|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Адресные наногибридные материалы для терапии и диагностики онкологических патологийНИР
Targeted nanohybrid materials for therapy and diagnostics of oncological pathology
- Руководитель НИР: Мажуга А.Г.
- Участники НИР: Абакумов М.А., Ефимова Л.В., Ефремова М.В., Захарова А.А., Клячко Н.Л., Низамов Т.Р., Никитин А.А., Першина А.Г., Уварова В.И.
- Подразделение: Кафедра органической химии
- Срок исполнения: 31 мая 2017 г. - 31 декабря 2018 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 17-14-01316
- Номер ЦИТИС: АААА-А17-117042810113-5
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Живые системы, медицинские технологии, медицинская химия и новые лекарственные средства
- ПН России: Индустрия наносистем
- Направление технологического прорыва России: Медицинские технологии и лекарственные средства
-
Рубрики ГРНТИ:
- 76.03.31 Медицинская биохимия
-
Ключевые слова:
нацеливание к опухоли, магнитные наночастицы, тераностика, векторные пептиды, системы адресной доставки, наносистема
peptide vectors, nanosystem, theranostics, magnetic nanoparticles, tumor targeting, targeted delivery systems -
Описание:
Заболеваемость онкологическими патологиями на сегодняшний день занимает одну из лидирующих позиций в структуре смертности. Ежегодно в мире регистрируется порядка 6 миллионов новых случаев рака. В области терапии опухолей на сегодняшний день, наряду с хирургическим удалением, ведущими методами остаются химиотерапия и лучевая терапия. Данные методы, несмотря на эффективность, оказывают ряд негативных побочных эффектов на организм пациента. Это обуславливает острую необходимость перехода от системной терапии к локальному воздействию. Идея создания миниатюрных интеллектуальных устройств, которые могли бы направлено перемещаться внутри человеческого тела в область опухолевого роста, накапливаться в опухоли и по сигналу уничтожать перерожденные клетки под контролем неинвазивных методов слежения крайне привлекательна. Одним из наиболее перспективных вариантов реализации данной концепции является создание наносистем на основе магнитных наночастиц оксида железа. Благодаря наличию магнитных свойств данные наночастицы могут быть успешно выявлены методом МРТ и активированы под действием внешнего магнитного поля для реализации терапевтического воздействия. Закрепление на поверхности магнитной наночастицы векторной молекулы, позволяет получить мультифункциональную систему направленного действия. Высокий потенциал использования магнитных наночастиц обусловлен признанием их безопасности для человека. Ключевой задачей, стоящей на пути успешного внедрения подобных систем в практичеcкое здравоохранение, является достижение эффективного нацеливания и накопления наночастиц в опухоли, при условии минимального их накопления в нормальных тканях и органах. В качестве векторных молекул используют природные (олигонуклеотиды, молекулы белковой природы, углеводы) и неприродные органические молекулы. Наиболее удачным типом векторных молекул являются пептиды. Пептиды обеспечивают высокоспецифичное связывание с клетками-мишенями, проявляют низкую иммуногенность, имеют невысокую стоимость и могут быть легко получены (Shadidi and Sioud, 2003). Однако, несмотря на всевозрастающее число публикаций об успешном получении систем на основе наночастиц, нацеленных пептидами, число исследований демонстрирующих эффективное функционирование их in vivo сравнительно невелико. Данное обстоятельство обусловлено тем, что в условиях in vivo решающую роль начинают играть такие в настоящее время недостаточно изученные факторы как: характер взаимодействия наносистемы с компонентами внутренней среды организма, влияние опсонизации на кинетику наносистемы in vivo, скорость метаболизма (биодеградации) наносистемы, влияние физико-химических свойств наночастиц на биораспределение и эффективность поглощения клетками различных тканей. Достижение терапевтического эффекта наблюдаемого in vitro в условиях организма также является отдельной научной задачей. На сегодняшний день высокая актуальность создания систем для адресной доставки и востребованность результатов практической медициной обуславливает появление все новых конструкторских решений для получения систем доставки. Однако, комплексные исследования, позволяющие сравнить различные стратегии нацеливания и определить оптимальные физико-химические характеристики систем адресной доставки для достижения максимального селективного накопления в опухоли и оптимизация их функционирования in vivo не проводились. В данном проекте нами предложено получить наногибридные материалы, на основе магнитных наночастиц с размером магнитного ядра до 10, до 20 и до 30 нм, нацеленные пептидами. Данные наноситемы предназначены для выявления опухоли методом МРТ и терапии. Будет исследована эффективность использования трех основных стратегий для нацеливания наночастиц: (1) за счет взаимодействий высоко-аффинного лиганда со специфическим рецептором/белком – будет использован уреид, лиганд PSMA белка, сверхэкспрессируемого на поверхности клеток рака простаты, (2) в микроокружение опухоли – будет использован CREKA пептид, проявляющий высокую аффинность к фибрину, сверхэкспрессируемому на поверхности эндотелия сосудов питающих опухоль, (3) за счет использования специфических физиологических/биохимических условий формирующихся в опухоли – будет использован pHLIP - пептид с pH-зависимой трансмембранной активностью, способный встраиваться в мембрану клетки при снижении рН межклеточной среды ˂7.0. В рамках проекта предложено исследовать два принципиально новых подхода к терапии опухолей с использованием магнитных наночастиц. Первый подход основан на эффекте магнитной механоактивации субклеточных единиц под влиянием низкочастотного магнитного поля на наночастицы находящиеся в клетке или на ее поверхности. Второй подход основан на явлении ферроптоза, программируемой клеточной гибели опосредованной ионами железа. Индукция ферроптоза магнитными наночастицами будет исследована впервые. Исследования эффективности использования предложенных наносистем будут выполнены in vitro на линиях опухолевых клеток и in vivo на моделях опухолей животных и ксенографтах опухолей человека. Для оптимизации поведения предложенных наносистем in vivo будет выполнено исследование их биораспределения и скорости биодегарадции в организме, в том числе в зависимости от размера магнитной наночастицы и используемого векторного пептида, в режиме реал-тайм с использованием электрохимического сенсора будет изучена динамика доставки лекарственного препарата в составе наносистемы в опухоль. Эти данные позволят оценить селективность накопления наночастиц в опухоли, а также периода, в течение которого наночастицы могут быть выявлены in vivo методом МРТ и возможна реализация терапевтического воздействия на опухоль методом магнитной механоактивации. Будет исследована динамика поступления Впервые будет проведено комплексное исследование, позволяющие сравнить различные стратегии нацеливания и определить оптимальные физико-химические характеристики систем адресной доставки для достижения максимального селективного накопления в опухоли с целью ее последующего выявления и терапии.
-
Abstract:
Nowadays cancer is a leading cause of death worldwide. About 6 million of new cancer cause are diagnosed annually. The most common types of cancer treatment are surgery, chemotherapy and radiation therapy. Despite these methods are quite effective they have some side effects. This fact require turn from systemic to local treatment. A creation of miniature intelligent systems which is able to travel in a guided way inside human body to tumor, accumulate in it and crush malignant cells on a signal under non-invasive imaging control is very attractive. Usage of iron oxide magnetic nanoparticles for design of such systems is one of the most promising approach. Due to unique magnetic properties magnetic nanoparticles can be successfully visualized by MRI and activated by applying an external magnetic field to realize therapeutic effect. Anchoring of vector molecules on the nanoparticles surface allows to obtain guided multifunctional system. Magnetic nanoparticles have a great potential in field of biomedicine due to their safety for human consumption. Providing a effective targeting and concentrating of such nanosysytems in tumor without nonspecific accumulation in healthy tissues and organs is the key task have to be solved for nanosystems application in clinical use. The natural (oligonucleotides, proteins, carbohydrates) as well as synthetic molecules are applied for targeting. The most promising type of vector molecule is peptide. Peptides have high affinity to target cells, negligible immunogenicity, low cost and are easy to produce. Despite upcoming growth of number of papers devoted to synthesis of the systems based on nanoparticles targeted with peptide, there are a few researches that demonstrated their effective functioning in vivo. This circumstance has arisen because in vivo nanoparticles behavior depends on such poorly studied factors as: interaction of nanoparticles with internal components of organism, opsonization, metabolism rate, biodistribution and uptake by various kinds of tissues. To achieve therapuetic effect demonstrated in vitro on organism level additional study is required. At the present time targeted delivery systems development is now becoming ever more relevant and being in high demand in the practical medicine give rise to design numerous type of such systems. Although integrated investigation directed to comparison of different targeting strategies and determination of optimal physical-chemical properties of nanosystems has not been conducted to date. In this project we are going to obtain nanohybrid materials, based on magnetic nanoparticles with diameter up to 10, 20 and 30 nm, targeted with peptides. This nanosystems are designed for tumor MRI and therapy. The three key strategies to targeting will be studied: (1) due to high affinity of ligands-receptors/proteins interaction; we will use ureid – a ligand of PSMA protein overexpressed on prostate cancers cells, (2) targeting tumor microenvironment; we will use CREKA peptide – a tumor homing peptide, recognizes fibrin-associated plasma proteins on the walls of tumor vessels, (3) targeting specific physiological/biochemical conditions formatted in tumor; we will use pHLIP – a peptide with pH-low-insertion transmembrane activity, which are able penetrate across cell membrane when extracellular pH shift down 7.0. In the project we are going to investigate two new approaches for tumor treatment using magnetic nanoparticles. The first one is based on magneto-mechanical-activation of subcellular units of cells, contained nanoparticles inside or on the membrane, by applying low-frequency magnetic field. The second one based on a recently recognized iron-dependent form of regulated cell death - ferroptosis. The ability of magnetic nanoparticles to induce ferroptosis will be investigated for the first time. The effectiveness of synthesized nanosystem will be studied in vitro on several cancer cell line and in vivo on animal tumor and human tumor xenograft models. To optimize the designed nanosystem behavior in vivo we will study its biodistribution and rate of nanoparticles degradation, taken into account size-dependence effects and nature of targeted peptide. Original electrochemical method will be applied to real-time tracking of drag delivery dynamic using the nanosystem. Whole set of expected data allow us to evaluate the selectivity of nanoparticles tumor targeting as well as determine the time period during which in vivo MRI and magneto-mechanical-activation can be successfully applied. In the frame of project a integrated investigation will be counducted for the first time, that will allow to compare different targeting strategies and determination of optimal physical-chemical properties of targeted delivery system for selectively accumulation in tumor to improve cancer diagnosis and therapy.
-
Планируемые результаты:
В рамках проекта будут синтезированы магнитные наночастицы с заданным диаметром (до 10, до 20 и до 30 нм), проведена характеристика их физико-химических свойств и выполнена модификация поверхности для успешного закрепления на ней векторных пептидов с сохранением биологической активности последних. Будут получены нанобиогибридные материалы на основе магнитных наночастиц, нацеленные уреидом, CREKA пептидом и pH-зависимым встраивающимся пептидом. Полученные наносистемы, включающие магнитные наночастицы, нацеленные пептидами, буду исследованы комплексом высокотехнологичных методов: просвечивающей электронной микроскопии, термогравиметрии, элементного анализа, ИК-спектроскопии, так же будет рассчитана их релаксивность в водных суспензиях. Будет проведено исследование взаимодействия полученных наносистем с опухолевыми клетками in vitro: исследовано связывание пептидов в составе наногибидных материалов с клетками, в том числе определено оптимальное число молекул пептида на поверхности необходимое для достижения эффективного связывания, оценена цитотоксичность, изучена способность индуцировать ферроптоз, отработаны режимы амплитудно-частотных и пространственно-временных параметров активирующего магнитного поля для эффективной механоактивации наночастиц. Будет изучено поведение синтезированных наносистем in vivo с целью достижения селективного накопления в опухолях, в том числе выбран оптимальный размер наночастицы, определены биораспределение наносистем и скорость биодеградации в организме. Будут оптимизированы последовательности МРТ для эффективного выявления опухолей с использованием полученных наносистем. С применением уникального подхода, позволяющего детектировать электрохимический сигнал в живых тканях в режиме реал-тайм детектирования, будет исследована динамика адресной доставки лекарства в опухоль с использованием нацеленных пептидом магнитных наночастиц. Впервые будет исследована способность наночастиц оксида железа, нацеленных пептидами, индуцировать ферроптоз опухолевых клеток. Будут оптимизированы условия экспозиции в магнитном поле для использования полученных наносистем для разрушения клеток опухоли методом магнитной механоактивации. Исследование и сравнение эффективности накопления и функционирования полученных наносистем в опухоли будут выполнены на экспериментальных опухолях животных и человека (ксенографтах), в том числе рака груди, простаты и глиобластомы. Полученные результаты будут обладать высокой научной значимостью т.к. впервые будет проведено сравнительное исследование различных стратегий нацеливания, определены оптимальные физико-химические характеристики систем адресной доставки, позволяющие достичь селективного накопления в опухоли. Результаты, полученные в ходе реализации проекта, будут соответствовать мировому уровню исследований и внесут значительный вклад в развитие биомедицинской нанотехнологии. В результате реализации проекта будут предложены оригинальные гибридные наноматериалы, на основе магнитных наночастиц, нацеленные пептидами, которые будут обеспечивать эффективное выявление опухоли и ее деструкцию. Масштаб планируемых исследований позволит предложить принципиально новые системы для диагностики и терапии злокачественных опухолей, способные принципиально повысить качество оказания медицинских услуг. Важно подчеркнуть, что запланированные к получению результаты высоко востребованы в практической медицине. Потенциальными потребителями разрабатываемых наносистем могут стать научно-клинические учреждения здравоохранения, специализированные лечебно-профилактические учреждения, в частности медицинские учреждения онкологического профиля, диагностические центры.
- Добавил в систему: Мажуга Александр Георгиевич
Источник финансирования НИР
| грант РНФ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 31 мая 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Адресные наногибридные материалы для терапии и диагностики онкологических патологий |
| Результаты этапа: На первом этапе выполнения работ были синтезированы наночастицы оксида железа со средним диаметром до 10, 20 Проект № 17-14-01316/2017 Страница 2 из 24 и 30 нм методом термического разложения из ацетилацетоната железа. Для получения наночастиц со средним диаметром меньше 10 нм методом термического разложения прекурсора в высококипящем органическом растворителе взвесили 3 ммоль ацетилацетоната железа (III) и ввели в трехгорлую колбу в атмосфере аргона, содержащую 20 мл диоктилового эфира и 3 ммоль олеиновой кислоты (0,96 мл) при 100 оС. Полученный раствор медленно нагрели со скоростью 3 оC/мин до кипения и кипятили с обратным холодильником в течение 2 часов. После охлаждения смесь смешали с 100 мл ацетона и выпавшие наночастицы собрали магнитной декантацией. Собранный осадок редиспергировали в хлороформе. Для получения наночастиц со средним диаметром от 10 до 20 нм методом термического разложения прекурсора в высококипящем органическом растворителе взвесили 2,2 ммоль синтезированного ацетилацетоната железа (III) и 12 ммоль олеиновой кислоты и растворили в 10 мл 1-октадецена в трехгорлой круглодонной колбе на 100 мл. Затем систему нагрели до 320 оC в атмосфере аргона и интенсивного перемешивания со скоростью нагрева 3,3 оC/мин с обратным холодильником и термометром. После этого систему выдержали при температуре 60 минут с последующим охлаждением до температуры окружающей среды. Смесь поставили на магнитную декантацию с изопропанолом для отделения наночастиц магнетита с неодимовым магнитом. После слива декантата осадок трижды промыли изопропанолом. Наконец осадок повторно диспергировали при обработке ультразвуком. Для получения наночастиц со средним диаметром до 30 нм методом термического разложения прекурсора в высококипящем органическом растворителе применили двухстадийный синтез. На первой стадии взвесили 2,2 ммоль ацетилацетоната железа (III) и 12 ммоль олеиновой кислоты и растворили в 10 мл 1-октадецена в трехгорлой круглодонной колбе на 100 мл. Затем систему нагрели до 320 оC в атмосфере аргона и интенсивного перемешивания со скоростью нагрева 3,3 оC/мин с обратным холодильником и термометром. После этого систему выдержали при температуре 60 минут с последующим охлаждением до температуры окружающей среды. Смесь поставили на магнитную декантацию с изопропанолом для отделения наночастиц магнетита с неодимовым магнитом. После слива декантата осадок трижды промыли изопропанолом. Осадок повторно диспергировали при обработке ультразвуком в октадецене. На второй стадии 70 мг наночастиц оксида железа в 5 мл октадецена, полученных на первой стадии ввели в трехгорлую колбу на 100 мл. Затем туда же ввели 0,32 г олеиновой кислоты. Полученную смесь поставили нагреваться до 320 оС со скоростью 4 оС/мин в атмосфере аргона при интенсивном перемешивании. 1,2 г ацетилацетоната железа (III) растворили в 6 мл октадецена, полученный раствор набрали в шприц и с помощью инфузионного насоса ввели в кипящий раствор наночастиц оксида железа со скоростью 1 мл в час. После этого систему выдержали при температуре 60 минут с последующим охлаждением до температуры окружающей среды. Смесь поставили на магнитную декантацию с изопропанолом для отделения наночастиц магнетита с неодимовым магнитом. После слива декантата осадок трижды промыли изопропанолом. Наконец осадок повторно диспергировали при обработке ультразвуком. Модификацию поверхности синтезированных магнитных наночастиц с использованием 3- аминопропилтриэтоксисилана проводили по следующему протоколу: Для наночастиц оксида железа меньше 10 нм брали 11 мл раствора наночастиц с концентрацией 10 мг/мл перемешали с 22 мл раствора бромид цетилтриметиламмония (ЦТМА) и интенсивно озвучили на ультразвуковом щупе до образования однородной эмульсии. Затем хлороформ упарили на ультразвуковой бане при 55 оС. Полученный раствор наночастиц разбавили 400 мл воды. Затем туда добавили 2,5 мл 2 М раствора NaOH и систему нагрели до 70 оС. После чего туда быстро ввели 2,5 мл тетраэтоксисиликата и 22,5 мл этилацетата при интенсивном перемешивании. Через 10 минут добавили 1 мл 3-аминопропилтриэтоксисилан и система перемешивалась еще в течение 3 часов. Модифицированные наночастицы сконцентрировали центрифугированием в режиме 6000 rpm в течение 90 мин с 0,25 мг/мл по магнетиту до 9,2 мг/мл. Для модифицирования наночастиц оксида железа с диаметром от 10 до 20 нм взяли 11 мл раствора наночастиц с концентрацией 10 мг/мл перемешали с 22 мл раствора ЦТМА и интенсивно озвучили на ультразвуковом щупе до образования однородной эмульсии. Затем хлороформ упарили на УЗ бане при 55 оС. Полученный раствор наночастиц разбавили 400 мл воды. Затем туда ввели 2,5 мл 2 М раствора NaOH и систему нагрели до 70 оС. После чего туда быстро ввели 2 мл тетраэтоксисиликата и 45 мл этилацетата при интенсивном перемешивании. Еще через 10 минут также добавили 1 мл 3-аминопропилтриэтоксисилан, после чего система перемешивалась еще в течение 3 часов. После синтеза наночастицы сконцентрировали центрифугированием в режиме 6000 rpm в течение 90 мин с 0,25 мг/мл по магнетиту до 9,2 мг/мл. Для модифицирования наночастиц оксида железа с диаметром до 30 нм 11 мл раствора наночастиц с концентрацией 10 мг/мл перемешали с 22 мл раствора ЦТМА и интенсивно озвучили на ультразвуковом щупе до образования однородной эмульсии. Затем хлороформ упарили на уз бане при 55 оС. Полученный раствор наночастиц разбавили 400 мл воды. Затем туда ввели 2,5 мл 2М раствора NaOH и систему нагрели до 70 оС. После чего туда ввели быстро 2 мл тетраэтоксисиликата и 45 мл этилацетата при интенсивном перемешивании. Еще через 10 минут также добавили 1 мл 3- Проект № 17-14-01316/2017 Страница 3 из 24 аминопропилтриэтоксисилан, после чего система перемешивалась еще в течение 3 часов. После синтеза наночастицы сконцентрировали центрифугированием в режиме 6000 rpm в течение 90 мин с 0,25 мг/мл по магнетиту до 9,2 мг/мл. Для определения формы и размеров полученных наночастиц оксидов железа использовали метод просвечивающей электронной микроскопии, в том числе высокоразрешающей, на микроскопе JEM – 2100 фирмы JEOL. Исследовали порошки методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) в режиме «светлого» поля с ускоряющим напряжением 200 кВ. Для исследования образцов методом просвечивающей электронной микроскопии были приготовлены коллоидные растворы наночастиц в воде. Для избавления от конгломератов взвесь подвергали ультразвуковой обработке в течение 15 минут при комнатной температуре, далее полученный раствор отстаивали в течение 5 минут для осаждения крупных частиц. С помощью пипетки 1 мкл раствора частиц наносили на углеродную пленку на медной сеточке диаметром 3,05 мм, которая далее сушили на воздухе. Поскольку пленки на медных сетках аморфные, то брегговские отражения от них могут быть исключены, а при малых толщинах они считаются прозрачными для электронов, благодаря чему возможно точное исследование структуры и морфологии наночастиц. Фазовый анализ исследуемых материалов для определения параметров кристаллической структуры был проведен на дифрактометре ДРОН-4 (CoKα излучение с λ = 0,179 нм, u = 40 кВ, I = 30 мА, трубка работала в стандартном режиме), в процессе съемки использовали: 1 мм – приёмная щель на окружности гониометра и 1 мм – приемная щель счётчика; графитовый монохроматор; значение дифракционных углов 2θ менялись от 20° до 120° с шагом съемки 0,1°; экспозиция на точку съёмки – 3 с. Для анализа использовали специальные кюветы, в которые насыпали порошок и уплотняли его с добавлением спирта, что позволяло избегать появления лишних линий (от связующего вещества) и снизить уровень фона. Такие приспособления увеличивают чувствительность и точность анализа, что позволяет получать четкие дифракционные картины. Определение распределения частиц по размерам и измерения ζ-потенциала проводили на приборе Malvern Zetasizer Nano ZS (угол 173°) с применением He-Ne лазера. Для измерения размеров частиц в растворе, жидкий образец вводили в стандартной прозрачной кювете, которая подвергалась лазерному излучению с длиной волны 633 нм. Рассеяние частицами света отслеживается с помощью детектора. Скорость частиц и их размер рассчитывается на основе анализа флуктуации интенсивности рассеянного света. Для каждого образца проводится не менее 3-х экспериментов с 10-15 измерениями в каждом. Дзета-потенциал использовали для оценки стабильности суспензий: флокуляция и осаждение будет происходить в том случае, если электрическое отталкивание между частицами не превышает Ван-дер-Ваальсовы силы. Частицы с дзета-потенциалом большими, чем 30 мВ или меньшими, чем минус 30 мВ считаются стабильными. Мёссбауэровские исследования на ядрах 57Fe проводили при комнатной температуре на спектрометре MS-1104Em в геометрии пропускания, источник излучения – 57Co в матрице Rh. Путём обработки мёссбауэровских спектров по программе Univem MS определяли значения эффективных магнитных полей Hэфф на ядрах Fe57, изомерные сдвиги сигма-s и квадрупольные расщепления Δ элементарных спектров, а также относительную интенсивность (площадь) последних. Погрешность измерения величины Heff составляла ±5 кЭ (0,4 МА/м); сигма-s – 0,01-0,02 мм/с;сигма-s – ±0,01 мм/с, площади компонент – ±0,6 %. Для измерения отношения концентраций железа к кремнию проводили элементный анализ методом атомно- эмиссионной спектроскопии (АЭС) на атомно-эмиссионном спектрометре 4200 MP–AES. Данный метод основан на возбуждении атомарной эмиссии нагревом в плазме с последующим детектированием интенсивности излучения, позволяющим количественно измерить содержание элементного железа и кремния в аналите. Предварительно для измерения концентрации приготовили 2 серии из 5 стандартов путем разбавления стандарта по железу для ICP с концентрацией 1000 мг/л железа (III) и в 5% азотной кислоте и по кремнию с концентрацией 998 мг/мл в 0,1 М плавиковой кислоте. Оба стандарта разбавили деионизованной водой до 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 мг/л по железу (III) и кремнию каждый. Объем каждого стандарта составил не менее 10 мл. После построения калибровочной кривой выполнили измерения концентраций в растворах, полученных растворением образцов в концентрированной соляной кислоте. Магнитные измерения проводили с помощью установки для измерения физических свойств “Quantum Design” Physical Property Measurement System (PPMS) (магнитное поле – до 7100 кА/м (90 кЭ), температура – от минус 271 до 76 °C), оборудованной вибромагнетометрической вставкой (VSM) (диапазон температур: 5,5 1273 °C, напряженность магнитного поля: до 1830 кА/м (23 кЭ), частота вибраций – 82 Гц, амплитуда вибраций – 1,5 мм, относительная погрешность измерений – не более 1 %). Исследуемый образец в виде порошка после предварительного взвешивания засыпали в полипропиленовую кювету, которую помещали в латунный держатель образца на 35 мм от конца держателя. После присоединения к длинному карбоновому вибрационному стержню, держатель опускали в камеру для образца, другой конец этого стержня находился при комнатной температуре. Далее задавали необходимые параметры исследования и запускали измерения. Мотор, который находится вне криостата, создавал вертикальные колебания стержня с образцом (амплитуда таких колебаний составляла 2 мм, а частота – 40 Гц). Образец на платформе должен Проект № 17-14-01316/2017 Страница 4 из 24 быть ближе к середине измерительной катушки. При колебаниях в измерительной катушке задается переменное напряжение пропорциональное магнитному моменту образца (с такой же частотой), которое измерялось синхронным детектором. Температуру образца определял поток паров гелия. Температура контролировалась несколькими термопарами, которые размещены на дне и наверху измерительной катушки. Магнитное поле, создаваемое соленоидом, определялось по силе тока источника. Удельную намагниченность модифицированных наночастиц измеряли при комнатной температуре с помощью вибрационного магнитометра в магнитном поле 2,2 МА/м. ИК-спектры записывали на инфракрасном Фурье-спектрометре Nicolet 6700 (Thermo Electron Corporation) с приставкой НПВО Smart Orbit with Diamond crystal, область сканирования спектров НПВО 400-4000 см-1, число сканирование 64- 192. Термогравиметрический анализ (ТГА) исследуемых образцов проводили на синхронном термоанализаторе Netzsch STA 449 F3. STA 449 F3 Jupiter и TGA/DSC1 термогравиметрическом анализаторе (Mettler Toledo). В ходе работы основным требованием к проводимым измерениям было точное определение массы. Точность определения массы составляла 0,001 мг при любой исследуемой температуре. Образцы нагревались в алундовых тиглях в токе аргона от 50 до 800 °С со скоростью нагрева 10 °С/мин. Получаемый при измерении исходный сигнал – зависимость дифференциальной термо-ЭДС (в мкВ) от температуры (в ºС). Сигнал может быть преобразован в зависимость удельного теплового потока (в мВт/мг) от температуры (в ºС) при учёте калибровки по чувствительности и массы исследуемого образца. Для анализа результатов полученные зависимости строили в координатах тепловой поток (мВт/мг) – температура (ºС). Элементный анализ проводили на автоматическом анализаторе CHN РЕ 2400, II (PerkinElmer Inc.). Содержание ЦТМА в исходных наночастицах рассчитывали по разности масс. % углерода, определённых для наночастиц после обработки HCl и перед обработкой, при этом предполагалось, что ЦТМА удаляется в процессе обработки полностью. Содержание пептидов (после соответствующей модификации) рассчитывали аналогичным образом вычитая из масс. % углерода в продуктах реакции масс. % углерода по аналогии с (Demin A.M. et al., 2016). Для получения уреида (Рисунок 1) гидрохлорид дитретбутилового эфира L-глутаминовой кислоты (1,0 г, 3,38 ммоль) и триэтиламин (1,54, 11,09 ммоль)) растворяли в CH2Cl2 (30 мл), полученный раствор охлаждали до -78°С. К полученному раствору добавляли по каплям раствор трифосгена (341 мг, 1,15 ммоль) в 10 мл CH2Cl2. После добавления раствора трифосгена температура реакции была постепенно доведена до комнатной температуры, после этого раствор перемешивался ещё в течение 30 мин. Далее в реакционную смесь вносили раствор H-Lys(Z)-Ot-Bu (757 мг, 2,03 ммоль) и триэтиламина (283 мкл, 2,03 ммоль) в дихлорметане. Полученную реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре. После этого реакционную смесь разбавили 50 мл CH2Cl2, и промыли водой (2×100 мл). Объединенные органические фракции высушили над сульфатом натрия. Растворитель был удален при пониженном давлении. Дальнейшую очистку полученной фракции проводили методом колоночной хроматографии (1,5:1 гексан: этилацетат). Продукт был выделен в виде бесцветного маслянистого вещества (1 г., 79 %). Бензоксикарбонильную защиту сняли в токе водорода на палладиевом катализаторе. Третбутильную защиту сняли в 10% трифторуксусной кислоте в дихлорметане. Характеристика уреида выполнена методом спектроскопии ядерно-магнитного резонанса (ЯМР). Спектры ЯМР 1 Н регистрировали на приборе Bruker Avance с рабочей частотой 400 МГц. В качестве растворителя использовали диметилсульфоксид-d 6. Химические сдвиги приведены в миллионных долях по шкале δ относительно гексаметилдисилоксана как внутреннего стандарта. Полученный ПСМА-специфичный лиганд охарактеризовали с помощью масс-спектрометрии. Работа проводилась на хроматомасс-спектрометре LCMS 8030. (Shimadzu, Япония), оснащенном электроспреем, в качестве источника ионизации, и тремя квадруполями. Для конъюгации лиганда ПСМА с поверхностью наночастиц оксида железа 2 ммоль α,ω-бис{2-[(3-карбокси-1- оксипропил)амино]этил}пропиленгликоля с М=6000 растворили в 50 мл обезвоженного ДМФА, после чего туда добавили 1,2 ммоль дициклогексилкарбодиимида и 1,1 ммоль N-гидроксисукцинимида. Раствор перемешивали в течение одного часа при комнатной температуре, после чего в раствор вводили 1 ммоль уреида ПСМА. Через 12 часов после интенсивного перемешивания раствор разбавили равным объемом воды и поставили на диализ против воды в диализный мешок с размером пор 2 кДа. Воду заменили 2 раза через 12 и 36 часов после начала диализа. Через 2-е суток после диализа диализат собрали и упарили на роторном испарителе под вакуумом до получения сухого остатка. 10 мг наночастиц оксида железа с амино-группами на поверхности редиспергировали в 2 мл натрий-фосфатного буфера, после чего туда же вводили 8 мкмоль конъюгата α,ω-бис{2-[(3-карбокси-1- оксипропил)амино]этил}пропиленгликоля с ПСМА-лигандом в 1 мл воды. Далее в полученный раствор ввели 20 мкмоль гидрохлорида N-(3-диметиламинопропил)-N’-этилкарбодиимида и 10 мкмоль N-гидроксисукцинимида. Раствор перемешивали на шейкере в течение 12 часов, после чего поставили на диализ против деионизованной воды в диализном мешке с размером пор 12-14 кДа. Воду заменили 2 раза через 12 и 36 часов после начала диализа. После Проект № 17-14-01316/2017 Страница 5 из 24 диализа раствор собрали и хранили в темном прохладном месте. Для конъюгации пептида CREKA с магнитными наночастицами использован аналогичный подход. Учитывая, что синтезированные наночастицы были стабилизированы ЦТМА, который может оказывать токсическое действие из-за способности вызывать денатурацию белков, что не позволяет использовать его в медицинской практике, проводили удаление данного стабилизатора по методике, описанной в (Kim J. et al., 2008). Для этого к коллоидным растворам магнитных наночастиц в воде (с концентрациями 2 мг/мл) добавили 1 N раствор HCl до рН 1,4. Полученные коллоидные растворы магнитных наночастиц на основе Fe3O4, синтезированных методом термического разложения из ацетилацетоната железа, покрытых SiO2 и модифицированных 3-аминопропилсиланом с диаметром до 10 нм и диаметром от 10 до 20 нм выдержали 3 ч при температуре 60 °С, при перемешивании на верхнеприводной мешалке. После чего наночастицы осадили при 19000 rpm в течение 15 мин. После проведения декантации наночастицы промыли водой (2 раза) и ацетонитрилом (1 раз). Для прививки на поверхность магнитных наночатиц пептида pHLIP использовали кросс-линкера эфир N-ε- малеимидокапроилоксисукцинимид (EMCS) (Рисунок 2). Полученные магнитные наночастицы после удаления ЦТМА диспергировали в ацетонитриле (3 мг/мл) для проведения дальнейшей реакции с EMCS. Для введения линкера EMCS добавили к суспензии магнитных наночастиц при перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки и инкубировали в течение 4 ч, мольное соотношение наноастицы:EMCS составило 7:1 (в расчёте на Fe3O4). После проведения реакции функционализированные наночастицы осадили внешним магнитом, промыли от не прореагировавшего реагента и побочных продуктов реакции ацетонитрилом (3 раза) и диспергировали в PBS до конечной концентрации 2 мг/мл. Для конъюгации с pHLIP через суспензию наночастиц барботировали Ar для удаления O2 и предотвращения образования димерных продуктов pHLIP-pHLIP в результате образования дисульфидных производных. После этого к суспензиям магнитных наночастиц добавили pHLIP в PBS в мольном соотношении EMCS:pHLIP 40:1 (в расчёте на ранее добавленное количество EMCS) при перемешивании на верхнеприводной мешалке в течение суток. Модифицированные pHLIP магнитные наночастицы осадили при использовании внешнего магнитного поля, промыли PBS (2 раза) и диспергировали в PBS для дальнейшего использования в in vitro экспериментах. Для получения карбоксилированного плюроника F127, 25 г плюроника, 0,3 г янтарного ангидрида, 0,5 г 4- диметиламинопирида и 0,5 мл триэтиламина растворили в 30 мл безводного 1,4-диоксана и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Затем систему разбавили равным объемом воды и поставили систему на диализ. Первый раз воду сменили через 12 часов, второй раз – через сутки. После диализа раствор упарили на роторном испарителе до постоянной массы. Раствор наночастиц оксида железа в хлороформе с исходной концентрацией 20 мг/мл разбавили толуолом до концентрации 2 мг/мл. 1,26 г карбоксилированного плюроника растворили в 50 мл воды при обработке ультразвуком в ультразвуковой бане. 2 мл раствора наночастиц оксида железа смешали с равным объемом раствора карбоксилированного плюроника и обработали ультразвуком до образования гомогенной эмульсии. Далее эмульсию разделили центрифугированием в режиме 12500 rpm в течение 10 минут, после чего органическую фазу слили и добавили воду. Полученную систему гомогенизировали ультразвуком и выделили осадок наночастиц, покрытых карбоксилированным плюроником путем центрифугирования в режиме 12500 rpm в течение 60 минут. Осадок редиспергировали в изотоническом натрий-фосфатном буфере с (pH 7.4). В 2 мл раствора наночастиц в буфере с концентрацией 0,32 мг/мл по оксиду железа добавляли 40 мкл раствора гидрохлорида доксорубицина с концентрацией 5 мг/мл, перемешивали и оставляли на ночь. На следующий день наночастицы выделяли центрифугированием в режиме 12500 rpm в течение 60 мин. Полученный осадок редиспергировали в изотоническом натрий-фосфатном буфере (pH 7.4). Уровень загрузки доксорубицина оценивали фотометрически. Предварительно строили калибровочную кривую по раствору гидрохлорида доксорубицина известной концентрации (1, 5, 10, 25, 50, 100 мкг/мл). В планшет на 50 лунок добавляли по 300 мкл калибровочных растворов в двух повторностях и по полученным данным строили калибровочный график. Аналогично в 2-х повторностях по 300 мкл измеряли концентрацию доксорубицина в аналите при длине волны 495 нм. По разнице концентраций доксорубицина в исходном растворе и супернатанте после загрузки определяли уровень загрузки. Т2 релаксивность определяли с помощью магнитно-резонансного томографа ClinScan с мощностью поля 7Т. Были получены МР-снимки пробирок, содержащих раствор образца, с известной концентрацией Fe3+ в режиме Spin Echo с параметрами TR=10000 мс, TE = 8, 16, 24, … , 240 мс. Далее оценивали интенсивность сигнала в каждой пробирке и вычисляли время Т2 по формуле: S_i=S_0 e^((-TE/T2)) (1) где S0 – сигнал в начальный момент времени, Si – сигнал в момент времени TE. T2 релаксивность при этом определялась как тангенс угла наклона линейной зависимости времени T2 от концентрации частиц. Проект № 17-14-01316/2017 Страница 6 из 24 Для разработки протокола исследования ферроптоза in vitro за основу брали метод, описанный в статье (Dixon S.J. et al., 2012). Для приготовления «обедненной» среды DMEM F12 температурно-инактивированную сыворотку диализовали (3500 MWCO) против натрий-фосфатного буфера (PBS, рН 7.4) при 4 оС со сменой буфера дважды через 4 и 16 часов, и фильтровали через 0.22 фильтр и вносили до концентрации 10% в DMEM F12 без добавления L-глутамина. Использовали клеточные линии MDA-MB231, PC-3, U87, 4T1 и режимы культивирования клеток: в 24-луночных плашках 105 клеток, в 96 луночных плашках 1х104 и 2 х104 клеток. Культивирование до внесения индукторов/ингибиторов ферроптоза проводили в «полной» среде DMEM F12 (с добавлением 10% FBS) и в «обедненной» среде DMEM F12. Для индукции ферроптоза использовали эрастин в конечной концентрации 10 мкМ. Для ингибирования ферроптоза использовали: 100 мкМ дефероксамин мезилат (DFO), 1 мМ ацетилцистеин (N-Acetyl-L-cysteine, NAC), 5 мМ глутатион (LGlutathione reduced, GSH). Оценку жизнеспособности проводили, используя МТТ-тест, окрашивание с трипановым синим методом микроскопии в камере Горяева, методом проточной цитометрии с 7-AAD. Количество клеток считали в камере Горяева и методом проточной цитометрии. Все планируемые на год работы выполнены полностью: да 1.4. Сведения о достигнутых конкретных научных результатах в отчетном году (до 5 стр.) Методом термического разложения из ацетилацетоната железа были получены и охарактеризованы наночастицы оксида железа с диаметром до 10 нм, от 10 до 20 нм и до 30 нм. По данным ПЭМ средний размер синтезированных наночастиц составил 9-10 нм, 18 нм и 28 нм соответственно (Рисунок 3). По результатам измерения методом динамического светорассеяния в хлороформе средний гидродинамический диаметр синтезированных наночастиц составлял около 12 нм, 20 нм и 110 нм соответственно (Рисунок 4). Методика химического модифицирования изначально гидрофобных наночастиц оксида железа, стабилизированных олеиновой кислотой, включает в себя промежуточную стадию перевода наночастиц в воду путем упаривания более легколетучего растворителя хлороформа и стабилизацией наночастиц ЦТМА – катионным ионогенным ПАВ. На поверхности изначально гидрофобных наночастиц адсорбируются положительно заряженные молекулы ЦТМА и придают им выраженный положительный заряд, что приводит к их стабилизации в водной среде. Наночастицы оксида железа размером до 30 нм не продемонстрировали агрегативную стабильность и после редиспергирования в хлороформе их гидродинамический размер составлял больше 100 нм (Рисунок 4С). Это может быть связано с большим значением магнитного момента наночастиц, вызывающим их агрегацию. По этой причине данный образец подвергать в дальнейшем химической модификации представлялось не целесообразным. По данным рентгеноструктурного анализа было выявлено, что образцы синтезированных наночастиц по структуре представляет собой обратную шпинель со средним размером кристаллитов 5 нм и 16 нм, соответственно (Таблица 1). Среди оксидов железа структура обратной шпинели наблюдается у маггемита (Fe2O3) и магнетита (Fe3O4). На основании данных термогравиметрического анализа (ТГА) наночастиц оксида железа было выявлено, что массовое содержание оксида железа у образца меньше 10 нм составило 64,84% , в то время как для образца от 10 до 20 нм – 73,37% (Рисунок 5). Для определения валентного состояния железа, полученные образцы наночастиц были исследованы методом мёссбауэровской спектроскопии. Образец наночастиц до 10 нм представляет собой преимущественно суперпарамагнитную фазу (Рисунок 6-А), в то время как наночастицы от 10 до 20 нм оказались преимущественно ферримагнитными (Рисунок 6-Б). Образец является нестехиометрическим магнетитом по фазовому составу. На последующей стадии покрытия 3-аминопропилсиланом, силаны гидролизуются с образованием кремниевых кислот, имеющих отрицательный заряд, адсорбируются на поверхности наночастиц оксида железа с образованием силоксановой оболочки, на поверхности которой в свою очередь присутствуют амино-группы. Можно наблюдать, что наночастицы по данным ПЭМ после химического модифицирования покрыты оболочкой (Рисунок 7). По данным исследования методом динамического светорассеяния средний размер наночастиц после покрытия составил около 50 нм и 40 нм, соответственно, для исходных наночастиц размером до 10 и от 10 до 20 нм (Рисунок 8). Дзета-потенциал наночастиц оксида железа после химического модифицирования составил +33 мВ, для наночастиц с диаметром магнитного ядра до 10 нм, и +30 мВ, для наночастиц с диаметром магнитного ядра от 10 до 20 нм. Данные ИК спектроскопии подтверждают наличие в наночастицах ядра на основе оксида железа (полоса в области 570 см-1) и оболочки на основе оксида кремния (широкая полоса в области 1050 см-1) (Рисунок 9). Исходные наночастицы содержали в качестве стабилизатора ЦТМА, наличие которого можно наблюдать на спектрах НПВО магнитных Проект № 17-14-01316/2017 Страница 7 из 24 наночастиц по наличию валентных колебаний С-Н связей (СН2) в области 2852 и 2921 см-1, а также N-С при 1412 см-1. О наличии NH2 и NH2+ групп можно судить по присутствию полос поглощения в области 1630 и 1530 см-1 соответственно (деформационные колебания N-H). Получены наногибридные материалы на основе наночастиц оксида железа со средним диаметром до 10 и от 10 до 20 нм и лиганада PSMA уреида, CREKA и pHLIP пептида. На рисунке 10 представлена структура лиганда к PSMA - уреида, содержащего остатки лизина и глутаминовой кислоты. Уреид был получен в три последовательные стадии: синтез изоцианата из ди-трет-бутилового эфира глутаминовой кислоты, его реакция с Z-защищенным лизином, снятие Z защиты и гидролиз сложноэфирной группировки. При этом в молекулу вектора ввели первичный амин, выступающий в роли спейсера для последующей прививки на модифицированную поверхность наночастиц. По данным спектра протонного магнитного резонанса (400 МГц, DMSO d6, δ, м.д.): 12.54 (уш.с, 3Н, СООН), 7.67 (уш.с., 3H, NH3+), 6.46-6.24 (м, 2Н, C(O)NH(urea)), 4.17-3.99 (м, 2H, CH), 2.82-2.67 (м, 2Н, СН2), 2.30-2.15 (м, 2H, CH2), 1.97-1.84 (м, 1H, CH2),1.77-1.60 (м, 2Н, СН2) 1.58-1.42 (м, 3H, CH2), 1.37 -1.26 (м, 2H, СН2)1.11-1.03 (м, 1H, CH2) - был получен целевой лиганд (Рисунок 11). По данным масс-спектрометрии в спектре наблюдается ион с отношением массы к заряду равным 320 а.е.м., что соответствует массе целевого ПСМА-специфичного лиганда (Рисунок 12). Методом карбодиимидной актвиации лиганд ПСМА ковалентно привит на поверхность наночастиц за счет конъюгации введённой в его структуру NH2 группы и СООН групп ω-бис{2-[(3-карбокси-1- оксипропил)амино]этил}пропиленгликоля, присутствующих на поверхности наночастицы в результате модификации. Для получения нанобиогибридного материала на основе синтезированных наночастиц оксида железа и CREKA-пептида использован аналогичный подход с формированием связи между N-концевой аминогруппой пептида и СООН группой на поверхности модифицированных ω-бис{2-[(3-карбокси-1-оксипропил)амино]этил}пропиленгликолем наночастиц. Связывание пептида pHLIP c поверхностью наночастиц оксида железа выполнено с использованием малеимидного кросс-линкера EMCS, обеспечивающего формирование ковалентной связи между SH-группой L-цистеина в составе молекулы пептида и NH2 групп на силанизированной поверхности наночастиц. В результате модификации EMCS и затем pHLIP в спектрах ИК можно наблюдать небольшое смещение и изменение формы и интенсивности полос поглощения: 2937 см-1 (валентные колебания С-Н), 1637 см-1 (Амид I) и 1534 см-1 (Амид II), что подтверждает иммобилизацию пептида на магнитных наночастицах (Рисунок 13). При этом полосы, характерные для ЦТМА в целевых продуктах отсутствуют, что может свидетельствовать об успешном удалении данного реагента с поверхности наночастиц. По данным элементного анализа на атомно-эмиссионном спектрометре концентрация по оксиду железа в золе после центрифугирования для наночастиц с диаметром до 10 нм составила 8,7 мг/мл, в то время как концентрация по оксиду кремния оказалась равна 15,3 мг/мл. Массовое содержание оксида железа в образце составило 36,25%. По данным элементного анализа на атомно-эмиссионном спектрометре концентрация по оксиду железа в золе после центрифугирования наночастиц с размером ядра от 10 до 20 нм составила 10,6 мг/мл, в то время как концентрация по оксиду кремния оказалась равна 5,6 мг/мл. Массовое содержание оксида железа в образце составило 65,43%. Такая разница в массовом содержании оксида железа связана с более развитой удельной поверхностью наночастиц размером меньше 10 нм и, соответственно, более активной адсорбцией кремниевых кислот на стадии химического модифицирования. Согласно данным CHN-анализа (по масс. % углерода) рассчитано количество органических молекул на поверхности магнитных наночастиц. Так, для исходных наночастиц оксида железа со средним диаметром до 10 и от 10 до 20 нм получены значения 0,155 и 0,096 ммоль ЦТМА в расчёте на г наночастиц соответственно. А содержание аминопропилсилана – 1,52 и 1,26 ммоль/г для наночастиц оксида железа со со средним диаметром до 10 и от 10 до 20 нм соответственно. На основании совокупности полученных данных, можно заключить, что поверхностная модификация чуть более эффективно протекает для магнитных наночастиц с размером магнитного ядра до 10 нм. Так, наночастицы оксида железа со средним диаметром до 10 модифицированные пептидом pHLIP содержали 4,62 мкмоль, а наночастицы со средним диаметром от 10 до 20 нм – 3,99 мкмоль пептида в расчёте на 1 г частиц. На рисунке 15 приведены данные ТГА анализа нанобиогибридного материала на основе магнитных наночастиц модифицированных пептидом pHLIP. На первом этапе происходит удаление физически адсорбированной воды до 160 °С. Удаление органического покрытия происходит на 2 стадии. На первой стадии (до 600 °С) происходит термодеструкция молекул аминопропилсилана, EMCS и pHLIP за счёт процессов декарбоксилирования и дезаминирования с выделение СО2, Н2О и NH3, что, видимо, приводит к образованию карбонизированного остатка. На следующей стадии (вплоть до 800 °С) происходит постепенное доокисление карбонизированного остатка за счёт примеси кислорода в аргоне или Fe3O4-ядра магнитных наночастиц с выделением СО2. Таким образом, наноматериал Проект № 17-14-01316/2017 Страница 8 из 24 на основе наночастиц с размером до 10 нм (МНЧ-1-pHLIP) содержал не менее 9,59 масс. % органического покрытия (суммарное количество молекул APS, EMCS и pHLIP), а на основе наночастиц размером от 10 до 20 нм (МНЧ-2-pHLIP) – не менее 5,57 масс. %. При этом на долю пептида в МНЧ-1-pHLIP приходится до 1,9 масс. % (по данным элементного анализа), а в МНЧ-2-pHLIP – до 1,6 масс. %. Отметим, что по данным дифференциального термического анализа (ДТА) выраженных энергетических эффектов при термодеструкции органического покрытия не наблюдается (Рисунок 14). После модификации наночастиц уреидом удельный прирост массы лиганда составил около 0,1 масс. %. Перемена массы практически не детектируется после модифицирования уреидом, что связано с малой молекулярной массой лиганда относительно наночастиц. Измерение МРТ-контрастных свойств синтезированных наночастиц оксида железа показало, что для образца с размером ядра меньше 10 нм скорость поперечной спин-спиновой релаксации равна R2 =149,74 (ммоль/с)-1, тогда как для образца с размером ядра от 10 до 20 нм скорость поперечной спин-спиновой релаксации составила R2 =240,64 (ммоль/с)-1 (Рисунок 15). На рисунке 16 представлены кривые удельной намагниченности (М) модифицированных 3-аминопропилсиланом наночастиц и, для примера, кривые для наночастиц с диаметром до 10 нм после обработки HCl и после модифицирования пептидом. Наблюдаемые отличия в намагниченности двух типов исследуемых частиц обусловлены разным диаметра магнитных ядер (до 10 и от 10 до 20 нм) и разной толщины немагнитного покрытия SiO2 на них, М составила 17 и 32 ему/г соответственно. Значительный наклон высокополевой части кривой намагничивания наночастиц с размером от 10 до 20 нм возможно обусловлен наличием малых частиц магнетита, размером порядка 2 нм. Важно, отметить, что максимальные значения М для модифицированных наночастиц до и после конъюгации с пептидом составили 18 и 17 ему/г и отличались между собой в пределах ошибки. Отработана методика загрузки противоопухолевых препаратов магнитных наночастиц на основе Fe3O4, синтезированных методом термического разложения из ацетилацетоната железа, покрытых SiO2 и модифицированных 3-аминопропилсиланом, для последующей оценки эффективности терапии опухолей с использованием адресных гибридных наноматериалов. В качестве модельного противоопухолевого препарата был использован доксорубицин. В качестве модификатора был выбран плюроник F127, имеющий в своей структуре гидрофобные участки полипропиленгликоля, в которые могут загружаться гидрофобные противоопухолевые препараты за счет физической адсорбции. Загрузка доксорубицина составила 15,1% для наночастиц диаметром до 10 нм и 12,3% для наночастиц от 10 до 20 нм по массе. В ходе разработки протокола для последующего исследования индукции ферроптоза наночастицами in vitro было установлено, что методы окрашивания с трипановым синим и проточной цитометрии с 7-AAD не позволяют сделать заключение об эффективности индукции/ингибирования ферроптоза в клеточной культуре (Таблица 2, 3). Это обусловлено тем, что данные методы дают информацию о жизнеспособности клеток, в той или иной степени сохраняющих свою структуру, тогда как клетки уже подвергшиеся деструкции не учитываются в анализе. Можно видеть, что число клеток в образцах после инкубации с эрастином значительно снижается, в то же время жизнеспособность рассчитанная по данным окрашивания с трипановым синим и методом проточной цитометрии не позволяет учесть данный параметр. В связи с этим нами был выбран МТТ-тест оценки жизнеспособности клеток, отражающий не только количество жизнеспособных клеток в образце, но и позволяющий учитывать изменения плотности культуры (Таблица 2, 3, 4). На основании анализа влияния исследуемых ингибиторов ферроптоза на жизнеспособность клеток in vitro, в том числе в присутствии эрастина, в качестве оптимального ингибитора ферроптоза нами был выбран N-ацетил-L-цистеин в конечной концентрации 1 мМ. Разработанный протокол исследования индукции ферроптоза наночастицами in vitro представлен в Приложении к отчету (Протокол). | ||
| 2 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Адресные наногибридные материалы для терапии и диагностики онкологических патологий |
| Результаты этапа: На втором этапе выполнения проекта были выполнены экспериментальные исследования безопасности и функциональной активности ананогибридных материалов на основе наночастиц оксида железа со средним диаметром до 10 и от 10 до 20 нм, на поверхности которых ковалентно привиты векторные молекулы уреид (лиганд PSMA), CREKA и pHLIP пептиды, на культурах клеток in vitro. По аналогии с ранее разработанным методом синтеза наночастиц, за счет введения в структуру оболочки наноматериалов красителя Су5, получен ряд флуоресцентных адресных наногибридных материалов на основе магнитных наночастиц, на поверхности которых иммобилизованы векторные молекулы уреид и CREKA. В связи с отсутствием функциональной активности и проявлением слабого цитотоксического действия в отношении клеток, зарегистрированного для наноматериалов, модифицированных тетраэтоксисиликатом и 3-аминопропилтриэтоксисиланом с последующей иммобилизацией пептида pHLIP с использованием кросс-линкера EMSC (полученного на первом этапе выполнения проекта в 2017 г), дизайн данных наноматералов был модифицирован. В результате получены новые, в том числе флуоресцентные, наноматериалы на основе пэгилированных наночастиц оксида железа со средним диаметром до 10 и от 10 до 20 нм по аналогии с методом, использованным для синтеза наноматериалов с векторными молекулами уреид и CREKA. Успешность иммобилизации пептида pHLIР на поверхности наночастиц подтверждена данными ИК-спектроскопии, термогравиметрического и элементного анализов. Коэффициенты релаксивности (r2) для наноматериалов на основе наночастиц с размером магнитного ядра до 10 и от 10 до 20 нм, конъюгированных с пептидом рНLIP, составили 201 и 227 ммоль−1 с−1, соответственно. Для дальнейших биологических испытаний все 6 типов адресных нанобиогибридных материалов и их флуоресцентно-меченые аналоги были подвергнуты обработки для удаления возможных примесей стабилизатора ЦТМА и получены водные суспензии наноматериалов. Согласно данным исследования методом динамического светорассеяния и измерения потенциала, полученные наноматериалы формируют достаточно устойчивые коллоидные растворы со средним диаметром частиц (Dh) порядка 200 нм, имеющим отрицательный поверхностный заряд. Исследования функциональной активности и цитототоксичности полуулченных наноматериалов выполнены на линиях опухолевых и неопухолевых клеток: глиомы крысы С6, глиобластомы человека U87, аденокарциномы простаты человека LNCaP и PC-3, аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB-231, аденокарциномы молочной железы мыши 4Т1, и недифференцированных фибробластов человека 3T3-L1, а также первичных культурах клеток – астроцитов крысы и моноцитов мыши. Цитотоксичность наноматериалов исследована in vitro на культурах клеток, перечисленных выше, методом МТТ-теста и на основании оценки проникновения красителя SytoxGreen. Наночастицы не проявляли цитотоксичности во всем диапазоне тестируемых концентраций (6-200 мг/л), IC50 не определялся из экспериментальных данных. В результате исследований подтверждена функциональная активность полученных наноматериалов. Показано, что наноматериал, на основе наночастиц, конъюгированных с CREKA активно связывается клетками исследованных линий С6 и U87. Также наблюдается выраженный захват этими линиями исходных пэгилированных наночастиц. Наноматериалы, на основе наночастиц, конъюгированных с рНLIP пептидом демонстрировали эффективное связывание с опухолевыми клетками при рН 6,8, тогда как при рН 7,4 проникновение наночастиц в клетки было незначительным. Это свидетельствует о рН-зависимом pHLIP-опосредованном связывании наноматериалов с клетками, что подтверждает функциональную активность полученных адресных наноматериалов. Показано, что наноматериалы, на основе наночастиц, конъюгированных с лигандом PSMA, селективно связывается с мембраной клеток аденокарциномы простаты линии LNCaP, экспрессирующими PSMA. В тоже время и клетки линии PC3, не экспрессирующей данный антиген, примерно одинаково активно захватывают, как наночастицы с лигандом PSMA, так и наночастицы без него Проникновение наноматериалов в клетки подтверждено исследованиями ультраструктуры клеток после их инкубации с наноматериалами методом ПЭМ, благодаря которому былы выявлены скопления наночастиц в клеточных везикулах. Исследование способности наноматериалов индуцировать ферроптоз в опухолевых клетках было выполнено на линиях MDA-MD231 и 4T1. Согласно данным оценки выживаемости клеток после инкубации с наноматериалами в среде без аминокислот методом МТТ-теста, в сочетании с результатами анализа продукции активных форм кислорода с использованием DCFDA-теста, установлено, что исследуемые наноматериалы не вызывают гибель клеток по механизму ферроптоза. Для оценки эффективности магнитной активации с использованием полученных в работе наноматериалов нами были отработаны режимы амплитудно-частотных и пространственно-временных параметров активирующего магнитного поля в экспериментах на клеточных культурах С6, U87, PC3 и LNCaP c использованием, наноматериалов с иммобилизованными на их поверхности молекулами уреида PSMA и CREKA-пептида, так и наноматериалов, их не содержащих. Установлено, что в присутствии переменного низкочастотного магнитного поля с магнитной индукцией 100 мТл после инкубации клеток в течение 24 часов наблюдается наименьшая выживаемость, в первую очередь у клеточных линий PC-3 и LNCaP. В контрольных группах без воздействия магнитного поля в присутствии наночастиц либо же наоборот – после воздействия магнитного поля, но без наночастиц, выживаемость не клеточных линий не меняется. Таким образом, нами получены адресные наногибридные материалы, на основе магнитных наночастиц оксида железа с размерами магнитного ядра до 10 нм и от 10 до 20 нм. Данные наноматериалы нетоксичны, обладают потенциалом для реализации терапевтического эффекта на клетки-мишени за счёт магнитно-механической активации и могут быть успешно использованы для проведения дальнейших исследований in vivo. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".