| Результаты этапа: 1. Впервые в России обнаружен cherry virus A (CVA, род Capillovirus, семейство Betaflexiviridae) и секвенирован полный геном этого вируса. Вирусный изолят обнаружен в Никитском ботаническом саду (НБС, Ялта, Республика Крым) при метатранскриптомном анализе симптоматичного гибрида Prunus cerasifera Erch. х P. аrmeniaca c. Shlor Tsiran. Из 21340 парноконцевых прочтений длиной 250 нуклеотидов (нт), полученных при высокопроизводительном секвенировании (high-throughput sequencing, HTS), собран и аннотирован полный геном российского изолята CVA длиной 7426 нт. В геноме идентифицированы две открытые рамки считывания (open reading frame, ORF). ORF1 длиной 7029 нт кодирует полипротеин (2342 аминокислотных остатка, аа), который содержит мотивы метилтрансферазы, хеликазы и РНК-зависимой РНК-полимеразы и, очевидно, представляет собой репликазу вируса. ORF2 находится в другой рамке считывания и кодирует транспортный белок (movement protein, MP). 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности состоят, соответственно, из 100 и 297 нт. Полногеномная последовательность российского изолята CVA депонирована в GenBank под номером OQ865368. Филогенетический анализ всех доступных полногеномных последовательностей показал, что российский изолят группируется с не-вишневыми изолятами CVA из различных регионов мира и в среднем на 99,5% идентичен изолятам, входящим в этот кластер.
2. Впервые в России обнаружен little cherry virus 1 (LChV1, род Velarivirus, семейство Closteroviridae) и секвенирован полный геном этого вируса. Изолят вируса обнаружен в Степном отделении НБС при анализе вирома тригибрида (P. cerasifera Erch. х P. аrmeniaca L.) x P. brigantiaca Vill. Из 27359 прочтений, полученных при HTS, собран и аннотирован полный геном российского изолята LChV1 длиной 16930 нт. В геноме идентифицированы восемь ORF. Перекрывающиеся ORF1a и ORF1b кодировали компоненты репликазы. Остальные ORF были разделены нетранслируемыми участками длиной от 1 до 171 нт. Полногеномная последовательность российского изолята LChV1 депонирована в GenBank под номером OR260412. Филогенетический анализ всех доступных полногеномных последовательностей LChV1 разделил их на 5 кластеров. Российский изолят группировался с греческим изолятом G15_3 из черешни, однако идентичен ему только на 77,3%.
3. Впервые секвенированы полные геномы российских изолятов prunus necrotic ringspot virus (PNRSV) и prune dwarf virus (PDV) (род Ilarvirus, семейство Bromoviridae), представленные тремя однонитевыми молекулами РНК положительной полярности, каждая из которых инкапсидирована в отдельную вирусную частицу. Два изолята PNRSV обнаружены в Степном отделении НБС при анализе вирома симптоматичных листьев сливы P. domestica c. Cacanska beste, интродуцированной из бывшей Югославии, и тригибрида [(P. cerasifera Erch. х P. аrmeniaca L.) x P. brigantiaca Vill.]. Изолят PDV выявлен в НБС при метатранскриптомном анализе сеянца сливы неизвестного сорта с симптомами вирусной инфекции. Из прочтений, полученных при HTS, собраны и аннотированы все три геномных РНК российского изолята PDV длиной 3341 (РНК1), 2585 (РНК2) и 2124 (РНК3) нт. Четыре ORF кодировали репликазу, РНК-зависимую РНК-полимеразу, МР и белок оболочки вируса (coat protein, CP). Собраны и аннотированы полные геномы двух изолятов PNRSV, структура генома которых была типичной для представителей рода иларвирусов. Полногеномные последовательности российских изолятов PDV и PNRSV были депонированы в GenBank под номерами OQ995020-OQ995022 и OR090897-OR090902, соответственно. Филогенетический анализ всех доступных полноразмерных последовательностей геномных РНК1, РНК2 и РНК3 PDV и PNRSV показал, что они группируются в два (PNRSV) или три (PDV) основных кластера. При этом у некоторых изолятов обоих вирусов РНК1, РНК2 и РНК3 распределены в разные кластеры, что может указывать на их происхождение путем реассортации и/или рекомбинации.
4. Впервые в России обнаружен представитель группы умбра-подобных вирусов (umbra-like viruses, семейство Tombusviridae) и секвенирован его полный геном, состоящий из однонитевой молекулы РНК положительной полярности. Изоляты вируса обнаружены в генофондовой коллекции инжира (Ficus carica) НБС с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в пяти 30-летних деревьях-каприфигах (мужских растениях инжира) сорта Belle Dure c симптомами мозаичной болезни. В ОТ-ПЦР использовали праймеры, специфичные к fig umbra-like virus (FULV), поэтому выявленный в НБС вирус, возможно, принадлежит к этому же виду. В результате метагеномного анализа образцов каприфигов собраны и аннотированы полные геномы пяти российских изолятов FULV длиной 2953-3076 нт, которые были идентичны между собой на 99,4-99,9%. Три ORF были идентифицированы в геномах российских изолятов. ORF2 кодирует РНК-зависимую РНК-полимеразу, которая транслируется в результате сдвига рамки считывания при трансляции ORF1. ORF5 перекрывается с ORF2 и кодирует белок с неизвестной функцией. Полногеномные последовательности российских изолятов FILV были депонированы в GenBank под номерами OR890003-OR890007. Филогенетический анализ всех доступных полногеномных последовательностей умбравирусов и умбра-подобных вирусов показал, что российские изоляты образуют отдельную кладу, сестринскую с кладой изолятов FULV, обнаруженных на инжире на Гавайях. Возможно, российские и гавайские изоляты умбра-подобных вирусов являются разными вирусами или высокодивергентными изолятами FULV. Российские изоляты вируса обнаружены только в каприфигах и не выявлены ни в одном из обследованных деревьев других сортов инжира. В вироме каприфигов обнаружены также прочтения, родственные fig mosaic virus, fig badnavirus 1 и grapevine badnavirus 1.
5. Из прочтений, полученных ранее при HTS тотальной РНК из деревьев вишни (P. cerasus) с симптомами шарки из Татарстана, собраны шесть новых полных геномов plum pox virus (PPV, род Potyvirus, семейство Potyviridae), относящихся к штамму С (PPV-C). Большая ORF кодировала полипротеин длиной 3143 аа. В полипротеине выявлены мотивы, опосредующие передачу вируса тлями (KITC и PTK в белке Hc-Pro и DAG в СР), GDD в NIb (РНК-зависимой РНК-полимеразе), универсальный эпитоп DRDVDAG в СР и все сайты протеолиза для вирусспецифических протеаз P1, Hc-Pro и NIa. Ген СР состоял из 996 нт и кодировал белок длиной 332 аа. Новые геномы были в среднем на 99,0% идентичны между собой и другим изолятам штамма С из России и Беларуси. Новые полногеномные последовательности шести российских изолятов были депонированы в GenBank под номерами OR889997-OR890002.
6. Проведены обследования насаждений косточковых культур в Главном ботаническом саду имени Н.В. Цицина РАН (ГБС) и музее-заповеднике Коломенское (г. Москва) с целью выявления деревьев с признаками вирусной инфекции. В дендрарии ГБС симптомы обнаружены на деревьях сакуры P. sachalinensis и сливы американской P. аmericana, а в коллекции лаборатории культурных растений ГБС - на абрикосе (P. armeniaca) сортов Водолей, Фаворит и Профессор Скворцов, на персике (P. persica) с. Саратовский и черешне (P. avium) с. Ипуть. Из симптоматичных листьев выделена тотальная РНК с помощью метода, основанного на использовании цетилтриметиламмония бромида (CTAB). Выделенная РНК была использована в качестве матрицы для синтеза библиотек кДНК с целью их последующего HTS на платформе Illumina. В парке Коломенское выявлены деревья сливы с симптомами шарки. Симптомы обнаружены как на высоких старых деревьях, так и на молодой поросли. Анализ образцов листьев с помощью иммуноспецифической ОТ-ПЦР с универсальными праймерами подтвердил PPV во всех исследованных образцах. Это первое выявление PPV в ландшафтных парках г. Москвы.
7. При обследовании коллекций пиона (Paeonia spp.) и флокса (Phlox paniculata) в ГБС и Ботаническом саду МГУ (БС) выявлены многочисленные растения с симптомами вирусной инфекции. На пионе типичным симптомом оказалась кольцевая пятнистость, указывающая на возможное заражение вирусом погремковости табака (tobacco rattle virus,TRV, род Tobravirus, семейство Virgaviridae). На флоксе преобладали крапчатость, мозаика и кольцевая пятнистость на листьях, характерные для неповирусов (род Nepovirus, cемейство Secoviridae). Иммуноферментный анализ (ИФА) симптоматичных растений пиона выявил TRV только в одном из 16 протестированных кустов. ИФА неповируса мозаики резухи (arabis mosaic virus, ArMV) в симптоматичных растениях флокса выявил ArMV только в одном из 12 протестированных кустов из коллекции БС. Выделена тотальная РНК из 10 растений пиона и 7 растений флокса с симптомами вирусной инфекции.
|
