ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Молекулярный кислород – необходимый для жизни компонент, он участвует в разнообразных биохимических реакциях во всех органах и тканях. Его недостаток (гипоксия) или избыток (гипероксия) при длительном воздействии приводит к развитию патологических процессов. Тем не менее, механизм участия молекулярного кислорода во многих ферментативных реакциях исследован недостаточно. Не является исключением и фермент простагландин Н синтаза, который катализирует реакцию с участием двух молекул кислорода. Фермент простагландин H синтаза (PGHS, К.Ф.1.14.99.1) осуществляет первый этап в биосинтезе всех простагландинов, а также тромбоксана и простациклина, катализируя превращение молекулы арахидоновой кислоты в простагландин H2. Простагландины – модуляторы сердечно-сосудистой, желудочно-кишечной, почечной и репродуктивной систем, они являются медиаторами боли, воспаления, повышения температуры, аллергии, и поэтому фермент, катализирующий их биосинтез, представляет собой исключительно важную фармакологическую мишень. Терапевтический эффект всех нестероидных противовоспалительных средств обусловлен ингибированием PGHS. PGHS – бифункциональный фермент, он катализирует: циклооксигеназное окисление арахидоновой кислоты двумя молекулами кислорода с образованием простагландина G2 и пероксидазное восстановление перекисной группы простагландина G2 в присутствии донора электронов с образованием простагландина H2. Обе реакции идут на одной молекуле белка на двух близко расположенных активных центрах. Влияние концентрации кислорода (как субстрата) на параметры циклооксигеназной реакции до сих пор не было изучено. Нами отработана методика создания и поддержания заданных концентраций кислорода в реакционной среде в широком диапазоне. Проведенные нами исследования показали, что кинетика циклооксигеназной реакции имеет ярко выраженные отклонения от кинетики Михаэлиса-Ментен и чрезвычайно чувствительна к наличию в реакционной среде субстратов пероксидазной реакции. Полученные результаты не могут быть объяснены с учетом современных представлений о механизме действия PGHS. В рамках данного проекта мы планируем исследование механизма проникновения кислорода в активный центр и его взаимодействия с арахидоновой кислотой методами кинетики, молекулярного моделирования и квантовой химии.
1. Обнаружен и изучен экспериментальными кинетическими методами феномен ингибирования циклооксигеназной активности фермента простагландин H синтазы молекулярным кислородом. Основные положения: 1) скорость циклооксигеназной реакции снижается при увеличении концентрации кислорода от 100 до 1000 мкМ; 2) в присутствии донора электронов в среде ингибирование не полное – снижение скорости происходит приметно в 2 раза, т.е. существует предел, не равный нулю, к которому стремится скорость реакции при повышении концентрации кислорода; 3) эффект ингибирования практически отсутствует, если в среде нет донора электронов, т.е. увеличение скорости циклооксигеназной реакции, обусловленное наличием донора электронов в среде, нивелируется при увеличении концентрации кислорода в среде от 100 до 1000 мкМ; 4) скорость пероксидазной реакции не зависит от концентрации кислорода. На основании этих положений выдвинута гипотеза, согласно которой: а) механизм ингибирования циклооксигеназной активности кислородом в высоких концентрациях не обусловлен влиянием кислорода на пероксидазную активность фермента; б) природа увеличения скорости циклооксигеназной реакции, обусловленного наличием донора электронов в среде, не связана с интенсивностью протекания пероксидазной реакции. 2. Показано, что зависимости скорости пероксидазной реакции фермента простагландин Н синтаза от концентрации донора электронов TMPD и от концентрации перекиси водорода линейны в двойных обратных координатах. Показано, что в механизме пероксидазной реакции при использовании в качестве субстратов донора электронов TMPD и перекиси водорода отсутствуют мономолекулярные стадии. 3. Квантовохимическими расчетными методами построены энергетические профили циклооксигеназной реакции как для нативного субстрата – арахидоновой кислоты, так и для его структурных аналогов. Выделены основные термодинамические стадии процесса. Среди исследованных соединений найдены потенциальные ингибиторы фермента. 4. Проведен анализ научно-технической литературы по многообразию ферментов, катализирующих реакции с участием кислорода: обнаружено около 400 таких ферментов, порядка 120 ферментов представляют живой интерес для исследования кинетическими и др. методами. Проведен сравнительный анализ кинетических механизмов этих ферментов, выделены основные классы механизмов и подробно охарактеризовано пять конкретных механизмов. 5. Разработана методика пробоподготовки препарата фермента простагландин H синтазы для исследования флуоресценции фермента. Проведен флуоресцинтный анализ фермента простагландин H синтазы. Выводы: 1). для PGHS представляется возможным разделить флуоресценцию тирозина от его совместной флуоресценции с триптофаном, пики и интенсивность флуоресценции определены; 2). обнаруженные пики флуоресценции не зависят от того, инактивирован белок или нет, а также от добавления дополнительного гемина и от концентрации кислорода.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2009 г.-31 декабря 2011 г. | Молекулярный кислород как субстрат циклооксигеназной реакции фермента простагландин Н синтазы |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".