Экспрессия и транспорт ретрозимов в растенияхНИР

Expression and transport of retrozymes in plants

Источник финансирования НИР

грант РНФ
грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 8 августа 2023 г.-30 июня 2024 г. Экспрессия и транспорт ретрозимов в растениях
Результаты этапа: Проведено картирование старта транскрипции в составе промотора LTR NbRZ1. Для этого получена тестовая конструкция pLH-LTRmut-GUS, в которой внесена мутация, делающая рибозим неактивным. Эффективность инактивации каталитической активности рибозима оценена in vivo с помощью гистохимической реакции, позволяющей детектировать в тканях растений каталитическую активность GUS по появлению синего окрашивания в присутствии XGluc, хромогенного субстрата GUS. Обнаружено, что окрашивание отсутствовало в случае конструкции LTRwt-GUS, содержащей природный вариант LTR NbRZ1, как следствие автокаталитического расщепления транскрипта рибозимом, но происходило в случае конструкции LTRmut-GUS вследствие блокирования работы рибозима внесенной мутацией. Помимо этого показано, что транскрипт, полученный in vitro на матрице LTRwt NbRZ1, подвергается эффективному автокаталитическому расщеплению на два фрагмента, чего не происходит в случае транскрипта, содержащего LTR c внесенной мутацией. Таким образом, показано, что внесенная мутация эффективно блокирует активность рибозима в LTR NbRZ1 in vitro и in vivo. На препаратах РНК, выделенных из листьев Nicotiana benthamiana, агроинфильтрированных конструкцией pLH-LTRmut-GUS с инактивированным рибозимом, с использованием метода 5’RACE (rapid amplification of cDNA ends) картирован 5'-концевой остаток транскрипта NbRZ1 и, таким образом, установлена точка инициации транскрипции на промоторе LTR NbRZ1. С помощью серии делеционных мутантов, полученных на основе конструкции LTRmut-GUS, показано, что промотор в составе LTR NbRZ1 является очень компактным (111 н.п.) и его активность сопоставима с сильным 35S промотором вируса мозаики цветной капусты. Для иммунодетекции белка NbRZ1-prot в растениях получены антитела к NbRZ1-prot. Для этого получена конструкция для экспрессии в бактериальных клетках слитного белка, включающего дигидрофолат-редуктазу мыши (DHFR) и N-концевой фрагмент белка NbRZ1-prot, консервативного у всех идентифицированных ретрозимных элементов N. benthamiana. Получен штамм-продуцент на основе штамма М15 E.coli. Рекомбинантный белок NbRZ1-prot выделен и очищен в препаративных количествах с помощью аффинной хроматографии. Полученный препарат белка использован для иммунизации кроликов и получения сыворотки, содержащей специфические антитела против NbRZ1- prot, с помощью которых будет проводиться иммунодетекция NbRZ1-prot методом иммуноблота образцов тканей, отобранных из различных органов на разных стадиях развития растений N. benthamiana. Субклеточная локализация NbRZ1-prot исследована с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Для этого получены конструкции, в которых кодирующая последовательность NbRZ1-prot слита с геном GFP с N- или C-конца и клонирована в составе бинарного вектора pLH под контролем 35S промотора. Несмотря на низкий уровень экспрессии полученных конструкций в инфильтрированных тканях N. benthamiana, нами позднее были подобраны условия, способствующие накоплению NbRZ1-prot-GFP в растениях, и показано, что NbRZ1-prot локализуется в дискретных подвижных структурах, распределенных по всей клетке. На следующем этапе работ по проекту с использованием маркеров различных субклеточных компартментов будут идентифицированы субклеточные структуры, в которых локализован NbRZ1-prot. Кодирующая последовательность NbRZ1-prot клонирована в составе вектора на основе генома Х-вируса картофеля (ХВК) для исследования влияния его экспрессии на растения N. benthamiana. Эффект экспрессии NbRZ1-prot исследован в растениях, системно инфицированных рекомбинантным вирусом, в сравнении с растениями, инфицированными векторной конструкцией, не несущей вставки. Выявлено, что геном ХВК, несущий последовательность, кодирующую NbRZ1-prot, нестабилен в клетках растений и подвержен спонтанным делециям, которые приводят к нарушению функциональной целостности вирусной РНК и ингибированию развития инфекции. Поскольку на модели ХВК оказалось невозможным проведение исследований влияния NbRZ1-prot на растения N. benthamiana, принято решение изменить экспериментальный подход и клонировать последовательность NbRZ1-prot в составе вирусного вектора на основе вируса погремковости табака (TRV). В настоящий момент с использованием этого рекомбинантного вирусного вектора начата экспериментальная работа, которую планируется закончить на следующем этапе работ по проекту. Получены трансгенные линии растений Arabidopsis thaliana для анализа тканеспецифичности работы промотора NbRZ1 и исследования эффекта экспрессии NbRZ1-prot на растения. Для этого получены конструкции, несущие репортерный ген GUS под контролем LTRmut NbRZ1 с нефункциональным рибозимом и NbRZ1-prot под контролем 35S промотора в соcтаве бинарного вектора pCambia1300. Проведена трансформация растений A. thaliana методом цветочного погружения. В растениях, отобранных после трансформации на селективной среде, с помощью ПЦР на препаратах геномной ДНК и обратной транскрипции-ПЦР на препаратах РНК показано наличие трансгена и его способность транскрибироваться. Отобрано по пять трансгенных линий для каждого типа трансгенных растений. С отобранных линий будут собраны семена, чтобы получить следующее поколение трансгенных растений, с которыми будет продолжена экспериментальная работа.
2 1 июля 2024 г.-30 июня 2025 г. Экспрессия и транспорт ретрозимов в растениях
Результаты этапа: Показано, что в трансгенных растений Arabidopsis thaliana LTRmut-GUS N-концевая часть белка NbRZ1-prot слитная с последовательностью GUS, приводит к протеасомной деградации продукта трансляции и отсутствию активности GUS в тканях растений. Восстановление активности GUS происходит в случае ингибирования протеасомной деградации в присутствии ингибитора протеасом MG132 и в трансгенных линиях LTRdel-GUS, которые содержат последовательность LTR выше идентифицированного старта транскрипции и не содержат рамки NbRZ1- prot. Анализ активности промотора NbRZ1, имеющий целью выявить, в каких органах и тканях, а также на каких стадиях развития растений может быть детектирована активность данного промотора, проводился с использованием трансгенных линий LTRdel-GUS. С помощью гистохимической окраски с использованием X-Gluc, хромогенного субстрата GUS, показано, что промотор NbRZ1 активен в листьях, тычинках, элементах чашечки и в рыльцах пестика, но не активен в цветоносах и элементах венчика. Аналогичная картина наблюдалась при гистохимическом анализе активности делеционного варианта LTR-WRKYdel-GUS, несущего делецию области сайтов потенциального связывания транскрипционных факторов семейства WRKY. Изучена внутриклеточная локализация NbRZ1-prot в растениях Nicotiana benthamiana. Используя конструкции GFP-NbRZ1-prot и NbRZ1-prot-GFP и маркеры различных клеточных компартментов, показано, что NbRZ1-prot-GFP локализуется в тельцах Кахаля в составе ядра и в структурах в цитоплазме, которые частично ко-локализуются с маркером аппарата Гольджи, в то время как структуры, образуемые в цитоплазме белком GFP-NbRZ1-prot ко-локализуются с маркером аппарата Гольджи и не демонстрируют локализации в ядре. С использованием вирусного вектора на основе генома вируса погремковости табака, содержащего кодирующую последовательность NbRZ1-prot, показано, что повышенная экспрессия NbRZ1-prot приводит к развитию некрозов. Помимо этого, исследование потенциальной роли NbRZ1 на модели трансгенных растений 35S-RZ-prot, показало, что в контексте трансгенных растений этот белок не детектируется в отсутствие ингибитора MG132, т.к. отправляется на протеасомную деградацию, что также объясняет отсутствие соответствующего продукта в различных органах и частях растений Nicotiana benthamiana. Идентифицирован район и элементы вторичной структуры, которые содержат в своем составе PTS (Phloem Transport Signal). С помощью делеционного мутагенеза показано, что мутации в этих элементах приводят к ингибированию или полному блокированию системного транспорта РНК NbRZ1 в растениях. С использованием полученных конструкций NbRZ1nonAUG-Tag и NbRZ1stop- Tag, содержащих нуклеотидные замены, приводящие к отсутствию инициации или преждевременной терминации трансляции, показано, что трансляция белка NbRZ1- prot не влияет на репликацию и способность к системному транспорту РНК ретрозимов в растениях. Используя конструкцию NbRZ1non-circ-Tag, несущую мутации в составе LTRs, делающие ретрозимную РНК неспособной к циркуляризации, показано, что образование кольцевой формы ретрозимной РНК является необходимым для репликации и системного транспорта ретрозимов в растениях Nicotiana benthamiana.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".