ИСТИНА

Идентифицировано примерно 20 мутаций в генах, кодирующих тропомиозин человека, которые приводят к дисфункции скелетных мышц. Однако клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе развития скелетных миопатий, остаются неизвестными. Причиной немалиновой миопатии, характеризующейся мышечной гипотонией, слабостью и присутствием немалиновых тел в мышечной клетке могут являться точечные мутации Glu41Lys или Gln147Pro в гене, кодирующем бета-тропомиозин. В литературе недостаточно данных о действии этих мутаций на функцию актомиозина. Предлагаемый проект станет первым исследованием влияния мутаций в тропомиозине Glu41Lys и Gln147Pro на структурное состояние актина, миозина и тропомиозина в мышечном волокне. Результаты, которые будут получены в ходе выполнения работы, необходимы для разработки эффективных терапевтических подходов при лечении заболеваний.

Данные, которые можно получить при осуществлении проекта с помощью метода поляризационной флуориметрии, несомненно, будут приоритетными и дополнят результаты изучения различных мутаций в мышечных белках, полученных с помощью других методов исследования (электронная микроскопия, FRET и др.). Ожидается впервые получить результаты, которые позволят проанализировать: 1. структурное состояние актин-миозинового комплекса в мышечном волокне в присутствии мутантных форм тропомиозина (Glu41Lys и Gln147Pro); 2. конформационные перестройки компонентов регуляторной системы скелетного мышечного волокна, содержащей мутантные формы тропомиозина, на различных стадиях АТФазного цикла; 3. позицию мутантных форм тропомиозина и их гибкость в разных биохимических состояниях тонкого филамента; 4. Mg-АТФазную активность актомиозина в присутствии мутантных форм тропомиозина; 5. влияние мутаций в тропомиозине на силу, развиваемую одиночным мышечным волокном. Результаты предлагаемого исследования планируется сравнить с опубликованными данными, полученными при исследовании точечной мутации Glu117Lys в тропомиозине, ассоциированной с немалиновой миопатией [Karpicheva et al., 2013]. Анализ данных позволит ответить на вопрос, какие нарушения в структурно-функциональных свойствах мышечных белков приводят к мышечной слабости при немалиновой миопатии, вызванной мутациями в скелетном тропомиозине.

В настоящей работе с помощью метода поляризационной микрофлуориметрии было исследовано влияние двух из таких мутаций Gln147Pro и Glu41Lys на позицию и гибкость тропомиозина и на структурные перестройки актина и головки миозина при моделировании в одиночном мышечном волокне нескольких стадий цикла гидролиза АТФ. Тропомиозин дикого типа и с мутацией Gln147Pro или Glu41Lys, актин и субфрагмент-1 миозина были модифицированы 5-IAF, 1,5-IAEDANS или FITC-phalloidin, и 1,5-IAEDANS, соответственно, и встроены в одиночное мышечное волокно, преимущественно состоящее из актиновых нитей. Также было проведено исследование влияния мутации Gln147Pro на сродство тропомиозина к актину методом высокоскоростного соосаждения и на его вторичную структуру методом кругового дихроизма; определено относительное количество Gln147Pro тропомиозина, которое связывается с актином в мышечном волокне; изучено влияние мутаций Gln147Pro и Glu41Lys в тропомиозине на АТФазную активность головок миозина в растворе; исследовано влияние модификации флуоресцентным зондом 1,5-IAEDANS субфрагмента-1 миозина (S1) на актин-активируемую Mg-АТФазную активность S1 и на сродство S1 к актину в отсутствие нуклеотида и в присутствии АДФ, AMPPNP и АТФ. Получены приоритетные данные о том, что тропомиозин с мутацией Gln147Pro связывается с актином в мышечном волокне, несмотря на резкое снижение сродства такого тропомиозина к актину в растворе белков, но локализуется ближе к внутреннему домену актиновой нити в открытой позиции и теряет способность переходить в закрытую позицию в присутствии АТФ [Karpicheva et al., 2016, Biochim. Biophys. Acta 1864: 260–7]. Результатом смещения тропомиозина является увеличение числа головок миозина в состоянии сильного связывания с актином, что может являться первичной причиной нарушения сократительной функции мышцы в присутствии мутации Gln147Pro. Молекулярные механизмы дисфункции мышц в присутствии мутации Glu41Lys в тропомиозине, по-видимому, отличаются. Мутантный Glu41Lys тропомиозин, наоборот, смещается в закрытую позицию, переводит актиновые мономеры в выключенное состояние и ингибирует образование сильной формы связывания головок миозина с актином [Borovikov et al., 2015, Arch. Biochem. Biophys. 577–8: 11–23]. Обнаружено, что Gln147Pro мутантный тропомиозин слабо ингибирует АТФазную активность миозина, тогда как Glu41Lys тропомиозин ингибирует ее сильнее. Получены предварительные данные о том, что тропонин при низкой и высокой концентрациях кальция модулирует влияние обеих мутаций на структурные перестройки актомиозина, усиливая их эффекты. Несмотря на различные молекулярные механизмы мутаций Gln147Pro и Glu41Lys, нарушение правильной регуляции актомиозинового взаимодействия в обоих случаях приводит к ослаблению сократительной функции скелетных мышц. Выполненный проект вызвал много новых вопросов, интересных с точки зрения изучения фундаментальных основ мышечного сокращения, разработки диагностических критериев и поиска мишеней для применения лекарственных препаратов с целью устранения негативных первичных эффектов мутаций в сократительных белках.