![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Эпигенетические исследования призваны установить молекулярные механизмы включения/ выключения генов и адаптивной регуляции функции генома. Актуальными являются эпигенетические исследования регуляции генов, продукты которых вовлечены в патогенез различных, и, в частности, онкологических заболеваний. Новым этапом развития медицинской генетики является формирование эпигенетического подхода, в котором геном описывается как динамичная программа, реализуемая в условиях строго упорядоченных регуляторных взаимоотношений между генами и их продуктами (РНК, белками, надмолекулярными структурами). Задачами проекта являются исследования на молекулярном уровне фундаментальных эпигенетических механизмов функционирования клеток эукариот, многие из которых лежат в основе развития онкологических заболеваний и дают основу для разработки новых подходов к диагностике онкологических заболеваний и идентификации новых мишеней противораковых препаратов следующего поколения. Наши исследования направлены на анализ эпигенетической регуляции транскрипции и репарации генов про- опухолевыми фактороми FACT и PARP1, а также регулятором транскрипции онкосупрессором р53. Будет изучена роль архитектурных белков семейства HMGB и линкерных гистонов в регуляции конформационной динамики хроматина, в том числе во время транскрипции. Новизна проекта определяется постановкой актуальных и практически значимых задач, нацеленных на установление особенностей взаимодействия факторов FACT, PARP1 и р53 друг с другом и с нуклеосомами, т.е. структурами, которые потенциально способны модулировать активацию генов, в том числе при развитии патологий. В рамках проекта взаимодействия FACT, PARP1 и р53 с хроматином будут охарактеризованы как со структурной (влияние на структуру эпигенетически отличающихся нуклеосом), так и с функциональной (влияние на процесс транскрипции) точек зрения.
Planned studies are aimed at analyzing the epigenetic regulation of transcription and gene repair by pro-tumor factors FACT and PARP1, as well as by the transcription regulator and tumor suppressor p53. In addition, the role of architectural proteins of the HMGB family and linker histones in the regulation of chromatin conformational dynamics, including during transcription, will be studied. The novelty of the project is determined by the presence of relevant and practically significant tasks aimed at establishing the features of the interaction of the FACT, PARP1, and p53 factors with each other and with nucleosomes, i.e. structures that are potentially capable of modulating gene activation, including during the development of pathologies. As part of the project, the interactions of FACT, PARP1, and p53 with chromatin will be characterized from both structural (effect on the structure of nucleosomes) and functional (effect on the transcription process) points of view. Using modern physical and chemical methods (microscopy of single particles and their complexes based on Förster resonance energy transfer (FRET), analysis of electrophoretic mobility in the gel (including FRET measurement at the level of individual molecules), footprinting, integrative modeling methods, cryoelectron microscopy) will determine the mechanism of action of the factor FACT, PARP1 and p53 on the structure of nucleosomes, including in the presence of histone variants, regulatory proteins and post-translational modifications. The contribution of the internal mobility of nucleosomes to the dynamics of these processes will be determined and the prerequisites for the activation of genes regulated by these proteins at the nucleosome level will be studied. The influence of the FACT factor on the transcription of nucleosomal DNA containing various DNA lesions will be studied, and the role of various histone regions in this process will be determined. In the course of solving technical, methodological and fundamental scientific problems during the course of the project, FRETbased microscopy techniques for single particles and their complexes will be significantly improved to study the conformational dynamics of nucleosomes, and dynamic models of nucleosome organization will be refined, including details of the internal dynamics of nucleosomes, subnucleosomes (tetrasomes and hexasomes) and the structure of the linker region of DNA.
Полученная нами информация о функционировании FACT и PARP1 на молекулярном и нуклеосомном уровне послужит основой для определения механизмов действия противоопухолевых препаратов. Будет существенно уточнен механизм действия противоопухолевых соединений кураксинов, мишенью которых является FACT, на формирование альтернативных структур ДНК, а также изучено влияние нуклеосом-связывающих пептидов в качестве ингибиторов FACT. Будут определены механизмы действия противоопухолевых препаратов олапариба и велипариба на структуру и стабильность комплексов PARP1 со структурно различными нуклеосомами. Результаты проекта могут служить в качестве основы для последующей разработки оригинальных технологий персонифицированной диагностики и лечения онкологических заболеваний.
Для изучения связывания p53 с ДНК в хроматине на основе 603 нуклеосом-позиционирующей последовательности разработаны и получены нуклеосомы, содержащие сайт связывания p53 из промотора гена CDKN1A, расположенный в различных ротационных ориентациях на нуклеосомной ДНК и на различном расстоянии от границы нуклеосомы. В двух матрицах (R11 и R21, отличающихся расстоянием от границы нуклеосомы до середины сайта связывания р53) реализовано «внутреннее» расположение сайта (на поверхности нуклеосомной ДНК, обращенной к октамеру гистонов), в двух других (R16 и R26) – «внешнее». Для анализа структурных изменений в нуклеосомной ДНК методом микроскопии на основе Фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET-микроскопии) методами компьютерного моделирования определены оптимальные положения составляющих FRET-пару флуоресцентных меток в нуклеосомной ДНК (Cy3 и Cy5): в положениях +67 п.н. и +150 п.н. от границы нуклеосомы. Составлены методики получения и очистки нуклеосом с использованием с димеров Н2А/Н2В и тетрамеров Н3/Н4, выделенных из эритроцитов цыплят, с высоким общим выходом нуклеосомных частиц и сохранением флуоресцентных меток. Получен гомогенный устойчивый к агрегации препарат ДНК-связывающего домена p53 (р53DBD, 22,6 кДа) c чистотой выше 98% и составлен протокол получения комплексов р53DBD с нуклеосомами. Составлена методика сборки комплексов р53DBD-нуклеосома с чистотой, соответствующей требованиям ПЭМ макромолекул.
В рамках проекта будут определены молекулярные основы функционирования про-опухолевого факторов FACT и PARP1, онкосупрессора p53, архитектурных белков семейства HMGB и линкерных гистонов при эпигенетической регуляции генов в хроматине на уровне нуклеосом и изучены механизмы модуляции активности этих белковых комплексов различными факторами. Взаимодействия FACT, PARP1 и р53 с хроматином будут охарактеризованы как со структурной (влияние на структуру нуклеосом), так и с функциональной (влияние на процесс транскрипции) точек зрения.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 13 апреля 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Эпигенетические механизмы биологических процессов и их роль в патогенезе онкологических заболеваний |
Результаты этапа: Изучено влияние вариантов и эпигенетических модификаций гистонов Н3.3, H2A.Z и H3K56Q на структуру нуклеосом. Установлено, что вариантные гистоны изменяют укладку нуклеосомной ДНК на октамере гисто- нов и ее динамику, модулируя стабильность нуклеосом и влияя, вероятно, тем самым на доступность нуклеосомной ДНК для ядерных факторов и на эффективность процессов транскрипции, репликации и репарации ДНК. На примере гистона Н3.3 показано, что вариантные гистоны влияют на способность фермента PARP1 модулировать структуру нуклеосом. Методом spFRET-микроскопии установлено, что линкерный гистон Н1.0, связываясь с нуклеосомой, не только сближает между собой линкерные участки ДНК, но и вносит изменения в структуру нуклеосомной ДНК. Эти структурные изменения происходят по всей длине нуклеосомной ДНК и сопровождаются увеличением расстояния между соседними супервитками ДНК. Установлено, что способность дрожжевого белкового комплекса FACT в присутствии белка Nhp6 к АТФ-независимому разворачиванию нуклеосом является универсальной и не зависит от вида гистонов, на которых сформированы нуклеосомы. Нуклеосомы, собранные на октамерах гистонов Homo sapiens, реорганизуются дрожжевым FACT в присутствии Nhp6 с образованием асимметричной, почти линейной структуры, такой же, как и в случае нуклеосом, собранных на октамерах гистонов Xenopus laevis. Были наработаны и очищены препараты белков HMO1, HMGB1 и полноразмерного yFACT, а также его мутантных форм, содержащих делеции одного или обоих С-концевых фрагментом субъединиц Spt16 и Pob3. Показано, что взаимодействие HMO1 с FACT, которое способствует АТФ-независимому разворачиванию нуклеосом, происходит по С-концам субъединиц Spt16 и Pob3, как и в случае гомологичного белка Nhp6. Апробирована методика дизайна пептидов, связывающихся с кислотным лоскутом нуклеосомы, на основе нейросетевого алгоритма ProteinMPNN. Для сгенерированных нейросетью полипептидных последовательностей с помощью нейросетевого алгоритма AlphaFold предсказаны структуры комплексов этих полипептидов с нукле- осомой. Эти структуры позволят провести in silico скрининг предложенных искусственным интеллектом пептидных последовательностей и отобрать наиболее перспективные пептиды для дальнейших исследований. Для измерения констант связывания флуоресцентно-меченых пептидов с нуклеосомами разработан протокол высокоточных измерений на основе анализа поляризации флуоресценции в малых объемах в планшетном формате. Разработаны программы для анализа данных, полученных в ходе измерений, и для определения константы диссоциации изучаемых комплексов. С использованием разработанного протокола определена константа диссоци- ации комплекса пептида LANA(1-22) с нуклеосомой. Для анализа взаимодействия белков р53 и PARP-1 с нуклеосомами получены флуоресцентно-меченые нуклеосомы,отличающиеся ротационной ориентацией сайта свя- зывания белка p53, расположенного на расстоянии 11 или 16 п.н. от границы нуклеосомы. Методом spFRET-микроскопии охарактеризована конформация линкерной ДНК и ее отличия для этих двух типов нуклеосом. Установлены изменения конформации нуклеосом при различной ротационной ориентации сайта связывания белка p53, и показано, что фермент PARP1 формирует различные комплексы с этими нуклеосомами. Для исследования влияния антираковых препаратов кураксинов на формирование Z-ДНК была создана плазмида, содержащей классическую Z-ДНК-образующую последовательность и разработана экспериментальная система для детекции Z-ДНК в негативно сверхспирализованной плазмидной ДНК. С использованием этой экспериментальной системы было определено, что на сверхспиральной плазмиде pYPCG32 Z-ДНК образуется в ожидаемом положении. Были получены высокочистые активные препараты РНК полимеразы II и фактора транскрипции TFIIS дрожжей. С помощью полимеразной цепной реакции получена матрица для сборки нуклеосом, позволяющая детектировать их положение после транскрипции с помощью рестриктного анализа. Разработан новый, оптимальный протокол флуоресцентного пульс-мечения РНК для анализа РНК-продуктов различной длины, образующихся при транскрипции in vitro. Получены нуклеосомы с однонитевыми разрывами нематричной цепи в положениях +12 и +22 нт от начала нуклеосомы и на них продемонстрирована применимость разработанного метода мечения РНК для изучения остановок РНК полимеразы, индуцируемых разрывом. В ходе экспериментов по транскрипции in vitro определено положение наиболее эффективной ник-индуцированной остановки РНКП при прохождении нуклеосом с разрывом нематричной цепи ДНК после 2 нт от входа в нуклеосому. Методом ПЦР-мутагенеза сконструирована матричная ДНК, позволяющая в ходе транскрипции в условиях ограниченного набора рНТФ получить элонгационный комплекс с РНКП, остановленной в этом положении независимо от наличия разрыва ДНК. Для изучения локальных изгибов центромерной ДНК пекарских дрожжей методом spFRET-микроскопии сконструированы и получены короткие флуоресцентно-меченые дуплексы ДНК с нуклеотидной последовательностью, которая, как предполагается, не вызывает образования изгиба (ранее были получены аналогичные дуплексы с последователь ностью участка центромерной ДНК). Исследования методом spFRET микроскопии показали отсутствие изгиба ДНК в сконструированных «прямых» дуплексах и тем самым дополнительно подтвердили наличие локального из- гиба в участке центромерной ДНК пекарских дрожжей, выявленного ранее методом spFRET микроскопии. | ||
2 | 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. | Эпигенетические механизмы биологических процессов и их роль в патогенезе онкологических заболеваний |
Результаты этапа: Получен препарат белка Nhp6B и изучено его взаимодействие с ДНК. Показано, что связывание белков Nhp6А и Nhp6B приводит к деформации ДНК. Изменения в структуре ДНК, измеренные по эффективности Фёрстеровского резонансного переноса энергии, интерпретировали, как появление изгиба, который больше для Nhp6А, чем для Nhp6B. Изучение образования моно- и ди- тетрасом на тетрамерах гистонов Н3/Н4 X.laevis показало, что при недостатке тетрамера формируются моно- и ди- тетрасомы, а при соотношении 1:2 - только ди-тетрасомы. Показано, что в ди- тетрасомах частично реализуется нуклеосом-подобная укладка супервитков ДНК, а часть ди-тетрасом имеет альтернативную укладку, при которой расстояния между парами нуклеотидов 13/91, 35/112 и 57/135 не соответствуют расстояниям в нуклеосомах, существенно их превышая. Формирование структурированных субнуклеосомных и псевдонуклеосомных частиц с участием тетрамеров гистонов Н3/Н4 предположительно способствует поддержанию структуры хроматина во время ядерных процессов транскрипции и репликации, требующих временной диссоциации- реассоциации ядерных гистонов. Моделирование молекулярной динамики (МД) тетрасомы показало, что тетрамер гистонов стабильно связывает тетрасомную ДНК. При этом в микросекундном масштабе времен возможно динамическое нарушение контактов ДНК с гистонами (аналогично с откручиванием ДНК в нуклеосоме). В этом процессе может участвовать N-хвост гистона H4, препятствуя восстановлению исходных ДНК- гистоновых контактов. Глобулярная часть тетрамера гистонов (H3-H4)2 в составе тетрасомы обладает пластичностью как в вдоль оси супервитка ДНК, так и перпендикулярно ему, что важно для поддержания стабильной структуры тетрасомы в условиях торсионного стресса, связанного со сверх-спирализацией ДНК. Изучено влияние вариантных гистонов H2A.Z и Н3.3, а также миметика ацетилирования H3K56 на структуру нуклеосом, их комплексов с ферментом PARP1, участвующим в репарации ДНК, а также на структуру нуклеосом, высвобождающихся из комплексов с PARP1 в результате реакции поли-АДФ- рибозилирования. Выявлен и описан сложный характер воздействия этих гистонов на структуру нуклеосом и их комплексов, которое в зависимости от типа гистона или их комбинации может вызывать, усиливать, снижать или отменять реорганизацию нуклеосом, существенно модулируя, тем самым, доступ ядерныхИсследование флуоресцентно-меченых кор-нуклеосом, однолинкерных и двухлинкерных нуклеосом в комплексе в линкерным гистоном Н1.0 методами гель- шифт анализа и spFRET-микроскопии показало, что вне зависимости от наличия и числа линкерных участков ДНК образование комплексов стехиометрии 1:1 сопровождается структурными перестройками, затрагивающими всю нуклеосомную ДНК. Установлено, что тетрасомы, как и нуклеосомы, подвергаются реорганизации шапероном гистонов FACT. По данным электронной микроскопии реорганизованные тетрасомы не обладают асимметрией, их структура менее линейная, а их комплексы более компактные в сравнение с реорганизованными FACTом нуклеосомами. Установлено, что HMGB1 способен образовывать комплексы с FACTом (с димером Spt16/Pob3), однако он теряет эту способность при делеции С-концевого фрагмента хотя бы у одной субъединицы димера. Делеция С-концевого фрагмента у субъединицы Spt16 приводит к полной потере способности FACT к АТФ- независимому разворачиванию нуклеосом в присутствии белка HMO1, при сохранении этой активности в присутствии Nhp6. Разворачивания нуклеосом в присутствии HMGB1 мутантами содержащими делеции С-концевых фрагментов субъединиц не происходит. С использованием методов искусственного интеллекта и МД предсказаны последовательность и структура пептидов, нацеленных на связывание с кислотным лоскутом нуклеосом. Два наиболее перспективных пептида были синтезированы и в исследованиях показано их связывание с нуклеосомами с константами диссоциации 20 и 26 мкМ. Пептиды оказывают стабилизирующее действие на структуру нуклеосом. Установлено, что образование комплекса нуклеосом с PARP1 не препятствует связыванию c нуклеосомами ДНК-связывающего домена белка p53, которое не приводит к вытеснению PARP1 из комплексов. В тройных комплексах р53- нуклеосома-PARP1 происходит ограниченная реорганизация структуры нуклеосомы в области линкерной ДНК, не сопровождающаяся масштабным разворачиванием нуклеосомной ДНК. Показано, что кураксины CBL0100 и CBL0137 значительно понижают уровень сверхспирализации ДНК. Установлено, что кураксин CBL0137 приводит к ингибированию формирования Z-ДНК при концентрациях CBL0137 более 0,5 мкМ. Определено, что инкубация нуклеосом в присутствии CBL0137 приводит сначала к обратимому (3,5 и 5 мкМ), а потом необратимому (10 мкМ) разворачиванию нуклеосомной ДНК. Проведен сравнительный анализ транскрипции через нуклеосому в трёх описанных в литературе минимальных транскрипционных системах. Показано, что транскрипция через нуклеосому с использованием элонгационного комплекса (ЭК) на матрице с комплементарными цепями ДНК идёт с остановкой в районе +45 п.н. относительно входа в нуклеосому и сохранением наиболее приближенного к нативному паттерна паузирования. В результате сборки ЭК с некомплементарнымицепями ДНК или с выступающим концом ДНК при транскрипции через нуклеосому происходит изменение паттерна нуклеосом-специфических задержек РНК-полимеразы II. Определена роль субъединиц дрожжевого белкового комплекса FACT в транскрипции нуклеосом, содержащих однонитевые разрывы в нематричной цепи ДНК. Разработан протокол получения высокоочищенных концентрированных образцов ЭК+20 с однонитевым разрывом нематричной цепи ДНК в положении +12, соответствующих требованиям криоэлектронной микроскопии. Получены комплексы нуклеосом и элонгирующей РНК-полимеразы, в которых фермент остановлен в положении, соответствующем позиции наиболее выраженной спонтанной остановки РНКП при транскрипции нуклеосом с разрывом нематричной цепи ДНК после 2 нт от входа в нуклеосому. Отличия в структуре комплексов с разрывом ДНК и без него охарактеризованы методом ПЭМ. С помощью разработанных методических подходов установлено наличие протяженного изгиба в центромерной ДНК третьей хромосомы пекарских дрожжей, который локализован в районе диады и прилежащем к ней участке ДНК центромерной нуклеосомы. С разрешением 4 Å получена первая структура нуклеосомы с нуклеосом- позиционирующей последовательностью (НПП) 603. Эта НПП широко применяется в исследования транскрипции через нуклеосомы. Нуклеосомы с НПП 603 схожи по структуре с другими известными нуклеосомами, но характеризуются большей подвижность ДНК. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".