алюминия, которым растворим при рН<2. Экстракция кислотой позволяет избежать артефактов, связанных с традиционной щелочной экстракцией. В результате анализа молекулярной массы веществ, связанных с минералом, не обнаружено полимеров, характерных для щелочных экстрактов из почв, и образующихся в условиях статического гетерогенного биокатализа при высоких концентрациях мономеров. Однако, с большой долей вероятности можно говорить о реакциях димеризации. На основе проведенных работ нами установлены ограничения для протекания конденсационных процессов гумификации в почвах. Такими ограничениями являются низкие концентрации фенольных субстратов и малое время их взаимодействия с ферментом в проточных условиях. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".