ИСТИНА

Идентификация и структурно-функциональный анализ протеасом и протеасомоподобных альфа-РНП частиц, индуцируемых при апоптозе и дифференцировке клеток, позволит уточнить роль этих частиц в указанных процессах на разных уровнях регуляции экспрессии генов (от транскрипции до времени жизни мРНК и белка). Будут проанализированы спектры субпопуляций частиц, индуцируемых в ходе апоптоза и дифференцировки; очищены изоформы частиц, специфически изменяющихся при индукции данных процессов, и охарактеризована природа модификаций каталитических и регуляторных субъединиц. Планируется исследование протеолитической, эндорибонуклеазной и ДНК - геликазной активностей частиц и их отдельных субъединиц, а также идентификация ферментов (протеинкиназ и фосфатаз), ответственных за специфическую модификацию субъединиц. Предусмотрена раздельная характеристика индуцируемых фракций ядерных, цитоплазматических и экстраклеточных альфа-РНП и протеасом (включая иммунопротеасомы) и исследование участия каждой из них в процессе транскрипции регуляторных генов и генов-маркеров дифференцировки (семейств Bcl, Bax; c-myc, c-jun, p21Waf1/CIP1, survivin’а, глобинов и др.) и в контроле времени жизни специфических информационных РНК. Запланировано также проанализировать участие регуляторных (АТФазных) субъединиц протеасом в транскрипции индивидуальных генов. Будет проведен молекулярно-генетический анализ природы и функций малых некодирующих РНК, ассоциированных с индивидуальными видами частиц. Предполагается подробное изучение обнаруженных нами пенетративных свойств протеасом (их способности проникать в живые клетки из культуральной среды) и анализ молекулярных механизмов контроля этого процесса. Для определения функциональной роли специализированных видов альфа-РНП и протеасом планируется исследовать действие интернализованных живыми клетками частиц на различные уровни экспрессии генов и процессы апоптоза и дифференцировки в клетках-реципиентах (принципиально новый подход).

The identification and structural-functional analysis of the proteasome and proteasome-like alpha-RNP particles induced by apoptosis and cell differentiation will allow us to clarify the role of these particles in these processes at different levels of regulation of gene expression (from transcription to the lifetime of mRNA and protein). Spectra of subpopulations of particles induced during apoptosis and differentiation will be analyzed; The isoforms of particles specifically changed during the induction of these processes are purified, and the nature of the modifications of the catalytic and regulatory subunits is characterized. It is planned to study the proteolytic, endoribonuclease and DNA helicase activity of particles and their individual subunits, as well as the identification of enzymes (protein kinases and phosphatases) responsible for the specific modification of subunits. Separate characteristics of inducible fractions of nuclear, cytoplasmic and extracellular alpha-RNP and proteasomes (including immunoproteasomes) and the study of the participation of each of them in the transcription of regulatory genes and differentiation marker genes (Bcl, Bax, c-myc, c-jun, p21Waf1 / CIP1, survivin, globins, etc.) and in the control of the lifespan of specific information RNAs. It is also planned to analyze the involvement of regulatory (ATPase) proteasome subunits in the transcription of individual genes. A molecular genetic analysis of the nature and functions of small non-coding RNAs associated with individual species of particles will be carried out. A detailed study of the penetration properties of proteasomes (their ability to penetrate into living cells from the culture medium) and an analysis of the molecular mechanisms controlling this process are proposed. To determine the functional role of specialized types of alpha-RNP and proteasomes, it is planned to study the effect of particles internalized by living cells on different levels of gene expression and the processes of apoptosis and differentiation in recipient cells (a fundamentally new approach).

Результаты сравнительного анализа пенетративной активности различных субпопуляций протеасом и альфа-РНП частиц и выяснение оптимальных условий поступления из культуральной среды различных видов частиц в клетку (концентрация частиц, температура, время, концентрация двухвалентных катионов, статус фосфорилирования отдельных субъединиц). Характеристика влияния интернализованных альфа-РНП частиц и протеасом на экспрессию в клетках-реципиентах ряда генов: survivin, c-fos, глобины. Характеристика природы гранул, в которых локализуются интернализованные клетками частицы (как выделенные из контрольных клеток, так и из клеток, индуцированных к апоптозу и дифференцировке). Результаты анализа ко-локализации исследуемых частиц со стресс-гранулами. Получение в препаративных количествах (с помощью хроматографии на MonoQ) специализированных видов протеасом, индуцируемых при апоптозе, вызванном действием диетилмалеата и доксорубицина на клетки К562. Характеристика субъединичного состава, статуса фосфорилирования и других модификаций субъединиц, а также ферментативных активностей очищенных изоформ частиц. Очистка с помощью 2Д-элекрофореза модифицированных изоформ отдельных субъединиц – для дальнейшего масс-спектрометрического анализа. Характеристика природы индивидуальных видов малых РНК, ассоциированных с индуцируемыми при апоптозе изоформами протеасом. Результаты анализа фосфорилирования in vitro субъединиц протеасом (из клеток К562) очищенной протеинкиназой ATM. Выяснение вклада малых некодирующих РНК, ассоциированных с протеасомами, а также статуса фосфорилирования субъединиц в действие отдельных видов интернализованных частиц на экспрессию генов в клетках-реципиентах: результаты влияния обработки микрококковой нуклеазой (для удаления ассоциированных РНК). Анализ влияния дефосфорилирования протеасом на эффективность действия интернализованных частиц на экспрессию генов-мишеней в клетках-реципиентах. Результаты анализа влияния интернализованных протеасом и альфа-РНП на сроки жизни ряда информационных РНК (c-myc, Bcl2, Bclх, Bax) в клетках – реципиентах в условиях подавления транскрипции актиномицином Д. В целом, к концу года набрать материал, позволяющий получить новые данные о пенетративной активности исследуемых частиц и механизмах влияния интернализованных протеасом и альфа-РНП частиц на экспрессию генов в клетках-мишенях.

Нами обнаружена регулируемая эндорибонуклеазная активность у 26S протеасом и альфа-РНП частиц, выявлены множественные механизмы контроля данной активности. Получены оригинальные данные, свидетельствующие об участии специфических видов протеасом в реализации программы гибели клеток опухолевого происхождения. Выявлена регуляция статуса фосфорилирования протеасом при апоптозе. Показана специфичность субпопуляции протеасом, экскретируемой из клеток. Обнаружено явление интернализации протеасом живыми клетками. Наши результаты представляются заслуживающими дальнейшего изучения, т.к. важны для понимания роли специализированных видов протеасом и альфа-РНП частиц в клеточных процессах и кроме того, могут быть использованы для разработки диагностических тестов оценки функционального состояния опухолевых клеток, и кроме того, для создания системы направленного воздействия на активность специфических генов в клетках-реципиентах с помощью введенных извне протеасом.

Ранее мы показали, что, выходя из клеток в культуральную среду, 26S протеасомы сохраняют разнообразные ферментативные активности, свойственные им во внутриклеточных фракциях этих частиц. Было высказано предположение, что выходящие из клеток функционально активные протеасомы могут играть роль переносчиков информации от клеток-доноров к клеткам-реципиентам при условии, что они способны проникать в живые клетки. Для проверки этого предположения на первом этапе необходимо было показать, что экзогенные 26S протеасомы могут входить в живые клетки из культуральной среды. Следующим этапом стал вопрос, а если протеасомы входят в живые клетки, способны ли они влиять на экспрессию специфических генов в клетках-реципиентах. Результаты опытов по оценке способности экзогенных протеасом поступать из культуральной среды в живые клетки показали, что уже через 15 мин инкубации клеток К562 с мечеными протеасомами метка обнаруживается как в цитоплазме, так и в ядрах клеток, что говорит о быстром поступлении частиц внутрь клеток. Протеасомы, несущие флуоресцентную метку, локализуются как в гранулах, равномерно распределенных в цитоплазме и ядрах, так и в ярких крупных, пока не идентифицированных, скоплениях. Представляет интерес тот факт, что хотя общее содержание меченых частиц в клетках заметно увеличивается при увеличении времени инкубации, сама картина распределения меченых протеасом в клетках-реципиентах после 15 мин, 1 и 24 ч инкубации с протеасомами принципиально практически не изменяется. Таким образом, экзогенные 26S протеасомы способны быстро проникать из культуральной среды в клетки К562 и выявляются как в цитоплазме, так и в ядрах клеток-реципиентов в течение длительного времени. Сравнительный анализ пенетративной активности различных популяций протеасом, выделенных из контрольных и индуцированных к апоптозу клеток проэритролейкемии человека линии К562 показал, что эффективность проникновения разных протеасомных фракций в клетки не различается. Так, уже через 1 мин после добавления меченных биотин-флуоресцеином протеасом в среду, частицы проникали в клетки, довольно равномерно распределялись по цитоплазме и накапливались в ядрах. Причем оставались они там в течение длительного времени. Ранее было обнаружено, что эукариотические клетки способны выделять в культуральную среду, также как и в межклеточное пространство, протеасомы и протеасомо-подобные частицы (альфа-РНП). Выход протеасом из клеток может быть обусловлен как пассивным процессом за счет поврежденных клеток в общей клеточной популяции, так и активным выходом из жизнеспособных клеток. Используя метод иммунопреципитации, мы анализировали количество протеасом, экскретируемых контрольными и индуцированными к апоптозу клетками К562. Оказалось, что после 24 ч воздействия индукторов апоптоза мы не наблюдали возможного увеличения количества внеклеточных протеасом. Следовательно, выход протеасом из клеток – это условно естественный процесс, присущий нормальным клеткам. Чтобы ответить на вопрос, объясняется ли выход протеасом во внеклеточное пространство особенностью трансформированных клеток, мы попытались оценить количественно уровень протеасом, экскретированных одинаковым количеством клеток за одинаковое время: трансформированными и нетрансформированными клетками линий К562 и ДМЕ/F12 (мезенхимальные клетки человека), соответственно. Оказалось, что экскреция протеасом клетками во внеклеточное пространство – процесс, по всей видимости, постоянный и характерен как для трансформированных клеток, так и для нормальных. Чтобы оценить возможные механизмы регуляции экскреции протеасом, использовали воздействие диэтилмалеата (ДЭМ) и адриамицина (ДР) на клетки в течение 1 ч, когда уже происходит блок клеточного цикла в G1 фазе, но об индукции апоптоза как такового говорить не приходится. Оказалось, что воздействие ДЭМ на клетки К562 в течение 1 ч ингибировало выход протеасом из клеток в среду. На настоящий момент рано говорить о причинах и механизмах ингибирования протеасомной экскреции, поскольку прежде необходимо исследовать и понять те изменения, которые вызывает в клетке ДЭМ. Для сравнительной характеристики протеасом, экскретируемых во внеклеточную среду, и клеточных протеасом проводили анализ их пептидазных активностей. Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что пептидазные активности популяций цитоплазматических и внеклеточных протеасом различны, что позволяет предположить, что одним их механизмов регуляции активности протеасом в клетке может быть избирательная секреция клетками специфической субпопуляции этих частиц. Анализ эндорибонуклеазной активности протеасом показал, что внеклеточные протеасомы отличаются от цитоплазматических протеасом и по РНКазной активности. Оказалось, что активность популяции внеклеточных протеасом резко отличается от таковой для цитоплазматических протеасом, что также свидетельствует о высокой специфичности субпопуляции протеасом, экскретируемых клетками, причем активность этой субпопуляции изменяется под влиянием индукторов апоптоза. Полученные данные позволяют предположить, что наблюдаемое снижение активности протеасом в цитоплазме является следствием выделения активной субпопуляции этих частиц в культуральную среду под действием индукторов апоптоза. Таким образом, и в этом случае регуляция экскреции протеасом может служить механизмом контроля их активности в клетке. Для анализа посттрансляционных модификаций субъединиц протеасом, препараты очищенных 26S протеасом, выделенных из цитоплазмы клеток К562 и из кондиционированной клетками К562 среды, фракционировали при помощи метода двумерного электрофореза белков с последующим вестерн-анализом с использованием антител, специфических к субъединицам протеасом. При сравнении субъединичного состава цитоплазматических и внеклеточных протеасом, наблюдались различия в наборе изоформ субъединиц протеасом, что по всей видимости, объясняется различиями в их функциях. Наблюдая пенетративную способность протеасом, важно было попытаться дать ответ на вопрос, каким образом протеасома, как огромный белковый комплекс, может поступать в клетки. Чтобы ответить на этот вопрос, мы для начала поставили простой эндоцитозный тест. Мы ингибировали эндоцитоз как с помощью понижения температуры до 4о С, так и при добавлении ингибитора в том числе эндоцитоза – азида натрия (NaN3). Оказалось, что ни понижение температуры, ни добавление ингибитора, ни даже комбинаторное воздействие, не предотвратили поступление протеасом в клетки, что свидетельствует о существовании, по крайней мере, альтернативного механизма выхода/поступления протеасом из/в клетки. Важно также отметить, что диапазон температуры от 4 С до 37 С, так же как и неспецифическое дефосфорилирование субъединиц протеасом, обработка частиц микрококковой нуклеазой не выявили изменений в пенетративной активности исследуемых частиц. Для определения возможного механизма выхода и поступления протеасом из клеток и в клетки мы поставили уникальный эксперимент, в котором вводили экзогенные меченные флуоресцирующим агентом протеасомы в суспензионные клетки К562. Инкубация частиц с живыми клетками составила 24 ч. После чего клетки были тщательно отмыты от оставшихся в кондиционированной клетками среде меченых протеасом и добавлены к монослойной культуре А431 еще на 24 ч при постоянном энергичном перемешивании, которое препятствовало, во первых, клеточному мембранному контакту, во-вторых, оседанию суспензионной культуры на дно культуральной посуды. Затем монослойную культуру тщательным образом отделяли от суспензионных клеток и анализировали с помощью конфокального микроскопа. Как оказалось, экзогенные протеасомы, поступая сначала в одни клетки, покидали их и входили уже в другие. Полученные, таким образом, уникальные данные доказывают непосредственное участие протеасом в межклеточной коммуникации. После того, как мы показали, что экзогенные протеасомы могут проникать в живые клетки и формировать дополнительный внутриклеточный пул этих частиц, встал вопрос об их возможной роли в клетке и, в частности, об их влиянии на экспрессию генов в клетках-реципиентах. В качестве модельной системы использовали индуцированные к программированной гибели и контрольные клетки К562; в качестве экзогенных протеасом использовали протеасомы, выделенные из контрольных и индуцированных к апоптозу клеток К562. Проведенная с помощью ОТ-ПЦР оценка экспрессии специфических про- и анти-апоптозных генов показала, что интернализованные клетками 26S протеасомы по-разному влияют на экспрессию генов-регуляторов апоптоза в клетках-реципиентах. Экспрессия анти-апоптозных генов bcl-2, bcl-х, survivin и онкогена c-myc снижается под влиянием индуктора апоптоза ДР, поглощенные клетками экзогенные протеасомы вызывают дополнительное достоверное снижение экспрессиии этих генов, усиливая тем самым действие ДР на клетки, т.е. активируя апоптоз. Следует подчеркнуть, что снижение уровня экспрессии всех перечисленных выше генов проявляется гораздо сильнее при использовании экзогенных протеасом, выделенных из клеток, предварительно обработанных индуктором апоптоза ДР. Наличие (хотя и гораздо менее выраженного) влияния протеасом, изолированных из контрольных клеток, на экспрессию исследованных генов можно объяснить присутствием в контрольной популяции некоторого количества клеток, спонтанно вошедших в апоптоз. В отличие от действия на анти-апоптозные гены экзогенные протеасомы, входя в живые клетки, как и следовало ожидать, не снижали, а несколько повышали уровень экспрессии про-апоптозного гена bax. Экзогенные протеасомы, выделенные как из контрольных, так и из индуцированных к апоптозу клеток, практически не оказывали эффекта на экспрессию исследуемых генов в контрольных клетках. Молекулярные механизмы действия интернализованных живыми клетками протеасом на разные уровни экспрессии генов ещё предстоит исследовать. Для выяснения механизма влияния интернализованных протеасом на экспрессию генов в клетках-реципиентах исследовали их эффект на фоне действия ингибитора транскрипции – актиномицина Д и ингибитора киназ – росковитина. При анализе влияния экзогенных частиц на экспрессию генов наблюдался эффект при ингибировании транскрипции, что свидетельствует о действии протеасом на уровне контроля срока жизни информационных РНК в клетке. Мы обнаружили, что в ответ на различные стрессы и стимулы (повреждения ДНК, дифференцировка) отдельные субъединицы протеасом подвергаются фосфорилированию и убиквитилированию. Так, например, методами тандемной масс-спектрометрии было обнаружено, что в ответ на обработку человеческих клеток К562 генотоксичным противоопухолевым препаратом доксорубицином, субъединица 20S протеасомы альфа5 (зета), наряду с конститутивным фосфорилированием по остаткам Ser16 и Ser56 (ранее описанным в литературе на клетках человека ряда стабильных линий), приобретала дополнительное, не описанное ранее, фосфорилирование по Thr55 и Thr213. Какова функция фосфорилирования данной субъединицы? Чтобы ответить на этот вопрос, мы экспрессировали химерные белки GST-альфа5 и GST-альфа5’ (альфа5‘ – фрагмент субъединицы альфа5, имеющий делецию 5'-концевого участка длиной 117 нуклеотидов) в E.coli. Как известно, прокариотические белки не модифицируются фосфорилированием, а значит, данную модель можно использовать для изучения влияния вышеописанной модификации на способность субъединицы протеасом альфа5 к расщеплению РНК. Обнаружили, что оба созданных нами рекомбинантных белка (GST-альфа5 и GST-альфа5’) обладают РНКазной активностью, выяснили оптимальные условия реакции, установили, какая часть белка альфа5 содержит каталитический центр. Результаты наших экспериментов показали, что оба полученных белка обладают эндорибонуклеазной активностью по отношению к препаратам высокомолекулярных цитоплазматических РНК клеток человека К562. Мы обнаружили, что необходимым условием для проявления РНКазной активности белка альфа5 является присутствие в реакционной смеси двухвалентных катионов – кальция или магния (до 10 мМ). Важно отметить, что тот же препарат РНК инкубировали с очищенным из E.coli белком GST, свободным от субъединицы альфа5. Во всех вариантах обработок рибонуклеазная активность у GST отсутствовала, что указывает на специфичность данного процесса. Проявление РНКазной активности обоими белками (полноразмерным альфа5 и его делеционным мутантом без первых 39 аминокислот) позволяет говорить о том, что РНКазный центр расположен в фрагменте с 40 по 242 аминокислоту. Впоследствии, для локализации РНКазного центра субъединицы альфа5 были получены делеционные формы белка длиной 211, 181, 151, 121 и 91 аминокислотных остатков. Проведен сравнительный анализ способности к эндонуклеолизу белка дикого типа и мутантных форм. Мутантные белки, как и белок дикого типа, обладали эндорибонуклеазной активностью, что свидетельствует о N-терминальном расположении РНКазного центра субъединицы альфа5 20S-комплекса протеасом. Различия в оптимальных условиях для проявления РНКазной активности эукариотическими 20S протеасомами, выделенными из клеток и экспрессированной в клетках E.coli субъединицей альфа5 (в частности, зависимостью активности от присутствия ионов щелочноземельных металлов) могут быть обусловлены наличием у субъединиц протеасом эукариот специфического фосфорилирования по некоторым остаткам Tyr, Ser, Thr. Мы планируем проверить эту гипотезу, профосфорилировав альфа5 субъединицу in vitro и сравнив ее активность с нативно выделенной формой. В дальнейшем планируется изучить влияние эндорибонуклеазной активности альфа5 на стабильность мРНК в клетке. Нами обнаружено, что РНКазной активностью, помимо описанных ранее в литературе белков альфа5 и альфа1, обладают субъединицы 20S протеасом альфа6 и альфа7. Выяснены оптимальные условия для проявления данными белками эндорибонуклеазной активности. Для анализа РНКазной активности альфа-субъединиц протеасом, свободных от модификации фосфорилированием аминокислотных остатков серина, треонина и тирозина, было проведено клонирование каталитически активных альфа-субъединиц протеасом и экспрессия слитых с GST химерных белков в клетках E.coli. Для синтеза рекомбинантных белков были получены экспрессионные вектора для E.coli. При этом гены альфа-субъединиц были помещены в открытую рамку считывания глутатион-S-трансферазы (GST), так что синтезируемые белки представляли собой белки слияния функционально активной GST с субъединицами. Синтез белков осуществляли в клетках E.coli BL21 (DE3). Были подобраны оптимальные условия для экспрессии рекомбинантных белков: концентрация ИПТГ, температура и время инкубации. Был оптимизирован метод очистки субъединичных белков с помощью аффинной хроматографии на глутатион-сефарозе. Степень очистки субъединиц определяли электрофоретически. С целью изучения способности изолированных альфа-субъединиц 20S-комплекса протеасом к эндонуклеолизу оценивались РНКазные активности рекомбинантных субъединиц альфа-типа. Для исследования РНКазной активности рекомбинантных белков определяли степень деградации индивидуальных мРНК p53 и с-myc в присутствии ионов Мg2+ и Ca2+. В качестве отрицательного контроля использовали функционально активную GST, выделенную тем же методом, что и экспериментальные белки. Результаты эндонуклеолиза визуализировали с помощью авторадиографии после разделения фрагментов радиоактивного субстрата с использованием высоковольтного электрофореза РНК в денатурирующих условиях. Удалось показать, что субъединицы альфа1, альфа2, альфа4, альфа5 и альфа7, несмотря на отсутствие посттрансляционных модификаций, проявляют эндорибонуклеазную активность по отношению к мРНК p53 и с-myc, и для проявления их активности необходимы ионы Мg2+ или Ca2+. В среднем, мРНК с-myc деградировала в большей степени. При этом белок альфа3 не проявлял эндорибонуклеазную активность по отношению к мРНК p53 и демонстрировал сравнительно небольшую эндорибонуклеазную активность по отношению к мРНК с-myc. Из клеток К562, контрольных и индуцированных к апоптозу доксорубицином, были выделены цитоплазматические и ядерные протеасомы. Их субъединицы были разделены с помощью двумерного электрофореза. Из пятен, ранее масс-спектрометрически идентифицированных как содержащие альфа-субъединицы протеасом, были экстрагированы белки, которые затем исследовались на наличие эндорибонуклеазных активностей в различных условиях – в отсутствие двухвалентных катионов, в присутствии 5-10 мМ CaCl2 или в присутствии 5-10 мМ MgCl2. Для идентификации всех альфа-субъединиц, которые могут расщеплять РНК, было проведено двумерное электрофоретическое разделение белков протеасом, очищенных из цитоплазмы и ядра клеток К562. Затем, пятна, соответствующие субъединицам альфа-типа, были вырезаны из геля, с последующей экстракцией белков и оценкой их способности к расщеплению радиоактивно меченного РНК-субстрата – мРНК р53, синтезированной in vitro. Реакцию проводили в трех различных типах условий – в отсутствие двухвалентных катионов, а также в присутствии ионов кальция или магния. Обнаружили, что 5 цитоплазматических протеасомных субъединиц альфа-типа проявляют способность к деградации РНК, причем их активности возрастали в присутствии ионов кальция. В случае же ядерных протеасом, были обнаружены лишь две субъединицы, проявляющие РНКазную активность, - альфа5 и альфа7. Кроме того, следует отметить, что субъединица альфа7 была активна и в присутствии катионов магния. Для исследования регуляции РНКазной активности, нами были выделены цитоплазматические и ядерные протеасомы из клеток, индуцированных к апоптозу ДНК-повреждающим агентом доксорубицином. Субъединицы протеасом разделяли в двумерном электрофорезе с последующей экстракцией белков из пятен, соответствующих субъединицам; белки проверяли на способность к расщеплению того же РНК-субстрата в тех же трех условиях реакции (см. выше), для сравнения активностей субъединиц с таковыми из контрольных клеток. Все пятна исследовали масс-спектрометрически – как для идентификации белкового материала в пятнах, так и для поиска возможных различий, в частности – пост-трансляционных модификаций, потенциально способных регулировать РНКазную активность субъединиц. Было обнаружено, что способностью к деградации РНК обладают те же белки, что и в контрольных клетках, кроме субъединицы альфа6, потерявшей РНКазную активность под действием доксорубицина. Были обнаружены также некоторые различия в оптимальных условиях реакции почти для всех исследованных субъединиц протеасом. Мы обнаружили, что в ответ на различные стрессы и стимулы (повреждения ДНК, дифференцировка) отдельные субъединицы протеасом подвергаются фосфорилированию и убиквитилированию. Методами тандемной масс-спектрометрии мы обнаружили, что в ответ на обработку человеческих клеток К562 генотоксичным противоопухолевым препаратом доксорубицином, субъединица 20S протеасомы альфа5 (зета), наряду с конститутивным фосфорилированием по остаткам Ser16 и Ser56 (ранее описанным в литературе на клетках человека ряда стабильных линий), приобретает дополнительное, не описанное ранее, фосфорилирование по Thr55 и Thr213/219. Сходная картина наблюдалась и в случае субъединицы альфа7: помимо описанного в литературе конститутивного фосфорилирования по Ser250, обнаруженного нами в препаратах как из контрольных клеток, так и из обработанных доксорубицином, индукция программированной клеточной гибели приводила к появлению ранее не описанной модификации фосфорилированием. Ей подвергается один из следующих аминокислотных остатков: Ser2, Ser3, Thr6. В случае же индукции гемином эритроидной дифференцировки в клетках К562, наблюдалось фосфорилирование субъединицы альфа7 не только по остатку Ser250, но и по метионину в позиции 255; а субъединица альфа6 претерпевала фосфорилирование по остаткам Tуr6 и Thr11. Кроме того, нами было обнаружено, что две субъединицы альфа-типа из контрольных клеток К562 подвергаются убиквитинилированию по остаткам лизина K39/41, K30, K115 и K208 (короткая изоформа субъединицы альфа6) и К52 (субъединица альфа7). В протеасомах, выделенных из клеток, индуцированных к апоптозу доксорубицином, данная модификация не обнаруживалась. В дальнейшем, было выявлено убиквитинилирование двух других каталитически активных субъединиц протеасомы – альфа5 (К196, К203) и бета1 (К67), ответственных за проявление эндорибонуклеазной и каспазо-подобной протеолитической активностей, соответственно. Для подтверждения присутствия в клетках убиквитинилированных форм субъединиц альфа5 и альфа7 был проведён иммуноблоттинг клеточного экстракта, приготовленного из контрольных и обработанных доксорубицином клеток К562 в присутствии ингибитора деубиквитинилирующих ферментов леупептина, с использованием специфических антител к данным субъединицам. Данный эксперимент показал наличие в клеточном экстракте дополнительных форм субъединиц альфа5 и альфа7, отличающихся от канонических по молекулярной массе, причём отличие приблизительно соответствовало молекулярной массе единичного убиквитина (8,5 кДа), что говорит о присутствии в клетках К562 моноубиквитинилированных форм данных субъединиц. Кроме того, для субъединицы альфа5 было показано обогащение моноубиквитинилированной изоформой после индукции генотоксического стресса, что соответствует данным, полученным с помощью масс-спектрометрического анализа. Масс-спектрометрия выявила два сайта убиквитинилирования на белке альфа5 из цитоплазматических протеасом после воздействия доксорубицина, однако данные вестерн-блоттинга говорят о том, что рассматриваемые модификации чаще всего не встречаются на одной и той же молекуле белка, а являются взаимоисключающими. Таким образом, можно говорить о том, что субъединицы альфа5 и альфа7 в клетках К562 подвергаются моноубиквитинилированию. Функциональное значение убиквитинилирования каталитически активных альфа-субъединиц 20S комплекса к настоящему времени не выяснено. Обнаруженные нами изменения статуса фосфорилирования и убиквитинилирования субъединиц протеасом при генотоксическом стрессе позволяют предположить, что именно посттрансляционные модификации играют ключевую роль в регуляции пептидазных активностей протеасом при повреждении ДНК. Для проверки данной гипотезы было исследовано влияние убиквитинилирования протеасом in vitro на их способность к расщеплению флуорогенных пептидных субстратов. Эксперименты показали, что убиквитинилирование с помощью всех проверенных Е2-ферментов приводит к значительному снижению химотрипсино- и каспазо-подобной активностей протеасом. Убиквитинилирование бета-субъединиц вполне может изменять их конформацию, влияя на способность протеасом к расщеплению пептидов. Маловероятно, что убиквитин, ковалентно присоединенный к альфа-субъединицам протеасомы, непосредственно воздействует на сайты пептидазных активностей. Однако присутствие убиквитина на субъединицах альфа5, альфа6 и альфа7 может регулировать доступ субстрата во внутреннюю камеру 20S протеасомы, где и происходит расщепление субстрата, а также влиять на присоединение регуляторных комплексов, что тоже приводит к изменению спектра субстратов, расщепляемых протеасомой. Результаты наших экспериментов говорят о том, что при убиквитинилировании протеасом in vitro происходит заметное подавление пептидазных активностей этих комплексов. Механизм данного ингибирования пока не ясен, однако можно предположить несколько возможных вариантов. Первый возможный механизм - это влияние убиквитинилирования на доступ белковых субстратов в протеасому через регуляцию открытия входного канала. Пока мы не можем точно сказать, блокирует ли убиквитин вход или, напротив, способствует его открытию, но наши данные о подавлении пептидазных активностей после убиквитинилирования свидетельствуют в пользу негативной регуляции. Второй вариант - это вызываемое присоединением убиквитина изменение комформации 20S комплекса, которое могло бы привести к перестройкам в каталитических сайтах и, как следствие, к изменению пептидазных активностей. Наиболее очевидный случай возможной реализации такого механизма - это убиквитинилирование каталитической субъединицы бета1, отвечающей за каспазоподобную активность протеасомы. Однако не исключено, что и присоединение убиквитина к близлежащим субъединицам альфа-типа может приводить к дестабилизации активных сайтов бета-субъединиц. Кроме изменения непосредственно пептидазных активностей, убиквитинилирование субъединиц протеасомы потенциально может регулировать протеолиз и другими способами. Присоединение убиквитина к протеасомным субъединицам альфа-типа существенно изменяет поверхность комплекса, которая взаимодействует с регуляторными комплексами. В зависимости от расположения данной модификации, возможно, что активатор узнаёт убиквитин и привлекается к протеасоме или, напротив, наличие убиквитина дестабилизирует взаимодействие 20S протеасомы с регуляторными комплексами. Согласно литературным данным, субъединица Rpn10 способна специфически связывать остатки убиквитина и полиубиквитиновые цепи. Можно предположить, что данный белок способен узнавать убиквитин, связанный с альфа-субъединицами. В таком случае один из убиквитиновых рецепторов 19S комплекса окажется блокированным, что будет мешать распознаванию убиквитинилированных субстратов протеасомой. Белок Rpn10 является связующим звеном между «крышкой» и «основанием» 19S регулятора, соответственно между данной субъединицей и альфа-кольцом 20S протеасомы располагается кольцо из АТФазных субъединиц, а также белок Rpn1, что делает это взаимодействие маловероятным. Однако модификация субъединицы альфа7 полиубиквитиновой цепью повышает эту вероятность. Одна из известных функций моноубиквитинилирования - это регуляция белок-белковых взаимодействий. В случае протеасомы такая регуляция может привести к изменению спектра субстратов, узнаваемых вне зависимости от убиквитиновой метки. Механизм узнавания таких белков пока до конца не изучен, и не исключено, что моноубиквитинилирование субъединиц протеасомы может его регулировать. Известно, что многие субстраты, узнаваемые протеасомой по убиквитин-независимому механизму, взаимодействуют с субъединицей альфа7. Наши результаты говорят о том, что данная субъединица подвергается регулируемому моноубиквитинилированию, что дополнительно свидетельствует в пользу предложенной гипотезы. Реализуется ли какой-то один или несколько из этих механизмов, ещё предстоит выяснить. Возникающее на первый взгляд противоречие между увеличением пептидазных активностей после воздействия доксорубицина и подавлением их после убиквитинилирования легко объяснимо. Дело в том, что генотоксический стресс in vivo вызывает целый каскад посттрансляционных модификаций протеасом (в частности, фосфорилирование). При этом, не все рассматриваемые субъединицы подвергаются убиквитинилированию: белки бета1 и альфа7, напротив, теряют остатки убиквитина при воздействии на клетки доксорубицина. Поэтому, несмотря на то, что наши эксперименты подтверждают гипотезу об участии убиквитинилирования в регуляции активностей протеасом, они могут не вполне адекватно отражать ситуацию in vivo. Тем не менее, результаты данного исследования дают начало изучению влияния убиквитинилирования на свойства протеасомных субъединиц и в дальнейшем будут вписаны в общую картину регуляции активности протеасом за счет посттрансляционных модификаций. Для исследования альфа-субъединиц, не входящих в состав протеасомных комплексов, клеточные экстракты разделяли на фракции по плавучей плотности с помощью ультрацентрифугирования в градиенте концентрации глицерина. Показано наличие всех альфа-субъединиц во фракциях с низкими плотностями, не содержащих 20S и 26S протеасом. Изучено соотношение альфа субъединиц в различных фракциях и его изменение при индукции в клетках К562 повреждений ДНК с помощью доксорубицина. Из фракций низкой плотности, содержащих свободные альфа-субъединицы, проведена иммунопреципитация субъединиц альфа5 и альфа6 с целью изучения белков, взаимодействующих с ними вне протеасомы. Исследовали РНКазную активность таких иммунопреципитатов. В качестве субстрата использовали мРНК р53 человека, полученную с помощью транскрипции in vitro в присутствии радиоактивно меченного СТР. Для анализа влияния ингибиторов протеасом на РНКазную активность 20S комплексов, транскрибированный in vitro фрагмент мРНК c-myc инкубировали с протеасомами, очищенными из контрольных клеток К562, в присутствии различных ингибиторов протеолитических активностей протеасом (MG-132, лактацистин, винилсульфон, эпоксимицин, СНО). Три из пяти использованных ингибиторов (MG-132, лактацистин, винилсульфон) значительно подавляли РНКазную активность протеасом в присутствии катионов магния, а эпоксимицин - в отсутствие двухвалентных катионов в реакционной смеси (в этих условиях лишь MG-132 не оказывал влияния на способность протеасом к расщеплению РНК, остальные ингибиторы осуществляли, пусть и в незначительной степени, негативную регуляцию эндорибонуклеазной активности протеасом). В экспериментах in vitro мы обнаружили способность протеасом из клеток человека к эндонуклеолитическому расщеплению РНК генома вируса гриппа. Вопрос о природе и функциях РНК, ассоциированных с протеасомами, долгое время оставался открытым. В ходе выполнения данного проекта мы показали, что с протеасомной популяцией в клетке ассоциирован набор малых РНК, включающий в себя, в частности, РНК-транскрипты, имеющие определенную степень гомологии с ретропозонами Alu-семейства. Очищенные протеасомы из клеток К562 были подвергнуты действию протеаз (протеиназы К, проназы Е) с целью выделения ассоциированной с протеасомами РНК. С помощью электрофореза высокого разрешения в ПААГ исследовали спектр РНК (меченных 32P-ЦДФ по 3’-концам с помощью РНК-лигазы), ассоциированных с протеасомами. Результаты показали, что исследуемые РНК представлены дискретным набором малых РНК с размерами в диапазоне 20?220 нуклеотидов. Анализ ассоциированных с протеасомами РНК методом microarray-гибридизации (в рамках совместной работы с отделом биохимии университета г.Лейстер, Великобритания) с панелью 560 известных микро-РНК показал наличие в данной фракции около 100 различных микро-РНК. И если для некоторых из них известны гены-мишени, то для большинства функции пока неизвестны. Важно отметить, что набор ассоциированных с протеасомами РНК содержал такие онкосупрессорные микро-РНК, как miR-206, miR-17-5p, miR-125a, miR-125b, miR-200, семейство let-7. Кроме того, набор протеасомных РНК изменялся в ответ на обработку раковых клеток (К562) противоопухолевым препаратом доксорубицином. Полученные данные позволяют нам предположить важную комплексную функциональную роль протеасом, как протеаз, и ассоциированных с ними малых РНК в регуляции экспрессии генов на всех уровнях. Известно, что наряду с утилизацией по убиквитин-зависимому механизму, белки могут подвергаться протеасомной деградации и без предшествующего убиквитинилирования. Такие белки-мишени взаимодействуют с С-терминальным доменом субъединицы альфа7 коровой частицы 20S протеасомы. Нами была проведена работа по определению спектра белков, способных связываться с субъединицей альфа7. ДНК-последовательность, кодирующая субъединицу альфа7 протеасомы человека, была получена методом ОТ-ПЦР и клонирована в экспрессионный вектор pGEX. Белок альфа7-GST был экспрессирован в клетках E.coli и очищен методом аффинной хроматографии на глутатион-сефарозе. Полученный из культуры клеток К562 клеточный экстракт был разделен на ядерную и цитоплазматическую фракции, а затем проинкубирован с белком альфа7-GST. Связавшиеся с субъединицей альфа7 белки разделяли с помощью двумерного электрофореза. В результате было получено порядка 60 различных белков, способных связываться с субъединицей альфа7. Для идентификации белков использовали времяпролетную масс-спектрометрию. Все обнаруженные белки можно разделить на несколько групп, отвечающих за такие важные процессы в жизнедеятельности клетки как транскрипция (фактор ассоциированный с РНК полимеразой II, фактор инициации транскрипции II и др.), трансляция (фактор элонгации 1, лизил-тРНК-синтетаза и др.), сплайсинг (фактор сплайсинга 3A, гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин и др.) и репарация (АТФ-зависимая РНК-геликаза и др.)