Биоинформационные исследования новых механизмов регуляции процессов морфогенеза жировой ткани с участием Т-кадгеринаНИР

Bioinformatic search for novel T-cadherin-mediated regulatory mechanisms of morphogenesis in adipose tissue

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 15 мая 2023 г.-31 декабря 2023 г. этап 1
Результаты этапа: Разработаны новейшие биоинформатические методы и алгоритмы для анализа результатов клеточных и молекулярно-биологических исследований. Созданы биоинформатические базы данных с классификацией ключевых результатов на основе современных статистических методов. Разработаны и реализованы математические методы и инструменты анализа на основе современных вычислительных технологий, включая технологии Больших данных. Создана и фенотипически описана линия мышей Cdh13∆Exon3, у которых отсутствует экзон 3 в гене Cdh13. Молекулярно-биологическими и биохимическими методами исследован фенотип нокаутных мышей. Обнаружено, что общая морфология, продолжительность жизни и способность к размножению мышей Cdh13∆Exon3 находились в пределах нормы, в то время как масса тела была значительно ниже по сравнению с особями дикого типа (WT). Время бега и расстояние, пройденное мышами Cdh13∆Exon3 на беговой дорожке, было аналогично таковому у WT. Артериальное давление в состоянии покоя у мышей Cdh13∆Exon3 было несколько выше, чем у WT, однако при интенсивной физической нагрузке их систолическое артериальное давление было значительно выше. В то время как содержание адипонектина в миокарде мышей Cdh13∆Exon3 и WT было сопоставимым, уровень адипонектина в плазме был в 4,37 раза выше у мышей Cdh13∆Exon3. Помимо этого, интенсивные физические тренировки усиливали фосфорилирование AMPK в скелетных мышцах и миокарде мышей Cdh13∆Exon3 по сравнению с WT. Наши данные указывают на критически важную роль Т-кадгерина в регуляции артериального давления и выносливости у мышей, что может пролить свет на механизм патогенеза гипертонии. По результатам первой части работы по генотипированию опубликована работа в высокорейтинговом журнале. Полученные данные по иммуноцитохимическому окрашиванию клеток и жировой ткани полученной линии мышей указывают на присутствие в клетках Т-кадгерина, однако работы по сигнализации в присутствии лигандов Т-кадгерина выявили принципиальную разницу в кальциевом ответе клеток, что свидетельствует о нарушении функционального взаимодействия рецептор/лиганд в клетках полученной нокаутной линии. На следующем этапе планируется подробно исследовать особенности транкированной изоформы Т-кадгерина методом Вестерн блоттинга с различными антителами к Т-кадгерину и анализ цитоплазматической, мембранной и ядерной фракции на присутствие изоформ Т-кадгерина для ответа на вопрос о компартментализации и функциональных характеристиках исследуемого белка в клетках разных тканей мышей полученной линии. Известно, что нарушение экспрессии или функционирования Т-кадгерина, а также ряд описанных полиморфизмов человека в гене Т-кадгерина (CDH13) характерны для людей с метаболическими нарушениями, ожирением, диабетом 2 типа, что позволяет предположить важную роль Т-кадгерина в обменных процессах. Разработка моделей in vivo и in vitro с различными вариантами Т-кадгерина представляется перспективной для изучения фундаментальных механизмов возникновения метаболических нарушений и нарушений функционирования жировой ткани. Выполнено масс-спектрометрическое исследование образцов сердца и почки мышей линии Cdh13∆Exon3 и мышей дикого типа (WT). Используя метод ПААГЭ были выделены белки, которые по нашей гипотезе соответствуют различным изоформам Т-кадгерина. Метод трипсинолиза был использован для получения отдельных пептидов образцов Т-кадгерина для анализа методом времяпролетной масс-спектрометрии с ионизацией по методу МАЛДИ. В трипсинизированных образцах с использованием алгоритма Mascot нами были определены аминокислотные последовательности пептидов. Было выполнено выравнивание последовательностей идентифицированных пептидов на белковую последовательность Т-кадгерина, что позволило сделать вывод о наличии зрелых форм Т-кадгерина в образцах, полученных от животных WT. Обнаружено, что пептиды WT образцов покрывают только начальные участки белка. Выравнивание на ген Т-кадгерина позволило обнаружить, что WT образцы соответствуют зрелой форме и экспрессируют зрелую мРНК, которая содержит первый, второй, третий и десятый экзоны гена Т-кадгерина Выравнивание на ген Т-кадгерина пептидов полученных при процессинге нокаутных образцов (Cdh13∆Exon3) показало, что мРНК не переходит в зрелую форму поскольку третий экзон отсутствует, и пептидная последовательность покрывает исключительно первый и второй экзоны. Полученные экспериментальные результаты указывают на возможную экспрессию Т-кадгерина в нокаутных организмах Cdh13∆Exon3, однако идентификация пептидов затруднена в виду низкого содержания фрагментов данного белка и, по видимому, его активным протеолизом в протеасомах по причине неполной последовательности. Функциональные особенности изоформы Т-кадгерина изучены цитологическими методами: с целью выяснить, влияет ли модификация гена Т-кадгерина на его экспрессию и локализацию в различных клеточных компартментах проведен анализ локализации Т-кадгерина в различных субклеточных фракциях разного типа клеток, выделенных из мышей дикого типа (WT) и мышей линии Cdh13∆Exon3 методом вестерн блоттинга. В ходе выполнения работы нам удалось обнаружить изоформу Т-кадгерина с молекулярной массой около 80-85 кДа. Используя кальциевый сенсор - флуоресцентный зонд Fura-2 и прижизненную флуоресцентную микроскопию на одиночных клетках было продемонстрировано достоверное снижение амплитуды Са2+ответа при добавлении лиганда Т-кадгерина - ЛНП (70µg/ml) к фибробластам выделенным из тканей мышей линии Cdh13∆Exon3 по сравнению с клетками мышей дикого типа. Структурные механизмы взаимодействия Т-кадгерина с ЛНП и высокомолекулярным адипонектином на данный момент плохо изучены. Полученная линия мышей Cdh13∆Exon3, будет служить удобной моделью для изучения свойств Т-кадгерина и его изоформ in vivo, а также позволят провести аналогии с известными полиморфизмами Т-кадгерина у человека, что послужит основой для диагностики и лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы и метаболических нарушений. Проанализирована способность МСК, выделенных из жировой ткани мышей линии Cdh13∆Exon3 к спонтанной адипогенной дифференцировке и адипогенной дифференцировке в условиях индукции коктейлем факторов (0.5 мM изобутиметилксантина, 1 μM дексаметазона, 5 μg/мл инсулина). Эффективность адипоцитарной дифференцировки оценивали по накоплению липидных капель в клетках с помощью гистологического окрашивания Oil Red O с последующей статистической обработкой полученных результатов. Обнаружено, что МСК, выделенные из подкожной жировой ткани мышей линии Cdh13∆Exon3 накапливают жировые капли при культивировании в плотном монослое, т.е. способны к спонтанной адипогенной дифференцировке. При использовании коктейля факторов, индуцирующих адипогенную дифференцировку, клеток с большими жировыми каплями становится значительно больше по сравнению с популяцией МСК, выделенных у животных дикого типа. Для проверки гипотезы о существовании петли регуляции по принципу отрицательной обратной связи способность МСК, выделенных из контрольных мышей и экспрессирующих транкированный Т-кадгерин, к адипогенной дифференцировке исследована в присутствии лигандов Т-кадгерина - ЛНП (70µg/ml) и HMW адипонектина (25µg/ml) в течение 5 дней. Проведенное исследование показало, что высокомолекулярный адипонектин не изменяет характер адипогенной дифференцировки МСК, выделенных из мышей линии Cdh13∆Exon3(Т-/-), по сравнению с такими же клетками, выделенными из контрольных мышей(с57) и экспрессирующими Т-кадгерин. В тоже время ЛНП подавляют адипогенную дифференцировку в контрольных клетках, что говорит об участии Т-кадгерина в адипогенезе. Любопытно, что в МСК, выделенных из мышей линии Cdh13∆Exon3(Т-/-) процент дифференцированных клеток также несколько снижен при действии LDL. Вероятно, структурные изменения Т-кадгерина у нокаутных животных все же позволяют функциональное взаимодействие Т-кадгерина с одним из лигандов. Проведен детальный биоинформационный анализ изоформы Т-кадгерина у мышей и поиск аналогичной изоформы у человека с акцентом на предсказание молекулярных, биохимических и физиологических особенностей такого варианта Т-кадгерина. В базах данных были найдены последовательности Т-кадгерина мыши и человека. После определения рамок считывания была смоделирована транкированная форма Т-кадгерина для человека. Поиск изоформы Т-кадгерина человека, ортологичной транкированной изоформе мыши проводили поиском нуклеотидной последовательности 3 экзона Т-кадгерина мыши и обнаружили, что последовательности, ортологичные последовательности 3 экзона Т-кадгерина мыши, у человека на всей своей длине полностью отсутствовала в 4 изоформе. Схожесть составила 68% для всей длины последовательностей и 95% для общего участка. Общий участок был получен как субвыравнивание из первоначального выравнивания MUSCLE транкированной изоформы мыши и 4 изоформы человека со стандартными параметрами. Для предсказания фолдинга транкированной изоформы Т-кадгерина мыши использовали ColabFold, имплементацию нейросети для фолдинга AlphaFold2 с использованием MMseqs2 (Many-against-Many sequence searching) с релаксацией наилучшей модели по Local Distance Difference Test score (pLDDT) из 5 предсказанных при помощи AMBER (Assisted Model Building with Energy Refinement). Из 5 предиктированных структур для транкрированной изоформы была выбрана структура с наивысшей суммарной pLDDT (per-residue estimate of confidence). Также была получена структура нетранкированной изоформы Т-кадгерина (NP_062681.2) с такими же параметрами, как и транкированная изоформа. Из 5 предиктированных структур для нетранкированной изоформы была выбрана структура с наивысшей суммарной pLDDT (per-residue estimate of confidence), необходимость в чем возникает в виду вышеописанной стохастической природы модели, и что означает, что полученная модель была наиболее приближенной к целевой. В нетранкированной форме присутствует ранее предсказанный при помощи InterPro прокадгериновый домен (выделен пунктиром), отсутствующий в транкированной. Прокадгериновый домен является вторым в структуре Т-кадгерина (относительно первой N-концевой альфа-спирали) и является внеклеточным доменом вместе с 5 кадгериновыми доменами, тогда как по результатам InterPro Phobius трансмембранный и внутриклеточный домены располагаются на противоположном С-конце Т-кадгерина. С помощью разработанного онлайн-сервиса pocketZebra были определены и получены данные о карманах на поверхности пространственной структуры Т-кадгерина. Суть алгоритма заключается в предварительном поиске гомологичных последовательностей, которые затем используются для определения консервативных участков, формирующих сайты связывания. Найденные карманы связывания располагаются в районах спиралей и содержат аминокислотные остатки, ответственные за связывание ионов кальция и взаимодействие с другими макромолекулами. Поскольку 3 домен располагается вне основной последовательности доменов Т-кадгерина и является гомологичным по последовательности остальным доменам, можно сделать вывод о том, что его отсутствие в транкированной форме может влиять н его функциональные свойства. При помощи веб-сервера Atomic Charge Calculator II подсчитали поверхностный заряд полученной структуры. Анализ поверхностных зарядов транкрированной изоформы показал сохранение природы зарядов в области кадгериновых доменов с их перераспределением в участке отсутствия 3 экзона, что позволяет предположить сохранение функционирования кадгериновых доменов.
2 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Этап 2
Результаты этапа: 1. Проведен биоинформационный анализ имеющихся гомологичных последовательностей Т-кадгерина и построено филогенетическое дерево для Т-кадгерина человека и мыши. Для реализации запланированных исследований были разработаны новые биоинформационные подходы и алгоритмы. В ходе выполнения проекта были созданы мыши с транкированным Т-кадгерином в результате скрещивания мышей CDH13 loxP/loxP (с двумя сайтами loxP, фланкирующими экзон 3 гена CDH13) с мышами, конститутивно экспрессирующими Cre-рекомбиназу. Потомство F2 полученных мышей генотипировали и обнаружили транкированную форму Т-кадгерина, у которой отсутствовал 3 домен (Cdh13ΔExon3) (doi: 10.3390/ijms241814204). В базах данных NCBI суммарно были обнаружены последовательности 12 изоформ Т-кадгерина человека и последовательности 3 изоформ мыши. Поиск аналогичной изоформы Т-кадгерина человека, ортологичной транкированной изоформе мыши (Cdh13ΔExon3) обнаружил отсутствие 3 экзона в одной из изоформ человека (изоформа 4). Было проведено выравнивание последовательностей Т-кадгерина человека и мыши с последующим построением филогенетического дерева. Для этого было проведено сравнение двух геномов на основе выравнивания по сборке на платформе NCBI с помощью инструмента Comparative Genome Viewer. С целью получения аминокислотной последовательности транкированного Т-кадгерина мыши для последующего построения филогенетического дерева Т-кадгеринов человека и мыши с помощью Unipro UGENE были выравнены последовательность 3 экзона и последовательности мРНК гена CDH13 человека и мыши. Используя Unipro UGENE, были идентифицированы открытые рамки считывания при помощи функции “Поиск открытых рамок считывания (ORF)”. Была идентифицирована аминокислотная последовательность 3 экзона Т-кадгерина мыши путем анализа нуклеотидной последовательности 3 экзона Т-кадгерина мыши. С целью обнаружения у человека изоформ Т-кадгерина, ортологичных транкированной изоформе Т-кадгерина мыши, было проведено множественное выравнивание аминокислотных последовательностей Т-кадгерина человека и мыши в Unipro UGENE при помощи MUSCLE. Данные инструменты были модифицированы и адаптированы для анализа модифицированных предсказанных последовательностей впервые, поскольку обычно они применяются для анализа известных последовательностей. Известны три метода построения филогенетических деревьев, основанных на разных алгоритмах: Neighbor-joining из набора инструментов PHYLIP, Bayesian inference из программы MrBayes и maximum likelihood из PhyML. Мы протекстировали три метода и выбрали Bayesian inference (Байесовский вывод) – метод, основанный на построении множества возможных филогенетических деревьев и предположении о предварительном распределении вероятностей каждого дерева. Построенное филогенетическое дерево позволило сделать вывод об эволюционных отношениях между последовательностями разных изоформ гена CDH13 у человека и мыши. Эволюционное расстояние для корня дерева составляло 0.027, что свидетельствует о существовании одного общего предка с соответствующим уровнем сходства для всех изоформ. Анализ кластеров (ветви дерева объединяются в кластеры) и их последовательностей показал, что последовательности Homo sapiens (человека) и Mus musculus (мыши) формируют смешанные кластеры, что указывает на высокую степень гомологии между изоформами CDH13 у этих видов. Длины ветвей дерева, отражают эволюционные расстояния. Чем короче ветвь, тем более схожи соответствующие последовательности. Ветви с большими отрицательными значениями указывают на большие различия между последовательностями. Гомология и изоформы: изоформы CDH13 разделены на кластеры, что может отражать функциональные различия, связанные с альтернативным сплайсингом. Изоформы мыши и человека группируются вместе в некоторых случаях, что указывает на сохранение эволюционного консерватизма. Кластер 1: Изоформы: NP_001207418.1 (Homo sapiens), XP_011512106.1 (Homo sapiens), XP_054235331.1 (Homo sapiens). Эволюционное расстояние: от -0.026 до -0.02. Кластер характеризуется высокими показателями сходства между изоформами человека, что говорит о близком генетическом родстве и недавнем эволюционном разделении. Кластер 2: Изоформы: NP_062681.2 (Truncated Exon 3 Deletion Protein), XP_036009632.1 (Mus musculus), XP_006530691.1 (Mus musculus). Эволюционное расстояние: -0.014 для первых двух изоформ. Кластер включает изоформы человека (NP_062681.2) и мыши. Данные указывают на значительное различие в эволюции между данными двумя видами по этим изоформам. Кластер 3: Изоформы: NP_001207419.1, XP_054235333.1, NP_001207420.1 и несколько других изоформ человека. Эволюционное расстояние: от -0.06 до -0.267. Эти изоформы имеют значительное эволюционное расстояние, что говорит о большем разнообразии и, возможно, о различиях в функциях. Анализ изоформы NP_062681.2. Отношение к корню: эволюционное расстояние 0.014, что свидетельствует о том, что данная изоформа сохраняет значительное сходство с изоформами в верхнем кластере, но при этом является самостоятельной формой с отличительными характеристиками. Отношение к кластерам: NP_062681.2 находится между кластером изоформ человека и отдельными изоформами мыши, что подтверждает предположение о том, что данный белок имеет уникальные функции и механизмы, отличающие его от других изоформ в пределах одного вида и между видами. Таким образом, филогенетическое дерево изоформ Т-кадгерина демонстрирует разнообразие и эволюционные отношения между различными изоформами. Изучение эволюционных расстояний подтвердило наличие отдельных кластеров, каждый из которых имеет свои уникальные характеристики и варьирующие уровни сходства. Изоформа NP_062681.2 представляет интерес для дальнейших исследований, так как показывает как близость, так и различия, как в пределах одного вида, так и между видами. Эволюционная консервативность и высокая степень гомологии между разными изоформами гена CDH13 у человека и мыши, которая была выявлена в ходе построения филогенетического дерева, позволяет высказать гипотезу о разной эффективности взаимодействия Т-кадгерина с лигандами (липопротеиды низкой плотности (ЛНП) и высокомолекулярный адипонектин (HMW адипонектин) с последующей активацией внутриклеточной сигнализации, что может иметь важное физиологическое значение. 2. Продолжено создание коллекции образцов мезенхимальных стволовых/стромальных клеток (МСК) из подкожной жировой ткани человека, выделенных и культивированных в стандартных условиях или в условиях индукции дифференцировки в адипоцитарном направлении. Создание коллекции образцов МСК из подкожной жировой ткани человека было продолжено в 2024 году, добавилось 15 новых образцов. 3. Выполнен транскриптомный анализ (scRNAseq) МСК, выделенных из подкожной жировой ткани человека (2 доноров) до и после индукции дифференцировки в адипогенном направлении. Проведен широкомасштабный биоинформатический анализ данных секвенирования. Подготовлены библиотеки транскриптов клеток МСК до и после их дифференцировки проведена на платформе «10x Chromium». Секвенирование одиночных клеток выполненона платформе IlluminaNovaSet 6000. Проведен биоинформационный анализ полученных данных. Для экспериментов использовали МСК 2-3 пассажей, которые культивировали в стандартной среде (контроль) или в среде для индукции адипогенной дифференцировке в течение 4 дней. Процессирование клеток и подготовку образцов для scRNA-seq проводили в соответствии с протоколом 10× Genomics single cell protocol (10× Genomics, Pleasanton, CA, USA). Для подготовки библиотек scRNA-seq использовали Chromium Next GEM Single cell 3’ Reagent kit v3.1 (10× Genomics, Pleasanton, CA, USA). Для процессирования прочтений использовали программу CellRanger v8.0, для анализа полученных данных использовался R-пакет Seurat 5.1.0. Аннотацию типов клеток выполняли как вручную, присваивая тип клеток каждому кластеру, так и с помощью инструмента автоматической идентификации типов клеток — R-пакета SingleR. Полученные данные scRNA-seq свидетельствовали о том, что при адипогенной индукции экспрессия мРНК Т-кадгерина снижалась почти в 5 раз по сравнению с контролем, что было далее подтверждено методом ОТ-кПЦР. Однако, в гетерогенной популяции МСК как в контроле, так и при индукции адипогенеза присутствовала субпопуляция клеток, в которой экспрессия Т-кадгерина сохранялась (данные иммунофлуоресцентного анализа, ОТ-кПЦР и тепловых карт данных scRNA-seq). Мы интегрировали и кластеризовали данные scRNA-seq, полученные от контрольных МСК и МСК после 4-дневной индукции адипогенной дифференцировки, и обнаружили, что клетки с высоким уровнем CDH13 преимущественно располагались в кластере 3, преимущественно в контрольном недифференцированном образце. Клетки с высоким уровнем Т-кадгерина также экспрессировали маркеры стволовых/прогениторных клеток жировой ткани DPP4, Notch1, рецептор Notch3, NANOG, SPN, SOX2, PRMT8 ключевые маркеры МСК (CD90, PDGFR), члены семейства Wnt, LDLR, фактор регуляции адипогенеза, N-кадгерин, нейропилин 2, IGFBP4 и гены, участвующие в биогенезе экзосом (CD9, CD63, CAV1) (всего 485 генов). Построение сплит-violin графиков подтвердило, что самая высокая экспрессия CDH13 наблюдается в кластере 3 контрольного образца, для которого также характерна экспрессия основного маркера ранних прогениторных клеток, обеспечивающих обновление адипоцитов жировой ткани, - гена DPP4 (10.1126/science.aav2501). Эти результаты были также подтверждены с использованием инструмента визуализации Loupe Browser (v. 6.4.1) из 10x Genomics. Мы создали тепловые карты с помощью output .cloupe file из пайплайна CellRanger с последующим применением cellranger aggr для получения файла .aggr образцов контрольных и клеток после 4-дневной адипогенной индукции. Было получено два набора данных: клетки с высокой экспрессией Т-кадгерина и низкой экспрессией для образцов контрольного и дифференцированного образцов. Для каждого набора данных были созданы тепловые карты (Heatmap) для генов стволовости с применением функцию Filters и Assign Selection. Затем был выбран инструмент HeatMap. Проведенный анализ позволил предположить существование функциональной связи между уровнем экспрессии Т-кадгерина и маркерами стволовости, а именно, Т-кадгерин может играть важную роль в поддержании недифференцированного фенотипа МСК и служить лимитирующим фактором адипогенной дифференцировки. Для дальнейшего выявления возможной роли Т-кадгерина в адипогенной дифференцировке мы провели генное профилирование и анализ траектории развития МСК человека с использованием псевдовременных траекторий на основе scRNA-seq данных. С помощью обработки Slingshot мы провели кластеризацию данных в низкоразмерном пространстве, затем на основе кластеров построили минимальное остовное дерево для определения направления линий. Используя вычисление ортогональной проекции на кривую для каждой клетки, были получены значения псевдовремени. Мы определили 3 направления траектории транскрипционных состояний для большинства клеток в недифференцированном образце, сгруппированном в кластере 0: - Клетки 0 кластера (фибробласты и гладкомышечные клетки, принадлежащие контрольному образцу) напрямую переходили в кластер 1 (клетки дифференцированного образца, соответствующие преадипоцитам и экспрессирующих гены ранней и поздней адипогенной дифференцировки - CEBP, PPARG, CD36, перилипин 1/4, ADIPOQ. - Клетки 0 кластера напрямую переходили в кластер 2, у которого генный профиль соответствовал митотическим клеткам, принадлежащие контрольному образцу. - Клетки 0 кластера переходили через 3 кластер, где клетки экспрессировали гены CDH13 и DPP4, основной маркер ранних прогениторных клеток жировой ткани, и впоследствии перераспределились в 4 кластер, экспрессирующий CD36 (ранний маркер предшественников адипоцитов с высокой степенью способности к дифференцировке в адипоциты (https://doi.org/10.1002/stem.2635)), и нестин (маркер стволовых клеток и предшественников нейральных и мезенхимальных линий (10.1007/s00018-018-2794-z)). На основе сгенерированного дерева транскрипционных состояний мы определили возможный сценарий, по которому клетки из кластера 3, экспрессирующие Т-кадгерин, осуществляют переход в другие кластеры. Активно пролиферирующие клетки 0 кластера могут перераспределяться в 3 кластер ранних прогениторных клеток, экспрессирующих CDH13 и DPP4. Далее клетки 3 кластера могут переходить в 4 кластер, где клетки экспрессируют маркеры плюрипотентности и гены стволовости, такие как NESTIN, CD36 KIT, SCA-1, PDGFR, SOX4, NOTCH3 и т. д. Поскольку переход клеток из 0 кластера (активно делящиеся клетки) в 1 кластер (преадипоциты и комитированные адипоциты) происходит без включения 3 кластера, был сделан вывод о том, что клетки 3 кластера с высокой экспрессией CDH13 и DPP4 занимают особое положение среди других кластеров и не участвуют в адипогенной дифференцировке, а скорее всего представляют собой отдельную субпопуляцию дормантных стволовх/прогениторных клеток с регуляторными свойствами. 4. Проведен поиск сайтов связывания и анализ поверхности белковых молекул. Продолжен анализ генотипа мышей с транкированной формой Т-кадгерина. Получена последовательность Т-кадгерина мыши и проанализировано влияние наличия и отсутствия 3 экзона на биохимические и физиологические свойства Т-кадгерина. В соответствии с разрабатываемой гипотезой наличие или отсутствие этого фрагмента может определять фолдинг и соответствующие функциональные свойства белка Т-кадгерина. С целью изучения транкированной изоформы Т-кадгерина у мышей и поиска аналогичной изоформы у человека были использованы последовательности мРНК и аминокислотные последовательности Т-кадгерина мыши и человека из базы данных NCBI и проведен биоинформационный анализ. В NCBI Comparative Genome Viewer было проведено сравнение полноразмерных нуклеотидных последовательностей гена Т-кадгерина мыши и человека. Результат сравнения показал высокую степень сходства и наличие синтенных блоков, что говорит о том, что такие последовательности ортологичны. Подтвержденная ортологичность позволила на последующих этапах сравнивать гены Т-кадгерина мыши человека между собой. С целью поиска у человека изоформы Т-кадгерина, ортологичной транкированной изоформе Т-кадгерина мыши (Cdh13ΔExon3) в базе данных NCBI была найдена нуклеотидная последовательность 3 экзона гена CDH13 мыши: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/gdv/browser/gene/?id=12554 и скачана в виде FASTA последовательности. Далее скачанная последовательность 3 экзона и последовательности мРНК гена CDH13 человека и мыши были выровнены в ПО Unipro UGENE (doi:10.1093/bioinformatics/bts09; doi:10.7717/peerj.644; doi:10.1093/bioinformatics/bty901). Множественное выравнивание было проведено при помощи MUSCLE с использованием стандартных для Unipro UGENE параметров. Поиск изоформы Т-кадгерина человека, ортологичной транкированной изоформе мыши (Cdh13ΔExon3) проводили поиском нуклеотидной последовательности 3 экзона Т-кадгерина мыши и обнаружили, что последовательность, ортологичная последовательности 3 экзона Т-кадгерина мыши, у человека на всей своей длине полностью отсутствовали в изоформе 4. Таким образом, транкированной изоформе мыши (Cdh13ΔExon3) соответствовала изоформа 4 у человека. В результате была определена аминокислотная последовательность участка, соответствующего 3 экзону Т-кадгерина мыши; используя эту последовательность и полную аминокислотную последовательность белка NP_062681.2 была получена и проанализирована полная аминокислотная последовательность транкированного Т-кадгерина мыши в формате FASTA. Для предсказания функции аминокислотной последовательности транкированной формы Т-кадгерина мыши (Cdh13ΔExon3) и функциональные различия от полноразмерной формы Т-кадгерина, мы провели доменный и сигнальный анализ, а именно, идентификацию и классификации белковых доменов, семейств и функциональных сайтов аминокислотных последовательностей. Сравнительный анализ выявил наличие прокадгеринового домена в полноразмерной форме Т-кадгерина, предсказанного при помощи InterPro, который отсутствует в транкированной форме (Cdh13ΔExon3). Прокадгериновый домен является вторым в структуре Т-кадгерина (относительно первой N-концевой альфа-спирали) и является внеклеточным доменом вместе с 5 кадгериновыми доменами, тогда как по результатам InterPro Phobius трансмембранный и внутриклеточный домены располагаются на противоположном С-конце Т-кадгерина. Согласно данным об участии продомена в связывании Т-кадгерина с его лигандами – липопротеидами низкой плотности (ЛНП) и адипонектином, именно продомен значительно усиливает аффинность этих взаимодействий (doi: 10.1172/JCI129193; doi: 10.1074/jbc.M117.780734). Таким образом, биоинформационные исследования предсказали различное сродство к лигандам у полноразмерной и транкированной форм Т-кадгерина, что далее было подтверждено нами в биохимических, молекулярно-биологических и цитологических исследованиях. 5. Продолжены работ по субклеточному фракционированию и анализ цитоплазматической, мембранной и ядерной фракции на присутствие полноразмерной формы и изоформы Т-кадгерина, полученных от контрольных мышей и мышей с транкированной формой Т-кадгерина, а также проведена иммунопреципитация Т-кадгерина для получения препарата и продолжения начатых в 2023 году исследований методом масс-спектрометрии с целью определения точной аминокислотной последовательности этого белка. Проведено субклеточное фракционирование и анализ цитоплазматической, мембранной и ядерной фракции на присутствие полноразмерной формы и изоформы Т-кадгерина в клетках, полученных от контрольных мышей и мышей с транкированной формой Т-кадгерина, результаты опубликованы (https://doi.org/10.3390/ijms241814204). Известно, что большинство белков млекопитающих существуют в различных изоформах, образующихся в результате альтернативного сплайсинга пре-мРНК. Данные об изоформах T-кадгерина практически отсутствуют, доступная информация существует только в виде результатов высокопроизводительного скрининга человеческого транскриптома. Мы впервые экспериментально исследовали и подтвердили существование укороченной изоформы Т-кадгерина в клеточных линиях и субклонировали транкированный Т-кадгерин в системе экспрессии клеток млекопитающих с целью их дальнейшей биохимической характеристики. Мы показали, что для экспрессии транкированной изоформы Т-кадгерина с вырезанным 3 экзоном существует дополнительный механизм трансляции с пропуском конвенционного стартового кодона Т-кадгерина и альтернативной инициацией трансляции. В проведенном исследовании биохимическими методами мы подтвердили теоретически предсказанную биоинформатикой реальную экспрессию укороченной изоформы Т-кадгерина с удаленным 3 экзоном у мышей Cdh13∆Exon3, а также выявили существование изоформы Т-кадгерина существующих линейных клетках и первичных в первичных культурах клеток человека. На основе данных банка генов для альтернативно сплайсированных мРНК, содержащих информацию об укороченных изоформах Т-кадгерина, мы создали праймеры, специфичные для изоформ, в которых имеются делеции 3-го или 4-го экзонов (изоформа человека № 4 (NM 001220490.2) и № 3 (NM 001220489.2), соответственно) и провели ПЦР. Мы использовали линейные клетки почек зеленой мартышки (BSC-L1 и COS7) и линию глиобластомы человека Ln229, а также клеточную линию HeLa, в качестве отрицательного контроля для экспрессии Т-кадгерина. Клетки COS7, BSC-1 и Ln229 экспрессировали полноразмерный вариант Т-кадгерина (изоформа 1). Изоформа 4 была идентифицирована в клетках Ln229. Мы также выделили тотальную мРНК из первичной культуры МСК жировой ткани человека и гладкомышечные клетки сосудов (ГМК). Как в МСК, так и в ГМК у некоторых доноров была обнаружена изоформа 4, присутствующая в минорных количествах по сравнению с изоформой 1. Используя комбинацию коммерчески доступных антител к N-концу и C-концу белка T-кадгерина, а также набор созданных нами плазмидных конструкций для экспрессии различных вариантов транкированного Т-кадгерина с GFP меткой, мы подтвердили данные ПЦР по экспрессии соответствующих изоформ Т-кадгерина на клеточных моделях. Учитывая сложность молекулярного состава гликозилированных белков и высокую степень гликолизилирования Т-кадгерина, нам не удалось точно вычислить молекулярный вес белка, синтезирующегося с изоформы 4. В классической ситуации при делеции 3-го экзона и образующемся разрыве рамки считывания с границей между вторым и четвертым экзонами в гене Т-кадгерина должен был бы формироваться стоп-кодон и терминация трансляции мРНК без синтеза белка. Однако известно существование механизма инициации трансляции с утечкой сканирования (leaky scanning translation mechanism) (doi.org/10.1093/nar/gkv1218). Мы предположили, что комплекс инициации рибосомы может пропускать обычный стоп-кодон ATG (позиция 244) в гене CDH13 и переходить к стартовому кодону формирующемуся в изоформе 4 (позиция 1006) в мРНК мышей Cdh13∆Exon3. С помощью биоинформационного подхода мы проанализировали последовательность Козака конвенционного стартового кодона мРНК Т-кадгерина мыши и обнаружили, что пропуск стоп-кодон ATG может происходить почти в четверти случаев при трансляции, что было нами далее подтверждено методами ОТ-ПЦР и Western blotting. Таким образом, в ходе биоинформационного исследования мы сначала предсказали существование изоформ Т-кадгерина, а затем молекулярно-биологическими, биохимическими и цитологическими методами подтвердили экспрессию изоформы 4 Т-кадгерина в первичных культурах клеток человека, а также в линейных клетках млекопитающих. Эти данные получены нами впервые. Ранее нами была выдвинута гипотеза, согласно которой Т-кадгерин, не обладая трансмембранным и внутриклеточным доменами и будучи закрепленным на мембране посредством гликозилфосфатидилинозитольного (ГФИ) якоря, выполняет функцию сигнальной молекулы. Благодаря латеральным взаимодействиям, он может модулировать сигнальные пути, активируемые такими рецепторами, как AdipoR1, AdipoR2, LDLR и инсулиновый рецептор, либо формировать с ними общий комплекс, выступая в роли их ко-рецептора (https://doi.org/10.1016/j.ejcb.2021.151183). Данные по ко-иммунопреципитации подтверждают то, что Т-кадгерин может формировать комплексы с AdipoR1, AdipoR2 и LDLR, а добавление лигандов (адипонектина и ЛНП) разобщает эти латеральные взаимодействия. Физиологическое значение этого взаимодействия планируется выяснить с использованием биоинформационного анализа, а также биохимическими, цитологическими и молекулярно-биологическими методами в 2025 году. 6. Для верификации данных биоинформационного анализа и роли Т-кадгерина в регуляции процессов дифференцировки МСК в адипогенном направлении, МСК человека с разным уровнем экспрессии Т-кадгерина были индуцированы к дифференцировке в адипогенном направлении. Динамика дифференцировки для клеток с разным уровнем экспрессии Т-кадгерина прослежена прижизненно. Способность к адипоцитарной дифференцировке была оценена по накоплению липидных капель в клетках (окрашивание Oil Red O, или Nile Red) с последующей статистической обработкой результатов, а также по экспрессии маркеров преадипоцитов и зрелых адипоцитов методом RT-PCR (гены DPP4, PPAR, C/EBP, C/EBP, CD142, CLEC11A, LEP, ADIPOQ, PLIN1, FoxO1). МСК человека трансдуцировали лентивирусными конструкциями для гиперэкспрессии Т-кадгерина (pLJM-Tcad-mKate) или контрольным вирусом (pRPV-contr с флуоресцентной меткой mKate) (Eurogene, Россия). МСК культивировали в стандартной среде или в среде для индукции адипогенной дифференцировки. Судьбу каждой клетки после вирусной трансдукции отслеживали прижизненно по флуоресценции в красном канале (mKate в качестве метки для трансдуцированных клеток); нетрансдуцированные клетки в той же лунке служили внутренним контролем. Прижизненный мониторинг клеток в реальном времени проводили в течение 10 дней с использованием микроскопа NIS-Elements (Nikon) и программного обеспечения ImageJ (NIH, Bethesda, MD, США). Для анализа адипоцитарной дифференцировки клетки окрашивали Nile Red и подсчитывали процент окрашенных клеток в 10 случайных полях зрения на лунку с использованием микроскопа Nikon Eclipse Ti, с цифровой EMCCD-камерой Andor iXon 897 (Andor Technology, Belfast, United Kingdom). Отдельные клетки и их дифференцировочную судьбу анализировали на основе флуоресценции mKate (в лунках с контрольным вирусом и вирусом для гиперэкспрессии Т-кадгерина), накопления липидных капель и их визуализацией с помощью Nile Red и окрашивания антителами против T-кадгерина по окончании эксперимента. Статистические различия между клетками оценивали с использованием Fisher's exact test или Pearson's chi-squared test (p < 0,05). Полученные результаты свидетельствовали о том, что МСК, гиперэкспрессирующие Т-кадгерин, сохраняли недифференцированное состояние и не участвовали в накоплении липидных капель, что было подтверждено индивидуальным отслеживанием судьбы клеток в сочетании с окрашиванием Nile Red. Экспрессию маркеров стволовых/прогениторных клеток жировой ткани, преадипоцитов и зрелых адипоцитов (DPP4, PPARg, C/EBPa, C/EBPb, CD142, CLEC11A, LEP, ADIPOQ, PLIN1, FoxO1) оценивали, используя scRNAseq с последующей биоинформационной обработкой. Анализ экспрессии инсулинового рецептора (IR) на плазматической мембране МСК и Т-кадгерина методами иммунофлуоресцентного окрашивания, Western blotting и проточной цитометрии показал, что Т-кадгерин экспрессируется в субпопуляции МСК, не несущей на поверхности IR. Подавление экспрессии Т-кадгерина количество клеток IR на поверхности увеличивалось с 2% до 6% (в зависимости от донора клеток) до 10%. Был сделан вывод о том, что экспрессия Т-кадгерина может влиять на экспонирование IR на плазматической мембране МСК, влияя на чувствительность клеток к инсулину и индуцирующим адипогенную дифференцировку воздействиям. 7. Для получения МСК с разным уровнем экспрессии Т-кадгерина созданы лентивирусные конструкции, содержащие кДНК Т-кадгерина человека, и контрольный лентивирус. Для визуализации трансдукции в контрольный и в экспериментальный вирусы закодирована последовательность флуоресцентного белка GFP. Подобраны оптимальные условия трансдукции и селекции МСК для получения клеток с максимальной экспрессией Т-кадгерина. Выявлено влияние вирусной трансдукции для гиперэкспрессии Т-кадгерина на процессы адгезии и пролиферации, а также на способность МСК дифференцироваться в адипогенном направлении. В нашем коллективе были созданы собственные лентивирусные конструкции для гиперэкспрессии Т-кадгерина (LV-LeGO-hTcad-IRES-eGFP) наряду с контрольным вирусом (LV-LeGO-eGFP); оба конструкта содержали GFP. Клетки МСК трансдуцировали лентивирусами, сортировали на основе флуоресценции GFP, гиперэкспрессию Т-кадгерина подтверждели с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания антителами против Т-кадгерина, ОТ-ПЦР и Western blotting. Влияние экспрессии Т-кадгерина на адгезию и пролиферацию клеток изучали с использованием системы xCELLigence для анализа в реальном времени. Клетки, гиперэкспрессирующие Т-кадгерин, делились значительно медленнее, чем клетки после трансдукции контрольным вирусом или нетрансдуцированные клетки от того же донора, что свидетельствуют о том, что гиперэкспрессия Т-кадгерина снижает пролиферативный потенциал МСК. Доноры МСК могут иметь генетические и метаболические индивидуальные особенности, которые влияют на характеристики получаемой первичной культуры клеток МСК человека и результаты экспериментов. В этой связи, способность МСК к адипогенной дифференцировке была исследована с использованием подкожной жировой ткани Cdh13∆Exon3 мышей и контрольной к ним линии мышей C57Bl6. Способность к адипогенной дифференцировке оценивали по количественному окрашиванию красителями Nile Red и Oil Red O в культурах МСК с помощью флуоресцентной и фазово-контрастной микроскопии, а также по содержанию Oil Red O в элюатах с использованием спектрофотометрии после нормирования по содержанию белка образцах. Было обнаружено, что МСК из Cdh13∆Exon3 мышей склонны к спонтанной адипогенной дифференцировке даже в отсутствии индукторов адипогенеза, а при индукции коктейлем факторов, содержащим инсулин, более активно накапливают липидные капли более крупного размера. Для автоматического подсчета соотношения дифференцированных адипоцитов к общему числу клеток мы создали алгоритм с использованием методов искусственного интеллекта и глубокого обучения из модуля NIS.ai программного пакета NIS Elements (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/software/nis-elements/nis-ai-1). Нейронная сеть была дообучена с использованием функции Train Segment.ai (2000 epochs and Dynamic Range Adaptation option). Для подсчета общего количества клеток была применена функция Object Count из модуля General Analysis 3 (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/software/nis-elements/nis-ai-1, GA3: аналитический модуль с возможностями AI) в NIS Elements 5.42.02. Для подсчета клеток с липидными каплями капли использовали функцию Having из модуля General Analysis 3 и Object Count из модуля General Analysis 3. Итоговое соотношение рассчитывали путем деления числа клеток с липидными каплями на общее количество клеток для каждого типа клеток. Для доказательства роли Т-кадгерина в регуляции адипогенеза МСК от контрольных и Cdh13∆Exon3 мышей были трансдуцированы созданными нами лентивирусными конструкциями (LV-LeGO-eGFP и LV-LeGO-hTcad-IRES-eGFP). Клетки сначала анализировали прижизненно на предмет флуоресценции GFP, а затем фиксировали и окрашивали Oil Red O и DAPI. Анализ данных проводили с использованием методов искусственного интеллекта как описано выше. Биоинформационный анализ показал, что у МСК, полученных от Cdh13∆Exon3 мышей, после трансдукции вирусом для гиперэкспрессии Т-кадгерина резко падает способность к адипогенная дифференцировке, чего не наблюдается в случае трансдукции этих клеток контрольным вирусом. Эти данные подтверждают результаты, представленные выше о том, что Т-кадгерин является важнейшим фактором, удерживающим МСК в недифференцированном стволовом состоянии. Этот вывод также подтверждают результаты анализа экспрессии ранних (PPARγ, C/EBPβ) и поздних маркеров (адипонектин (AdipoQ), leptin, perilipin) адипогенной дифференцировки в зависимости от экспрессии Т-кадгерина в МСК, полученные методом Western blotting и ELISA. Анализ экспрессии этих маркеров в динамике по дням в лизатах клеток МСК, полученных от контрольных и Cdh13∆Exon3 мышей, показал значительное увеличение экспрессии поздних маркеров адипогенеза (адипонектин, лептин, перилипин) как на уровне содержания внутриклеточного белка, так и на уровне секреции белка в среду культивирования, по сравнению с МСК от контрольных мышей. При этом уровень ранних маркеров адипогенеза (PPARγ и C/EBPβ) в контрольных МСК ожидаемо поднимался в первые дни после добавления факторов индукции адипогенеза, а МСК из Cdh13∆Exon3 мышей на факторы не реагировали, поскольку их уровень экспрессии и так был достаточно высок. Полученные данные подтверждают результаты, представленные выше о том, что в отсутствии Т-кадгерина МСК становятся коммитированными адипоцитами и спонтанно дифференцируются в адипоцитарном направлении.
3 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. этап 3
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".