![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Понимание механизмов регуляции, основанных на системном транспорте РНК и функциях кольцевых РНК, способствует развитию новых технологий и подходов в защите растений. Возможность практического использования ожидаемых результатов проекта при переходе к высокопродуктивному сельскохозяйственному производству определяется востребованностью новых данных о молекулярных механизмах системного транспорта РНК, трансляции и функционировании кольцевых РНК в растениях для решения задач биотехнологии, современных методов защиты растений и селекции.
Circular RNAs have considerable functional importance in eukaryotic organisms. However, the regulation of biological processes by circular RNAs remains a "white spot" in present-day plant molecular biology. On the other hand, the mechanisms of systemic RNA transport in plants are also currently insufficiently investigated. This project, aimed at studying retrozymes, plant circular RNA capable of systemic transport, is at the junction of these two understudied areas. Recently discovered plant retrozymes represent a new class of genetic elements uniquely combining the properties of non-autonomous retrotransposons and autonomous circular RNAs. In the DNA form, retrozymes are integrated into the genome and transcribed, giving rise to retrozyme RNA, which can participate in two types of processes. First, the retrozyme RNA can undergo reverse transcription, after which its DNA copy is integrated into the genome, completing the act of transposition of this genetic element. Second, the retrozyme RNA is capable of circularization, RNA-RNA replication, and autonomous persistence in cells, as well as systemic (long-distance) transport in plants. In addition, retrozyme RNAs contain open reading frames and can serve as potential templates for protein synthesis. At present, plant retrozymes have hardly been characterized experimentally. The possible functions of retrozyme RNA persistence in plants and its systemic transport also remain unknown. This project aims to characterize three aspects of the molecular biology of plant retrozymes, namely (1) transcription of retrozyme loci, (2) translation and properties of retrozyme-encoded protein, and (3) systemic transport of retrozyme RNA. NbRZ1 retrozyme, which has been found in N. benthamiana plants in our recent studies, will be used as a model in the proposed investigations. In accordance with the project objectives, three lines of experimental work are planned. First, the transcription of the NbRZ1 genomic locus will be characterized. For this purpose, the transcription start site will be identified and elements of the NbRZ1 promoter will be mapped. Also, transgenic plants carrying the reporter construct will be obtained to analyze tissue-specific NbRZ1 promoter activity at different stages of plant development. Second, the expression and properties of the NbRZ1-encoded protein will be analyzed. The immunodetection of this protein in plants will be carried out using specific antibodies that will be obtained during the project. Using confocal microscopy, the subcellular localization of the NbRZ1-encoded protein fused with a fluorescent marker protein will be investigated. The effect of this protein on the plant under conditions of its temporary expression using a viral vector and constitutive expression in transgenic plants, which are planned to be obtained, will be investigated. Third, the systemic transport of NbRZ1 RNA will be studied. A phloem transport signal in NbRZ1 RNA will be identified by mutagenesis. The possible role of the protein encoded by NbRZ1 in the systemic transport of NbRZ1 RNA will be analyzed. In addition, the need for circularization for systemic NbRZ1 RNA transport will be investigated. The objectives of the project are scientifically novel as they aim to investigate aspects of the molecular biology of plant retrozymes that are largely unexplored. The new knowledge gained from the project will be important for understanding the currently unknown functions of circular RNA and the poorly understood molecular mechanisms of systemic transport of macromolecules in plants. The apparently insufficient knowledge in these areas of plant molecular biology and the novelty of the themes of the proposed research determine the relevance of solving the tasks set in the project.
Результатами выполнения данного проекта станут новые фундаментальные научные знания в области молекулярной биологии растений, а именно новые сведения о биологии ретрозимных элементов, дальнем транспорте РНК и функционировании кольцевых РНК в растениях. Будут исследованы особенности транскрипции ретрозимных элементов; будет картирован сигнал дальнего транспорта ретрозимной РНК по флоэме, а также будет исследована возможность кольцевых РНК ретрозимов служить матрицами для трансляции. Научная значимость запланированных результатов связана с их новизной и важностью для понимания биологии ретрозимных элементов и функционирования кольцевых РНК в растениях. Запланированные результаты соответствуют мировому уровню исследований в данной области; их публикация предполагается в виде статей в ведущих международных журналах. Возможность практического использования ожидаемых результатов определяется востребованностью новых данных о молекулярных механизмах транспорта РНК и трансляции кольцевых РНК в растениях для решения биотехнологических задач, таких как использование кольцевых РНК как более стабильных матриц для экспрессии гетерологичных белков в эукариотических системах.
Научным коллективом накоплен опыт в изучении транспорта РНК по сосудистой системе растений и биологии ретрозимных элементов. В нашем научном коллективе была разработана оригинальная система на основе модифицированного генома Х-вируса картофеля, позволяющая тестировать различные последовательности РНК на способность опосредовать дальний транспорт. С помощью полученной системы удалось идентифицировать структурные сигналы, обеспечивающие транспорт РНК по сосудистой системе растений, такие как тРНК-подобные структуры ряда РНК вирусов растений и пре-миРНК. Помимо этого, нам удалось впервые показать способность ряда при-миРНК к системному транспорту по флоэме растений C.maxima. Вместе с тем, нам удалось обнаружить в составе генома растений N.benthamiana ретрозимные элементы и показать способность РНК ретрозимов к дальнему транспорту и репликации.
грант РНФ |
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 8 августа 2023 г.-30 июня 2024 г. | Экспрессия и транспорт ретрозимов в растениях |
Результаты этапа: Проведено картирование старта транскрипции в составе промотора LTR NbRZ1. Для этого получена тестовая конструкция pLH-LTRmut-GUS, в которой внесена мутация, делающая рибозим неактивным. Эффективность инактивации каталитической активности рибозима оценена in vivo с помощью гистохимической реакции, позволяющей детектировать в тканях растений каталитическую активность GUS по появлению синего окрашивания в присутствии XGluc, хромогенного субстрата GUS. Обнаружено, что окрашивание отсутствовало в случае конструкции LTRwt-GUS, содержащей природный вариант LTR NbRZ1, как следствие автокаталитического расщепления транскрипта рибозимом, но происходило в случае конструкции LTRmut-GUS вследствие блокирования работы рибозима внесенной мутацией. Помимо этого показано, что транскрипт, полученный in vitro на матрице LTRwt NbRZ1, подвергается эффективному автокаталитическому расщеплению на два фрагмента, чего не происходит в случае транскрипта, содержащего LTR c внесенной мутацией. Таким образом, показано, что внесенная мутация эффективно блокирует активность рибозима в LTR NbRZ1 in vitro и in vivo. На препаратах РНК, выделенных из листьев Nicotiana benthamiana, агроинфильтрированных конструкцией pLH-LTRmut-GUS с инактивированным рибозимом, с использованием метода 5’RACE (rapid amplification of cDNA ends) картирован 5'-концевой остаток транскрипта NbRZ1 и, таким образом, установлена точка инициации транскрипции на промоторе LTR NbRZ1. С помощью серии делеционных мутантов, полученных на основе конструкции LTRmut-GUS, показано, что промотор в составе LTR NbRZ1 является очень компактным (111 н.п.) и его активность сопоставима с сильным 35S промотором вируса мозаики цветной капусты. Для иммунодетекции белка NbRZ1-prot в растениях получены антитела к NbRZ1-prot. Для этого получена конструкция для экспрессии в бактериальных клетках слитного белка, включающего дигидрофолат-редуктазу мыши (DHFR) и N-концевой фрагмент белка NbRZ1-prot, консервативного у всех идентифицированных ретрозимных элементов N. benthamiana. Получен штамм-продуцент на основе штамма М15 E.coli. Рекомбинантный белок NbRZ1-prot выделен и очищен в препаративных количествах с помощью аффинной хроматографии. Полученный препарат белка использован для иммунизации кроликов и получения сыворотки, содержащей специфические антитела против NbRZ1- prot, с помощью которых будет проводиться иммунодетекция NbRZ1-prot методом иммуноблота образцов тканей, отобранных из различных органов на разных стадиях развития растений N. benthamiana. Субклеточная локализация NbRZ1-prot исследована с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Для этого получены конструкции, в которых кодирующая последовательность NbRZ1-prot слита с геном GFP с N- или C-конца и клонирована в составе бинарного вектора pLH под контролем 35S промотора. Несмотря на низкий уровень экспрессии полученных конструкций в инфильтрированных тканях N. benthamiana, нами позднее были подобраны условия, способствующие накоплению NbRZ1-prot-GFP в растениях, и показано, что NbRZ1-prot локализуется в дискретных подвижных структурах, распределенных по всей клетке. На следующем этапе работ по проекту с использованием маркеров различных субклеточных компартментов будут идентифицированы субклеточные структуры, в которых локализован NbRZ1-prot. Кодирующая последовательность NbRZ1-prot клонирована в составе вектора на основе генома Х-вируса картофеля (ХВК) для исследования влияния его экспрессии на растения N. benthamiana. Эффект экспрессии NbRZ1-prot исследован в растениях, системно инфицированных рекомбинантным вирусом, в сравнении с растениями, инфицированными векторной конструкцией, не несущей вставки. Выявлено, что геном ХВК, несущий последовательность, кодирующую NbRZ1-prot, нестабилен в клетках растений и подвержен спонтанным делециям, которые приводят к нарушению функциональной целостности вирусной РНК и ингибированию развития инфекции. Поскольку на модели ХВК оказалось невозможным проведение исследований влияния NbRZ1-prot на растения N. benthamiana, принято решение изменить экспериментальный подход и клонировать последовательность NbRZ1-prot в составе вирусного вектора на основе вируса погремковости табака (TRV). В настоящий момент с использованием этого рекомбинантного вирусного вектора начата экспериментальная работа, которую планируется закончить на следующем этапе работ по проекту. Получены трансгенные линии растений Arabidopsis thaliana для анализа тканеспецифичности работы промотора NbRZ1 и исследования эффекта экспрессии NbRZ1-prot на растения. Для этого получены конструкции, несущие репортерный ген GUS под контролем LTRmut NbRZ1 с нефункциональным рибозимом и NbRZ1-prot под контролем 35S промотора в соcтаве бинарного вектора pCambia1300. Проведена трансформация растений A. thaliana методом цветочного погружения. В растениях, отобранных после трансформации на селективной среде, с помощью ПЦР на препаратах геномной ДНК и обратной транскрипции-ПЦР на препаратах РНК показано наличие трансгена и его способность транскрибироваться. Отобрано по пять трансгенных линий для каждого типа трансгенных растений. С отобранных линий будут собраны семена, чтобы получить следующее поколение трансгенных растений, с которыми будет продолжена экспериментальная работа. | ||
2 | 1 июля 2024 г.-30 июня 2025 г. | Экспрессия и транспорт ретрозимов в растениях |
Результаты этапа: Показано, что в трансгенных растений Arabidopsis thaliana LTRmut-GUS N-концевая часть белка NbRZ1-prot слитная с последовательностью GUS, приводит к протеасомной деградации продукта трансляции и отсутствию активности GUS в тканях растений. Восстановление активности GUS происходит в случае ингибирования протеасомной деградации в присутствии ингибитора протеасом MG132 и в трансгенных линиях LTRdel-GUS, которые содержат последовательность LTR выше идентифицированного старта транскрипции и не содержат рамки NbRZ1- prot. Анализ активности промотора NbRZ1, имеющий целью выявить, в каких органах и тканях, а также на каких стадиях развития растений может быть детектирована активность данного промотора, проводился с использованием трансгенных линий LTRdel-GUS. С помощью гистохимической окраски с использованием X-Gluc, хромогенного субстрата GUS, показано, что промотор NbRZ1 активен в листьях, тычинках, элементах чашечки и в рыльцах пестика, но не активен в цветоносах и элементах венчика. Аналогичная картина наблюдалась при гистохимическом анализе активности делеционного варианта LTR-WRKYdel-GUS, несущего делецию области сайтов потенциального связывания транскрипционных факторов семейства WRKY. Изучена внутриклеточная локализация NbRZ1-prot в растениях Nicotiana benthamiana. Используя конструкции GFP-NbRZ1-prot и NbRZ1-prot-GFP и маркеры различных клеточных компартментов, показано, что NbRZ1-prot-GFP локализуется в тельцах Кахаля в составе ядра и в структурах в цитоплазме, которые частично ко-локализуются с маркером аппарата Гольджи, в то время как структуры, образуемые в цитоплазме белком GFP-NbRZ1-prot ко-локализуются с маркером аппарата Гольджи и не демонстрируют локализации в ядре. С использованием вирусного вектора на основе генома вируса погремковости табака, содержащего кодирующую последовательность NbRZ1-prot, показано, что повышенная экспрессия NbRZ1-prot приводит к развитию некрозов. Помимо этого, исследование потенциальной роли NbRZ1 на модели трансгенных растений 35S-RZ-prot, показало, что в контексте трансгенных растений этот белок не детектируется в отсутствие ингибитора MG132, т.к. отправляется на протеасомную деградацию, что также объясняет отсутствие соответствующего продукта в различных органах и частях растений Nicotiana benthamiana. Идентифицирован район и элементы вторичной структуры, которые содержат в своем составе PTS (Phloem Transport Signal). С помощью делеционного мутагенеза показано, что мутации в этих элементах приводят к ингибированию или полному блокированию системного транспорта РНК NbRZ1 в растениях. С использованием полученных конструкций NbRZ1nonAUG-Tag и NbRZ1stop- Tag, содержащих нуклеотидные замены, приводящие к отсутствию инициации или преждевременной терминации трансляции, показано, что трансляция белка NbRZ1- prot не влияет на репликацию и способность к системному транспорту РНК ретрозимов в растениях. Используя конструкцию NbRZ1non-circ-Tag, несущую мутации в составе LTRs, делающие ретрозимную РНК неспособной к циркуляризации, показано, что образование кольцевой формы ретрозимной РНК является необходимым для репликации и системного транспорта ретрозимов в растениях Nicotiana benthamiana. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".