ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
На сегодняшний день идентифицировано примерно 20 мутаций в генах, кодирующих тропомиозин человека, которые приводят к дисфункции скелетных мышц. Однако клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе развития скелетных миопатий, остаются неизвестными. Причиной дистального артрогрипоза, характеризующегося формированием множественных контрактур и деформацией суставов, могут являться точечные мутации Arg91Gly и Glu139del в гене, кодирующем бета-тропомиозин. Сведения о механизмах влияния этих мутаций на функцию актомиозина, представленные в литературе очень скудны. Предлагаемый проект станет первым исследованием влияния мутаций в тропомиозине Arg91Gly и Glu139del на работу тропонина в цикле гидролиза АТФ и на структурное состояние актина, миозина и тропомиозина в мышечном волокне. Результаты, которые будут получены в ходе выполнения работы, необходимы для разработки подходов лечения мышечных заболеваний, а также для более глубокого понимания молекулярных механизмов регуляции сокращения мышечного волокна.
В ходе выполнения работы будут впервые получена информация о влиянии Arg91Gly и Glu139del мутаций бета-тропомиозина на конформационные перестройки актина, миозина и бета-тропомизина происходящие при моделировании различных промежуточных стадий цикла гидролиза АТФ. Изучение структурного состояния сократительных белков, будет проводиться с помощью адекватного для таких исследований поляризационной микрофлуориметрии, разработанного в нашей лаборатории. Получение информации с помощью этого метода осуществляется при изучении поляризованной флуоресценции красителя, специфически связанного с белком в одиночном мышечном волокне. Анализ поляризованной флуоресценции осуществляется с помощью модель зависимого и недавно предложенного модель-независимого методов исследования. Перспективным объектом для изучения молекулярных механизмов регуляции сокращения скелетных мышц являются модели мышечных волокон, из которых избирательно удалены миозин, тропомиозин и тропонин (так называемые «теневые» мышечные волокна). Такие модели содержат чистые актиновые нити, которые легко становятся регулируемыми после реконструкции в них соответствующих белковых регуляторных систем. Методы реконструкции регулируемых актиновых нитей необходимого белкового состава разработаны в нашей лаборатории. Чтобы получить информацию о структурном состоянии Ф-актина, тонкие нити теневых мышечных волокон будут избирательно модифицированы флуоресцентными зондами FITC-фаллоидином или 1,5 IAEDANS. Первая метка специфически связывается с тремя соседними мномерами актина и позволяет получить информацию об изменении пространственной организации мономеров актина в Ф-актиновой спирали тонких нитей. Вторая метка специфически связывается с Cys374 актина и позволяет получить данные о вращении субдомена-1 малого домена молекулы актина. Чтобы получить информацию о структурном состоянии моторного домена миозина субфрагмент-1 будет избирательно модифицирован по Cys-707 флуоресцентным зондом 1,5-IAEDANS. Кроме того, будут использоваться полученные в клетках E. coli рекомбинантные скелетные бета-тропомиозин «дикого» типа и тропомиозины с мутациями Arg91Gly и Glu139del. Тропомиозины будут модифицироваться флуоресцентным красителем 5-IAF. Актин и субфрагмент-1 миозина будут выделены из скелетных мышц кролика. Различные промежуточные состояния актомиозина будут моделироваться в присутствии MgADP, MgATP, MgAMP-PNP, MgATPgammaS и в отсутствие нуклеотида.
Подход к изучению влияния мутаций в тропомиозине на актин-миозиновое взаимодействие в мышечном волокне был впервые предложен в нашей лаборатории несколько лет назад. В большинстве лабораторий, изучающих основы мышечного сокращения, исследуются структурно-функциональные свойства мутантных белков, с использованием растворов мышечных белков. В наших исследованиях получение данных осуществляется непосредственно в мышечном волокне, что даёт более полную картину механизма белок-белковых взаимодействий и влияния точечных мутаций в белках на сократительную функцию волокна. Используя такой подход были получены данные о нарушениях в работе актомиозинового мотора, вызванных мутациями в сердечном тропомиозине, связанными с гипертрофической и дилатационной кардиомиопатиями. Впервые было показано, что к смещению тропомиозина на актиновом филаменте может приводить, даже замена одного аминокислотного остатка в тропомиозине. Как результат, возможно, как увеличение относительного количества включенных мономеров актина и миозиновых головок в сильной форме связывания с актином, так и недостаточное включение актиновой нити и ослабление формирования сильной формы связываним миозина с актином. Полученные результаты хорошо согласуются с данными порученными сотрудниками лаборатории проф. Х. Уоткинса которые свидетельствуют о том, что в основе дилатационной и гипертрофической кардиомиопатий лежат разные молекулярные механизмы, которые приводят к понижению или повышению кальциевой чувствительности тонкого филамента, соответственно. Исследования молекулярных механизмов нарушения регуляции мышечного сокращения точечными мутациями тропомиозина необходимы для разработки подходов к лечению заболеваний, связанных с дисфункцией мышечной ткани. Кроме того, изучение влияния различных точечных мутаций сократительных и регуляторных белков существенно расширяют и углубляют представления о механизмах мышечного сокращения и механизмах регуляции актин-миозинового взаимодействия.
Дать ответ на вопрос, какие изменения в работе актин-миозиновой системы вызывают мутации Arg91Gly и Glu139del в бета-тропомиозине. Попытаться понять этиологию дистального артрогрипоза на молекулярном уровне.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Изучение молекулярных механизмов нарушения сократительной функции при дистальном артрогрипозе, вызванном Arg91Gly и Glu139del мутациями в бета-тропомиозине человека |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".