ИСТИНА

Проект направлен на проведение микробиологических, биогеохимических и молекулярно-экологических исследований процесса сульфатредукции (СР), на выявление доминирующих форм сульфатредуцирующих бактерий в аэробных водах, хемоклине, придонных анаэробных горизонтах и поверхностных осадках российского сектора Гданьской впадины Балтийского моря. На основании детальных радиоизотопных исследований в сочетании с гидрохимическим анализом распределения различных неорганических соединений серы, будут получены количественные оценки скорости СР и выявлены горизонты с максимальной интенсивностью этого процесса. Из этих горизонтов планируется выделить моно- и чистые культуры сульфатредуцирующих бактерий, выявить их субстратную специфичность и уровень устойчивости к присутствию кислорода в культуральной среде. Использование широкого набора 16S рРНК-специфичных олигонуклеотидных зондов позволит в разных гидрологических слоях водной толщи и поверхностных осадках Балтийского моря, а также в накопительных культурах, методом флуоресцентной in situ гибридизации выявить присутствие, определить численность и идентифицировать основные группы сульфатредукторов.

Анализ гидрологических данных, полученных гидрофизическим зондом с дополнительными датчиками О2, мутности и Eh выявил достаточно выраженную неоднородность вод глубоководной зоны Гданьской впадины в июле 2011 г. Прежде всего, нами обнаружен заметный скачок содержания О2 в интервале глубин 25-65 м, который коррелирует с данными Еh, температуры и условной плотностью (Sigma T), также выклинивающихся в этом интервале глубин. В придонных горизонтах обнаруживалась типичная для этого района моря гипоксия. Следы сероводорода (<0,1 мг/л) появлялись на глубине 102 м и прослеживались до дна. Общая численность и биомасса микроорганизмов в горизонтах фотического слоя и у дна были весьма значительными (до 3,8 млн кл./мл и 630 мкг/л, соответственно). На глубинах 30 и 50 м эти показатели резко снижались до нетипично низких для этих глубин Балтики величин и составляли на глубине 50 м 0,15 млн кл./мл и 20 мкг/л, соответственно. Основываясь на результатах гидрохимических и микробиологических исследований можно предположить, что формирование промежуточного слоя водной толщи с низкой численностью клеток микроорганизмов связано с вклиниванием на этих глубинах горизонтального течения, предположительно океанского происхождения. Наряду с измерением численности и биомассы бактериопланктона методом in situ гибридизации (FISH) с использованием универсальных зондов было исследовано соотношение клеток бактерий и архей. В работе применяли следующие 16S рРНК-специфичные олигонуклеотидные зонды, меченные флуоресцентным красителем цианином 3 («Синтол», Россия): для идентификации бактерий - EUB338 и EUB338 II, для архей - ARCH344 и ARCH915 и более специфичные – для дифференцировки некоторых групп сульфатредуцирующих бактерий (SRB385, DSB985 и DSV214). В качестве контроля на возможную автофлуоресценцию микроорганизмов использовали соответствующие секции фильтров без добавления зонда. С помощью FISH было показано, что доля бактериальных клеток на различных глубинах в Балтийском море колеблется от 18 до 65% от численности всех микроорганизмов, окрашенных универсальным ДНК-красителем ДАФИ, причем наибольший процент выявленных бактерий наблюдался в поверхностном и придонном горизонтах. Численность архей оказалась значительно ниже и не превышала 12% от общей численности микробных клеток. Однако, в отличие от бактерий, достоверно археи были выявлены только в глубоководной зоне Гданьской впадины, начиная с глубины 80 м и до дна. В исследованных пробах водной толщи методом FISH нам не удалось выявить физиологически активные клетки сульфатредукторов в статистически достоверных количествах. Гибридизация с зондами на основные группы сульфатредукторов либо отсутствовала, либо процент гибридизации находился на уровне нижнего предела чувствительности метода FISH (менее 4%). При этом следует отметить, что существуют определенные ограничения по использованию метода FISH для обнаружения морских прокариот в зависимости от их метаболической активности. Поэтому слабый сигнал флуоресцентных зондов в глубоководной зоне океана в литературе обычно объясняется малым количеством рРНК в клетках глубоководных микроорганизмов с низким уровнем метаболической активности. Однако с использованием радиоизотопного метода нам удалось зафиксировать процесс сульфатредукции в водной толщи на глубине 102 и 107 м, скорость которого составляла 0,18 и 2,8 мкмоль/(л сут ), соответственно. В поверхностных осадках интенсивность сульфатредукции возрастала до 32 мкмоль/(дм3 сут). Из проб воды, отобранных с глубин 0, 10, 30, 50, 80, 102 и 107 м была выделена тотальная ДНК микроорганизмов. С использованием олигонуклеотидных праймеров, специфичных к участку гена диссимиляционной сульфитредуктазы (dsrB), характерного для всех представителей сульфатредуцирующих бактерий (СРБ), и к участкам гена 16S рРНК шести основных филогенетических групп СРБ, был проведен ПЦР-анализ выделенной ДНК. Было показано наличие гена диссимиляционной сульфитредуктазы (dsrB) в водных пробах со всех исследуемых глубин водной толщи Гданьского залива Балтийского моря. Ген 16S рРНК сульфатредукторов, относящихся к группам Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina и Desulfovibrio-Desulfomicrobium, обнаружили c помощью ПЦР как в аэробных водах на глубинах до 30 м, так и в зоне хемоклина [80 м, концентрация O2 2,21 мг/л] и придонных водах, содержащих менее 0,5 мг/л кислорода. Поскольку известно, что представители группы Desulfovibrio-Desulfomicrobium являются наиболее аэротолерантными СРБ, то их обнаружение в аэробных морских водах вполне закономерно. В настоящее время продолжается работа по ПЦР детекции других представителей СРБ, а также молекулярный филогенетический анализ СРБ, выросших в полученных накопительных культурах. В период отбора проб соленость воды в Вислинском заливе составляла 5‰, в Куршском заливе воды были практически пресными (соленость 0,1 ‰), кислород на всех станциях распространялся до дна. Известно, что в морских водоемах основным терминальным процессом разложения органического вещества на ранних этапах диагенеза в восстановленных осадках является процесс микробного восстановления сульфатов, осуществляемый сульфатредуцирующими бактериями. При исчерпании сульфатов активизируется сообщество метаногенных архей и происходит увеличение содержания метана. В этом смысле исследованные осадки мелководных заливов Калининградской области вполне соответствуют этим закономерностям. В более соленом Вислинском заливе, где содержание сульфатов в поверхностных осадках составляло 1,5-3 ммоль/дм3, концентрация метана была в целом несколько ниже, чем в более пресных осадочных отложениях Куршского залива, где максимальная концентрация сульфат-иона в поверхностном горизонте не превышала 0,8 ммоль/дм3. Более высокие концентрации метана в осадках Куршского залива согласуются с более высоким содержанием CH4 в придонных горизонтах водной толщи. Если в придонной воде станций Куршского залива разброс значений содержания метана составил 0,11-0,76 мкмоль/л, то в Вислинском заливе содержание метана варьировало от 0,016 до 0,04 мкмоль/л. Быстрое исчерпание сульфатов, которое отмечалось практически во всех исследованных осадках, указывает на высокую интенсивность микробных процессов сульфатредукции. В настоящее время проводится обработка проб для измерения скоростей сульфатредукции, метанообразования и метаноокисления, а также исследуются накопительные культуры СРБ, полученных из осадков этого района. Результатом этой работы станет сопоставление структуры и активности микробного сообщества СРБ опресненнных районов Куршского и Вислинского заливов и глубоководной зоны Гданьской впадины Балтийского моря.