ИСТИНА

Вестиментиферы – это уникальная группа крупных морских беспозвоночных, обитающих в восстановительных сообществах на дне Мирового океана (гидротермальные очаги, метановые высачивания и другие). Близкой группой к вестиментиферам является группа френулятных погонофор (Frenulata). Представители вестиментифер и погонофор лишены во взрослом состоянии пищеварительного тракта и питаются за счет симбиотических хемоавтотрофных бактерий (Малахов, Галкин, 1998; Southward et al., 2005; Bright, Lallier, 2010). По современным представлениям, погонофоры и вестиментиферы в качестве единой группы (называемой "Siboglinidae") относятся к кольчатым червям, но однозначного мнения о положении группы внутри системы Annelida нет (Land, Norrevang, 1977; Schulze, 2003; Rouse, 2001; Rousset et al., 2004, 2006; Zrzavy et al., 2009). Современные исследования молекулярной филогении не способны выявить близость "Siboglinidae" ни к одной из групп кольчатых червей (Bleidorn et al., 2003; Hall et al., 2004; Struck, Purschke, 2005; Rousset et al., 2006). Филогенетические исследования на основе сочетания молекулярных и морфологических признаков свидетельствуют о родстве "Siboglinidae" с полихетами Oweniidae (Rousset et al., 2004; Zrzavy et al., 2009). Основной морфологической чертой, объединяющей представителей "Siboglinidae" и Oweniidae, является залегание элементов центральной нервной системы в эпидермисе. Однако Oweniidae – не единственная группа полихет с интраэпидермальной нервной системой. Например, она характерна также для мелких эррантных мейобентосных полихет и других полихет (Bullock, Horridge, 1965). Конвергентное ли сходство залегания нервной системы в эпидермисе представителей групп "Siboglinidae", Oweniidae и других представителей кольчатых червей? Для этого ответа необходимо провести детальное исследование организации нервной системы "Siboglinidae". В качестве представителей "Siboglinidae" нами выбраны гигантские вестиментиферы и мелкие френулятные погонофоры. Целью работы является исследование организации нервной системы вестиментифер (Vestimentifera: Annelida) с помощью микроскопических методов и методов трехмерных реконструкций. Впервые в мировой практике планируется исследовать закономерности организации не только центрального отдела нервной системы Vestimentifera, но и периферического отдела. Планируется создать трехмерные реконструкции отделов центральной нервной системы, в т.ч. внутреннее строение мозга; выявить особенности строения и расположения нервных элементов вестиментифер; проследить иннервацию обтюракальных выростов, происхождение которых на сегодняшний момент неизвестно; выявить рецепторные клетки кожных покровов и иннервацию мускулатуры. После этого будет проведено сравнение нервной системы вестиментифер с таковой френулятных погонофор (Frenulata) из коллекции ЗИН РАН. По окончании работ планируется подготовка научных публикаций.

В ходе работы в Зоологическом институте было проведено описание коллекции бескишечных червей с восстановительных местообитаний, относящиеся к группам Pogonophora и Vestimentifera. В дальнейшем был выбран модельный объект для изучения общей анатомии и описания нейрогистологии этих групп. Анатомия нервной системы вестиментифер и погонофор. Строение тела вестиментифер и погонофор опубликованы в ряде работ и монографий (Gardiner, Jones, 1993; Southward, 1993; Малахов, Галкин, 1998), однако положение этих животных на филогенетическом дереве является темой бесчисленных споров. После первых описаний погонофор были выдвинуты идеи об их принадлежности к полихетам Sabellidae (Uschakow, 1933). В процессе дальнейших исследований организации тела погонофор, их развития и палеонтологических находок их выделили в отдельную группу и возвысили до типа Pogonophora (Беклемишев, 1944; Иванов, 1960). Первую найденную вестиментиферу Вебб сравнил с погонофорами, обнаружил черты сходства с ними и отнес к тому же типу в составе класса Afrenulata, при этом погонофор определил как группу Frenulata по наличию кутикулярного киля - френулюма (Webb, 1969). Родственное сближение этих групп поддерживалось другими исследователями погонофор, которые, однако, имели разные взгляды на типовую принадлежность этих червей: кольчатые черви или самостоятельный тип среди вторичноротых животных (Иванов, 1960; Southward, 1980). Джонс, описавший первых гидротермальных вестиментифер, считал, что обе группы настолько не похожи, что их нужно помещать в отдельные типы животных (Jones, 1985). Сейчас принято объединять френулятных погонофор и вестиментифер в одну группу «Siboglinidae» внутри типа кольчатых червей (McHugh, 1997; Rouse, Fauchald, 1997; Zrzav? et al., 2009). Ранг группы не определен, поэтому название даем в кавычках. По одной из последних идей «Siboglinidae» близки к группе полихет Oweniidae (Rousset et al., 2004). На протяжении последнего столетия неопределенное филогенетическое положение этих червей является своеобразным камнем для специалистов в этой области. Несмотря на длительный срок изучения, до сих пор имеются белые пятна в организации ряда систем органов этих червей. Одной из таких малоизученных систем является нервная система, имеющая весомый вклад в филогенетических построениях. Проведено морфолого-анатомического сравнение вестиментифер и погонофор на примере крупных представилей среди себе подобных как Riftia pachyptila (Vestimentifera) и Oligobrachia mashikoi (Pogonophora). Особенностью туловищной нервной системы погонофор и вестиментифер является ее чисто эпидермальное положение и отсутствие парности, особенно очевидное в туловищном отделе. Отметим, что у погонофор и вестиментифер туловищная нервная система не обнаруживает никакой тенденции к погружению. У базальной пластинки, подстилающей эпидермис в районе вентрального нервного ствола, в большинстве случаев не намечается никакой тенденции к впячиванию вглубь тела. Среди кольчатых червей, эпидермальная нервная система встречается у представителей группы Aelosomatidae и некоторых представителей полихет, например, у некоторых Spionidae, Syllidae, Opheliidae, Maldaniidaeа, а также у семейства Oweniidae и так называемых «архианнелид», например, Polygordiidaе, Protodrilidae, Dinophiilidae (Bullock, Horridge, 1965; Бубко, Миничев, 1972). У погонофор и вестиментифер вдоль всего тела идет неганглионизированный вентральный нервный ствол, и только в крошечной опистосоме погонофор имеются парные ганглии, напоминающие брюшную нервную цепочку. В то время, как для аннелид, в состав которых входят исследуемые вестимениферы и погонофоры, характерна нервная система лестничного типа: в каждом сегменте имеется пара ганглиев, которые соединены продольными нервными стволами с такими же ганглиями в соседнем сегменте. Тем не менее, сравнение брюшной нервной системы вестиментифер и погонофор с таковой типичных аннелид вполне возможно, если принять во внимание необычность сегментарного состава тела вестиментифер и погонофор. Сегменты опистосомы в обеих группах вполне сопоставимы с сегментами тела аннелид, а у погонофор в каждом сегменте имеется пара ганглиев. Что касается длинного туловищного отдела, то он, вероятно, соответствует единственному необыкновенно удлиненному сегменту. Интересно, что у погонофор в этом сегменте посередине туловищного отдела имеется поясок, состоящий из крючковидных щетинок. Можно предполагать, что щетинки пояска соответствуют набору щетинок туловищного сегмента. У вестиментифер во взрослом состоянии щетинок в туловищном отделе нет, однако у ювенильных стадий вестиментифер описаны капиллярные щетинки на заднем конце туловищного отдела впереди от септы, отделяющего его от первого сегмента опистосомы (Jones, Gardiner, 1989). Что касается вестиментального отдела, то он, вероятно, соответствует удлиненному перистомиуму или быть может перистомиуму и первому послеротовому сегменту. У погонофор вестиментальному отделу соответствует мезосома. Необычайное удлинение первых сегментов тела приводит к такой трансформации нервной системы, что в них невозможно опознать брюшную нервную цепочку. Еще один факт свидетельствует об удлинении сегментов: в удлиненных передних сегментах от брюшной нервной цепочки отходит множество боковых нервов, тогда как в коротких сегментах опистосомы - отходит по одной паре боковых сегментов. Мозг вестиментифер представляет собой массу нервной ткани, залегающей на самом переднем конце вестиментального отдела. Как показано выше, несмотря на относительно большие размеры, весь мозг лежит в эпидермисе, и базальную пластинку, отделяющую мозг сзади от соединительной ткани вестиментального отдела, следует рассматривать как базальную пластинку эпидермиса передней стенки тела. Чисто эпидермальное положение мозга – очень редкое явление у взрослых кольчатых червей и встречается, например, у упомянутых овениид (Бубко, Миничев, 1972). Мозг вестиментифер организован сложно (детали строения см. ниже). В целом мозг вестиментифер обнаруживает сходство с планом строения мозга полихет, если принять высказанную идею о том, что он представляет собой результат объединения надглоточного и подглоточного ганглия. В организации дорсальной части мозга вестиментифер можно обнаружить специальные сходства с организацией надглоточного ганглия типичных полихет, в частности – в мозгу вестиментифер можно найти гомологи дорсальной и вентральной пар поперечных комиссур. В отличие от вестиментифер мозг погонофор значительно менее дифференцированная структура. У Spirobrachia grandis можно обнаружить два нерезко разделенных слоя – базальный волокнистый и прилегающий к нему с внешней стороны слой тел нейронов. По существу, мозг погонофор представляет собой просто утолщение передней части вентрального нервного ствола. В наиболее широкой части мозга имеется поперечный комиссуральный пучок. В задней части мозга описываются два продольных пучка, которые, сливаясь, формируют брюшной нервный ствол мезосомы погонофор. В районе прикрепления щупальцевого аппарата мозг образует боковые выросты, заходящие на брюшную сторону, где они сливаются и образуют полное нервное кольцо. От боковых участков этого кольца отходят нервы щупалец. Число щупалец у погонофор значительно меньше, чем у вестиментифер, и, по-видимому, именно этим объясняется значительно более простое строение мозга. Возможно, что кольцевая комиссура погонофор (или полукольцевая, т.е. разомкнутая на спинной стороне), соответствует пучку нервов, иннервирующих одну пару щупальцевых ламелл у вестиментифер. Современные исследования (Hessling, Purschke, 2000; M?ller et al., 2003, M?ller, 2004; M?ller, Henning, 2004) выявили множество вариантов организации мозга и нервной системы аннелид в целом. Сопоставляя наши данные с этим разнообразием, можно сказать, что строение нервной системы вестиментифер соответствует плану строения нервного аппарата кольчатых червей и не выходит за пределы этого разнообразия. Применение метода трехмерных реконструкций в изучении мозга вестиментифер Для дальнейших нейробиологических исследований выбран модельный объект - гидротермальная вестиментифера Riftia pachyptila, отличающаяся своими гигантскими размерами, что позволяет рассмотреть многие тонкие детали строения мозга на световом уровне и сравнить с мозгом кольчатых червей. Впервые на примере R. pachyptila изучена внутренняя организация мозга вестиментифер с применением метода трехмерных реконструкций. 3D-реконструкции мозга R. pachyptila сделаны на основе двухмерных изображений с помощью программного обеспечения 3D-DOCTOR 3.5.040724 (Able Software Corporation of Lexington, США) на платформе Windows XP. Фотографии срезов сделаны на микроскопе “AXIOPLAN” фирмы Zeiss, записаны в формате JPEG с разрешением 3900 х 3090 пикселей и 8бит/ пиксель. Сделаны реконструкции головного мозга на основе серии из 77 фотографий гистологических поперечных срезов через вестиментальный отдел самца с длиной тела 79 мм. Ширина обзора изображения составляет 2812.00 мкм, параметры вокселей изображений - 0,721026 х 0,721026 х 15 мкм3. Мозг R. pachyptila – крупная двулопастная структура, залегающая в эпидермисе на вентральной стороне тела в передней части вестиментального отдела. Ранее были высказаны предположения, что мозг вестиментифер - это объединение над- и подглоточного ганглиев (Jones, Gardiner, 1989). Мы проводили исследование на небольшом взрослом экземпляре, у которого сохранился остаток кишечного целома, проходящего через толщу мозга. В ходе нашего исследования впервые выявлены и описаны продольные нервные тракты, представляющие собой основные коннективы мозга. Они соединяют части мозга, которые соответствуют надглоточному и подглоточному ганглиям типичных аннелид. Описаны основные мозговые комиссуры: дорзальная, представленная двумя дугами, надкишечная и подкишечная комиссуры. Две первые комиссуры входят в ту часть мозга, которая соответствует надглоточному ганглию, а подкишечная комиссура – подглоточному ганглию. В надкишечной части мозга прослежены различные продольные и вертикальные нервные тракты, показана иннервация щупалец и обтюракул. Удалось выделить два крупных скопления перикарионов в дорзальной (крыша мозга) и вентральной частях мозга. В крыше мозга имеется обширный дорзальный слой, состоящий из крупных и мелких тел нейронов, лежащих в основании щупальцевых ламелл. На вентральной стороне мозга имеется трехдольчатое скопление преимущественно составленное из тел крупных перикарионов. В целом такая локализация тел нейронов не характерна для ганглионарных образований типичных полихет, однако она, хотя и в более миниатюрном виде, наблюдается у погонофор и полихет Oweniidae (Бубко, Миничев, 1972). В дорзальной части мозга R. pachyptila обнаружены две пары гигантских перикарионов, от которых отходят гигантские аксоны. Предполагается, что они обеспечивают быстрое проведение импульсов вдоль всего тела, необходимое для осуществления генерализованной защитно-оборонительной реакции. Ранее была описана только одна пара гигантских клеток (Jones, Gardiner, 1989). В ходе работы описана также иннервация щупалец рифтии. Она происходит от нейропиля боковых лопастей. Нейропиль боковых лопастей примыкает к продольным нервным трактам – возможным гомологам окологлоточных коннектив. Окологлоточные коннективы многих полихет участвуют в иннервации б?льшей части перистомиальных пальп (Orrhage, M?ller, 2005). Иннервация щупалец вестиментифер не противоречит возможности сравнения их с пальпами полихет, но соответствующие части (продольные тракты и боковой нейропиль) мозга вестиментифер (особенно у рифтии) развиты несравненно мощнее, поскольку и сам щупальцевый аппарат развит очень сильно. Интересно, что иннервация обтюракул происходит от дорзальной мозговой комиссуры, что доказывает, что это парные выросты фронтальной поверхности переднего конца тела, развившиеся независимо от щупалец. На данный момент нет определенных сведений и природе обтюракул. Известно несколько теорий о природе обтюракул: либо это самый первый сегмент тела (Jones, 1985), либо это видоизмененные щупальца первой пары (Иванов, 1989), либо особые образования (Southward, 1999). Мы придерживаемся последнего мнения. Материалы по объемной реконструкции мозга вестиментиферы Riftia pachyptila подготовлены в виде статьи «Central nervous system of gigantiс Riftia pachyptila Jones, 1980 (Vestimentifera: Annelida): microscopical anatomy and 3D-reconstructions» в журнал Zoomorphology. Нейрогистологическое исследование нервной системы вестиментифер с помощью метода импрегнации серебром Впервые на модельном объекте была разработана модификация метода импрегнации азотнокислым серебром по Гольджи-Колонье. Подобраны сроки, состав и концентрации фиксирующих и импрегнирующих жидкостей. Освоена методика заливки в целлоидин, приготовление серийных толстых (60-100 мкм) постоянных срезов для дальнейшего нейрогистологического анализа. Получены навыки анализа нейрогистологических препаратов с возможностью воссоздания трехмерной архитектоники нервной системы вестиментифер. Заслушан курс лекции по нейробиологии, в т.ч. по нейрогистологической терминологии и закономерностям эволюции нервных систем у Lophotrochozoa. Подобный курс необходим для дальнейшей работы с вестиментиферами и описания состояния развития нервной системы у них. В результате нейрогистологического исследования вестиментиферы R. pachyptila получены первые данные по строению периферической нервной системы. Особое внимание в работе было уделено сенсорной системе, которая до сих пор остается не изученной у всех Pogonophora и Vestimentifera. Выявлено и описано большое количество рецепторных клеток по длине всех щупалец (включая жаберные и специализированные сенсорные щупальца). Аналогичные первично чувствующие клетки выявлены в эпидермисе стенки тела в обтюракулах, вестиментуме и туловище, единичные клетки удается выявить в опистосоме. Клетки характеризуются примитивной формой, мало отличаются по форме от окружающих эпителиальных клеток. От базальной части рецепторных клеток отходят аксоноподобные отростки, которые образуют кольцевые и продольные тракты в базальной части эпителия и направляются в зависимости от своего местоположения либо в туловищный вентральный мозг либо непосредственно в головной мозг. Выявлена эфферентная иннервация стенки тела, мускулатуры и грушевидных желез. Показано, что эфферентные отделы нервной системы занимают субэпителиальное положение (ранее описаны только интраэпидермальные нервные элементы). Эфферентная система представлена густым субэпителиальным нервным сплетением с отходящими от него вглубь соединительной ткани тела крупными нервными волокнами (особенно в вестиментальном отделе), направляющимися к группам мышц и многоклеточным грушевидным железам. Выявленное субэпителиальное нервное сплетение представлено однотипными мультиполярными нервными клетками. В мускулатуре основные отростки эфферентных нейронов идут всегда параллельно мышечным волокнам. Настоящая работа является первым исследованием нервной системы вестиментифер с применением специфических нейрогистологических методов. Полученные результаты впервые позволяют получить представление о клеточной архитектоники нервной системы вестиментифер. Нервная система является консервативной и используется морфологами для построения взаимоотношений основных групп беспозвоночных, поэтому полученными нами данные могут лечь в основу дальнейшего сравнения вестиментифер с остальными аннелидами и определения их местоположения на филогенетическом древе многощетинковых червей. Полученные результаты поданы в виде тезисов "The first neurohistological study of peripheral nervous system of vestimentiferan tubeworm Riftia pachyptila (Annelida)" на Международную конференцию по многощетинковым червям, которая пройдет в Австралийском музее (г. Сидней, Австралия) 4-9 августа 2013 года. Подготовлена к печати статья «Особые рецепторные органы вестиментифер» в Зоологический журнал.