ИСТИНА

Цель настоящего проекта – выявить адаптивные изменения у модельного аскомицетного гриба Podospora anserina(Rabenh.) Niessl в ходе эволюционного эксперимента в условиях погруженного культивирования в жидкой среде.

Wide availability of next-generation sequencing technology allows researchers to read whole genome DNA sequences of a variety of living organisms. Technological advances have opened up new possibilities for both fundamental and applied research. Now almost any mutation appeared in the cells of the studied organisms can be detected under controlled laboratory conditions in real time and used to obtain cultures of microorganisms with new phenotypes. The studies have done in this direction can be combined under the general term “laboratory evolution”. Some of them are aimed at studying fundamental evolutionary patterns in model laboratory systems, but the other aims to improve the properties of certain organisms that are beneficial to humans, most often for subsequent use in biotechnology. The genomes of microorganisms are quite simple for assembly and subsequent analysis, among them, popular objects are traditionally bacteria, yeasts and unicellular green algae. Incomparably less attention is paid to filamentous fungi, despite the fact that they also have simply arranged genomes of small size. In addition to this among them are fast-growing species that are convenient to work with in the laboratory. Moreover, filamentous fungi have great potential as producers of a wide range of secondary metabolites, including antibiotics, as well as different groups of enzymes. The declared Project combines both the first and second directions and is performed at the same time on the well-known model fungus Podospora anserina (Rabenh.) Niessl as an object of study. The long-term continuous evolutionary experiment conducted by our scientific group involves 8 independent lines of the fungus. Their growth is supported by the method of periodic serial passages in a liquid nutrient medium. The project will focus on various aspects of the experiment, including such tasks as whole genome sequencing of all experimental P. anserina lines at the next time point, de novo mutations detection, determination of the direction and particular qualities of the selection operating in our model system, after that annotation and functional interpretation of the detected mutations, in particular, evolutionary parallelisms, as well as elucidation of their possible influence on the metabolic and regulatory pathways of the fungus. In addition to bioinformatics analysis, within the framework of this Project, attention will be paid to the comparative characterization of experimental fungal cultures at the biochemical and cytological levels of organization. The laboratory evolution method we have worked out will be applied to study the possibility of improving biotechnologically significant properties of P. anserina in the enzymes production. It should be noted that the mutant fungal lines retain the ability to utilize a wide range of nutrients, in particular, the protein substrate as the sole source of carbon and nitrogen, despite many years of being on a standard nutrient medium containing neither proteins nor their hydrolysis products. The latter makes the fungus P. anserina interesting from the point of view of the possibility of laboratory evolution when using various protein substrates affect the quality and quantity of secreted proteolytic enzymes.

В процессе реализации Проекта будет проведено полногеномное секвенировние на двух различных платформах, основанных на разных технологиях, – Illumina и MinION, образцов ДНК мицелия из 8 непрерывно растущих экспериментальных линий P. anserina. Будет проведено картирование коротких прочтений на геномы двух контрольных исходных штаммов, определены однонуклеотидные полиморфизмы и короткие инделы, проведена аннотация однонуклеотидных полиморфизмов (синонимические, несинонимические, некодирующие) и проанализированы предполагаемые эффекты найденных полиморфизмов (анализ функций генов, несущих несинонимические мутации). С помощью картирования длинных прочтений в изучаемых геномах будут выявлены длинные выпадения и вставки, а также возможные дупликации генов. Будет проведен поиск эволюционных параллелизмов в независимых линиях изучаемого гриба. Будут определены метаболические и регуляторные пути, наиболее сильно затронутые процессом закрепления de novo мутаций, а также консервативность белков P. anserina, аминокислотная последовательность которых изменилась в экспериментальных условиях, посредством сравнения таких белков с ортологами, найденными в геномах грибов других видов. Будут построены пермутации для определения направления отбора, действующего в нашей модельной системе. Будет выполнен сравнительный анализ ультратонких срезов клеток мицелия всех 8 экспериментальных линий P. anserina, а также высевов из них на агаризованную среду, которые были приготовлены на различных этапах многолетнего эволюционного эксперимента. При этом будут учтены такие параметры как толщина клеточной стенки, размеры и частота расположения ядер, суммарная площадь митохондриальных срезов, целостность митохондрий, степень вакуолизации клеток и др. В целях поиска маркеров адаптации P. anserina к условиям продолжительного глубинного культивирования на уровне мембран будет проведен анализ состава мембранных глицерофосфолипидов, сфинголипидов и стеринов у двух экспериментальных линий в избранных временных точках. Будет проведено исследование лабораторной эволюции с использованием одной из имеющихся экспериментальных линий P. anserina, направленное на увеличение скорости деградации труднодоступного белкового субстрата, возможное изменение спектра и увеличение выхода секретируемых протеолитических ферментов. Будет выполнено полногеномое секвенирование вариантов P. anserina, которые в течение одного года будут непрерывно расти исключительно на белковом субстрате и проанализированы возможные генетические изменения в сравнении с соответствующими контрольными линиями, культивируемыми на стандартной лабораторной безбелковой питательной среде.

С 2012 года наша научная группа ведет непрерывный эволюционный эксперимент, поддерживая непрерывный рост 8 независимых мицелиальных линий методом серийных пассажей в жидкую питательную среду. За это время мы выполнили полногеномное секвенирование всех линий в 4 равноудаленных друг от друга временных точках и выяснили, что в данной модельной системе идет положительный отбор de novo мутаций. По прошествии 8 лет от старта эксперимента суммарно у всех линий P. anserina было выявлено 425 замен, среди которых 132 были классифицированы как несинонимические, 42 – как синонимические, 17 – стоп-кодоны, 19 – короткие инделы, остальные 215 мутаций попали в некодирующие или непроаннотированные области. Наиболее значимой является тенденция к параллельному закреплению мутаций в белок-кодирующих генах независимых линий. Восемь белков, которые влияют на рост и развитие P. anserina, подверглись эволюции более, чем в одной экспериментальной линии. Контрастной по отношению к постоянно возникающим de novo мутациям выглядит чрезвычайная стабильность ключевых морфо-физиологических признаков мицелия P. anserina, адаптированного к условиям эксперимента. В частности, установлено, что состав липидов был достаточно постоянным на протяжении нескольких лет его проведения. Никаких признаков дегенеративных процессов на уровне морфологии и ультраструктуры вегетативного мицелия до сих пор отмечено не было. Мутантные линии сохранили способность утилизировать широкий круг питательных веществ, в частности белков, в качестве единственного источника углерода и азота, несмотря на многолетнее пребывание на стандартной среде, не содержащей ни белков, ни продуктов их гидролиза. Последнее делает гриб P. anserina интересным также и с точки зрения возможности методом лабораторной эволюции оказать воздействие на качество и количество секретируемых протеолитических ферментов. Отталкиваясь от полученных результатов мы выстраиваем дальнейшую работу как новый виток, который позволит вывести её на новый уровень.