Энзимология биоэнергетических системНИР

Enzymology of the bioenergetic systems

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Энзимология биоэнергетических систем
Результаты этапа: В развитие гипотезы о функционировании Fo∙F1 АТРазы, главного источника АТР в аэробных клетках, определены рН-зависимости активностей синтеза и гидролиза АТР прочно сопряженными мембранами прокариота Paracoccus denitrificans. В интервале рН 6-7,5 гидролиз почти полностью обратимо блокируется по неконкурентному механизму при закислении среды, тогда как синтез не чувствителен к изменениям рН. Титрование обеих активностей специфическим ингибитором протонного канала вентурицидином выявило количественное различие в сродстве ингибитора к ферменту при определении его активности в реакциях синтеза и гидролиза АТР. На основании этих новых и ранее полученных результатов сформулирована гипотеза о существовании двух форм Fo∙F1: гидролазы и синтетазы, существующих в энерго-сопрягающих мембранах. Эта гипотеза опубликована (Zharova T.V., Vinogradov A.D. (2017) Biochim. Biophys. Acta, 1858 939-944) и, если подтвердится другими группами и нашими дальнейшими экспериментами, принципиально изменит существующие общепринятые представления о функционировании Fo∙F1 АТРаз(синтетаз). Экспериментально определены параметры генерации перекиси водорода дыхательным комплексом II митохондрий сердечной мышцы. Сформулирована и опубликована гипотеза (Grivennikova V.G. Kozlovsky V.S., Vinogradov A.D. (2017) Biochim. Biophys. Acta, 1858, 109-117), согласно которой связывание субстрата активным центром фермента меняет редокс-потенциал (или доступность для кислорода) железо-серного центра S-3 комплекса II, ответственного за генерацию супероксид-радикала и за кинетический механизм (ping-pong) сукцинат:убихинол оксидорезуктазной реакции. Разработан метод измерения новой активности дыхательного комплекса I – энерго-зависимое восстановление искусственного акцептора электронов, гексаамминорутения. Полученные результаты, готовящиеся к публикации, существенно меняют существующие представления о пути переноса электронов в NADH: убихинон редуктазном участке дыхательной цепи.
2 1 января 2018 г.-15 декабря 2018 г. Энзимология биоэнергетических систем
Результаты этапа: Цель настоящей работы получение экспериментально обоснованных сведений, достаточных для формулирования гипотез о молекулярных механизмах работы и регулирования двух «главных» ферментов, обеспечивающих снабжение клеток энергией в виде фосфорильного потенциала АТР и (или) трансмембранной протон-движущей силы (п.д.с.): Fo∙F1-ATPазы/синтетазы и NADH:убихинон-оксидоредуктазы (дыхательный комплекс I). В нашей лаборатории было сформулировано представление о Fo∙F1-АТРазе как о псевдообратимой молекулярной машине, функционирующей однонаправлено (различающимися молекулярными механизмами) в реакциях синтеза АТР, зависящего от протон-движущей силы (п.д.с.), или п.д.с.-генерирующего гидролиза АТР (Vinogradov A.D. Steady-state and pre-steady-state kinetics of the mitochondrial FoF1-ATPase: is ATP synthase a reversible molecular machine? J. Exp. Biol. 2000, 203, 41-49). Мы показали, что при физиологических рН гидролиз почти полностью блокируется при закислении среды, тогда как синтез не чувствителен к изменениям рН. Титрование обеих активностей специфическим ингибитором протонного канала вентурицидином выявило количественное различие в сродстве ингибитора к ферменту при определении его активности в реакциях синтеза и гидролиза АТР. Мы сформулировали пригодную для количественного моделирования кинетическую схему, описывающую функционирование двух неравновесных форм FoF1, независимо катализирующих энерго-зависимый синтез и энерго-продуцирующий гидролиз АТР в прочно-сопряженных мембранах Paracoccus denitrificans, и построили программу, позволяющую сопоставлять экспериментальных данных с теоретической схемой. Эта гипотеза, после подтверждения другими группами и нашими дальнейшими экспериментами принципиально изменит существующие общепринятые представления о функционировании Fo∙F1 АТРаз(синтетаз). Выяснение источников и механизмов образования и распада так называемых активных форм кислорода (АФК) – цель многочисленных биохимических исследований, касающихся физиологии клеток, органов и тканей. Мы закончили и опубликовано исследование зависимостей генерации активных форм кислорода от его концентрации препаратами мембран митохондрий сердца различной степени сложности. Мы показали, что точное измерение АФК, образующихся в митохондриях, возможно только при измерении начальных скоростей генерации, а не по накоплению резоруфина, из-за постоянного рециклирования окисленной и восстановленной формы резоруфина в измерениях с использованием Amplex Red в присутствии NADH и других возможных восстановителей, присутствующих в митохондриях. Нами был предложен простой метод регистрации АТФ-зависимого обратного переноса электронов от убихинола на гексаамминорутений (III) (ГАР), катализируемый митохондриальным дыхательным Комплексом I. Измерены параметры АТР-зависимого поглощения кислорода восстановленным ГАР – акцептором, введенным в практику нашей группой. Свойства этой реакции позволили сформулировать и опубликовать гипотезу о нуклеотид (NAD+, NADH)-независимом механизме сопряжения в комплексе I. Наши публикации 1. Grivennikova V.G. Kareyeva A.V., Vinogradov A.D. Oxygen-dependence of mitochondrial ROS production as detected by Amplex Red assay (2018) Redox Biol., 17 192-199. doi: 10.1016/j.redox.2018.04.014. 2. Gladyshev G.V., Grivennikova V.G., Vinogradov A.D. FMN site-independent energy-linked reverse electron transfer in mitochondrial respiratory complex I (2018) FEBS Lett. 592, 2213-2219. doi: 10.1002/1873-3468.13117. 3. Vinogradov Andrei D., Gladyshev Grigory V., Grivennikova Vera G. NAD+ Binding Site-Independent Energy-Linked Reverse Electron Transfer in Respiratory Complex I. 20th European Bioenergetics Conference, Будапешт, Венгрия, 25-30 августа 2018
3 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Энзимология биоэнергетических систем
Результаты этапа: I. А/Д переход в комплексе I дыхательной цепи Тридцать лет тому назад нашей группой было описано превращение протон-транслоцирующей каталитической активности NADH:убихинон-редуктазного участка дыхательной цепи митохондрий из «нормального» активного (А) состояния в неактивное (Д) и обратно (А/Д переход, Complex I A/D transition). В настоящее время ни механизм этого явления, ни его возможное физиологическое значение остается неизвестным и ограничивается гипотетическими предположениями. В настоящей работе мы сообщаем новые факты, касающиеся кинетических и термодинамических параметров деактивации комплекса I. 1. АТР и/или энергизация сопрягающей мембраны снижает скорость спонтанной деактивации комплекса I. Влияние АТР предотвращается блокированием протон-транслоцирующей активности Fo∙F1 или удалением его F1-компонента. 2. Процесс деактивации прекращается при соотношении Д/А форм ~ 10 и это соотношение не зависит от температуры. Мы рассматриваем две возможности сохранения остаточной активности комплекса I после завершения деактивации. Согласно первой в сопрягающих мембранах существует равновесие между этими формами. Другая возможность состоит в существовании фракции фермента, вообще не подверженной процессу спонтанной деактивации. Существование такой фракции может быть обусловлено специфическим набором аннулярных фосфолипидов или посттрансляционной модификацией одной или нескольких субъединиц комплекса I. II. Перенос электронов между редокс-компонентами комплекса I дыхательной цепи Митохондриальный Комплекс I и гомологичные NADH:хинон-редуктазы 1 типа (NDH-1) бактерий катализируют окисление NADH хинонами, сопряженное с векторной транслокацией 4 протонов через сопрягающую мембрану. Комплекс I содержит прочно связанный FMN, 7-8 железо-серных кластеров и связанный хинон. Механизм сопряжения транспорта электронов и векторной транслокации протонов неизвестен и является одной из главных нерешенных проблем современной биоэнергетики. Стехиометрия суммарной реакции NADH + H+ + Q + 4H+in NAD+ + QH2 + 4H+out иcключает транслокацию протонов единственной петлей Митчела. Все опубликованные гипотетические модели рассматривают перенос электронов от железо-серного кластера N2 хинон как наиболее вероятное «место» сопряжения. Недавно мы показали ATP-зависимый сукцинат-поддерживаемый обратный перенос электронов на искусственный акцептор электронов гексаамминорутений (III) (HAR) Комплексом I в составе субмитохондриальных частиц (СМЧ) сердца быка. Оказалось, что этот путь нечувствителен к ингибированию NADH-связывающего центра фермента специфическим ингибитором - NADH-OH. Ранее мы показали, что NADH:HAR-редуктазная активность митохондриального, но не прокариотического (P.denitrificans), фермента аллостерически стимулируется ATP. Разумно было подтвердить или опровергнуть феномен нечувствительного к NADH-OH ATP-зависимого сукцинат-поддерживаемого восстановления HAR на NDH-1 в составе вывернутых плазматических везикул P.denitrificans (СБЧ), т.к. для этого препарата отсутствуют аллостерические эффекты ATP. В настоящей работе мы показали, что 1) NADH:HAR-редуктазные активности СМЧ и СБЧ характеризуются различающейся немихаэлисовской кинетикой, которую можно объяснить существованием двух различных центров и/или механизмов восстановления этого акцептора. 2) Комплекс I и NDH-1 отличаются по параметрам взаимодействия NADH-связывающего центра с NADH-OH. 3) Блокирование NADH-связывающего центра NDH-1 этим ингибитором не препятствует энергозависимому восстановлению HAR. Таким образом, предложенная нами модель обратного переноса электронов от QH2 на HAR экспериментально подтверждена для первого пункта сопряжения дыхательной цепи прокариот. III. Кинетика синтеза АТР Fo∙F1-АТРазой/синтазой суббактериальных фрагментов Paracoccus denitrificans Почти общепризнано, что Fo∙F1 – обратимо функционирующий комплекс, катализирующий либо гидролиз АТР, сопряженный с векторным переносом протонов через мембрану, либо синтез АТР, используя свободную энергию такого переноса в обратном направлении. Подавляющее большинство данных, приведших к такому представлению, было выполнено при изучении АТР-гидролазной активности комплекса, легко регистрируемой при использовании либо его водорастворимого фрагмента (F1), либо Fo∙F1, связанного с несопряженными мембранами и неспособного катализировать энерго-зависимый синтез АТР. В течение многих лет внимание нашей группы было сосредоточено на проблеме обратимости функционирования Fo∙F1 комплекса с использованием прочносопряженных пространственно инвертированных субмитохондриальных фрагментов. Полученные результаты привели нас к представлению, о том, что механизмы синтеза и гидролиза АТР различны. В последние годы мы обратились к изучению суббактериальных фрагментов P. denitrificans – единственному доступному объекту, позволяющему прослеживать как естественный энерго-зависимый синтез АТР, так и обратную реакцию. Анализ обоих процессов позволил сформулировать гипотезу о существовании двух независимо функционирующих изоформ Fo∙F1: АТРазы и АТРсинтазы. В настоящей работе сообщаются результаты изучения кинетики синтеза АТР и изменений мембранного потенциала в мембранах P. denitrificans, демонстрирующих классическое явление дыхательного контроля. При значении рН среды 7,0, при котором гидролитическая активность Fo∙F1 почти отсутствует, и 8,0, при котором эта активность соизмерима с АТР синтазной, кинетика синтеза или гидролиза АТР и электрических ответов мембран соответствует модели функционирования двух независимых (неравновесных) изоформ Fo∙F1. Публикации 1.Виноградов А.Д. Новый взгляд на проблему обратимости синтеза и гидролиза АТР Fо∙F1-АТРазой (гидролазой) (2019) Биохимия, 84, 1553-15639. doi: 10.1134/S0320972519110034 2.Т.В. Жарова, А.Д. Виноградов. Fo∙F1-АТРаза/синтаза прочносопряженных суббактериальных фрагментов Paracoccus denitrifican: кинетика синтеза АТР (2019) D сборнике II Объединенный Научный Форум, VI Съезд Физиологив СНГ, VI Съезд биохимиков России IX, Российский симпозиум «Белки и пептиды». Научные труды, серия Спецвыпуск, место издания ActaNaturae, том 2, тезисы, с. 102 3.Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д. Кинетические и термодинамические параметры деактивации митохондриальной NADH:убихинон-оксидоредуктазы (дыхательного комплекса I) (2019) В сборнике II Объединенный Научный Форум, VI Съезд Физиологив СНГ, VI Съезд биохимиков России IX, Российский симпозиум «Белки и пептиды». Научные труды, серия Спецвыпуск, место издания ActaNaturae, том 2, тезисы, с. 101-102 4.Гладышев Г. В., Виноградов А.Д. Перенос электронов между редокс компонентами энергопреобразующих NADH:хинон оксидоредуказ (2019) В сборнике II Объединенный Научный Форум, VI Съезд Физиологив СНГ, VI Съезд биохимиков России IX, Российский симпозиум «Белки и пептиды». Научные труды, серия Спецвыпуск, место издания ActaNaturae, том 2, тезисы, с. 106

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".