Эпигенетические механизмы биологических процессов и их роль в патогенезе онкологических заболеванийНИР

Epigenetic mechanisms of biological processes and their role in pathogenesis of oncological disease

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 13 апреля 2023 г.-31 декабря 2023 г. Эпигенетические механизмы биологических процессов и их роль в патогенезе онкологических заболеваний
Результаты этапа: Изучено влияние вариантов и эпигенетических модификаций гистонов Н3.3, H2A.Z и H3K56Q на структуру нуклеосом. Установлено, что вариантные гистоны изменяют укладку нуклеосомной ДНК на октамере гисто- нов и ее динамику, модулируя стабильность нуклеосом и влияя, вероятно, тем самым на доступность нуклеосомной ДНК для ядерных факторов и на эффективность процессов транскрипции, репликации и репарации ДНК. На примере гистона Н3.3 показано, что вариантные гистоны влияют на способность фермента PARP1 модулировать структуру нуклеосом. Методом spFRET-микроскопии установлено, что линкерный гистон Н1.0, связываясь с нуклеосомой, не только сближает между собой линкерные участки ДНК, но и вносит изменения в структуру нуклеосомной ДНК. Эти структурные изменения происходят по всей длине нуклеосомной ДНК и сопровождаются увеличением расстояния между соседними супервитками ДНК. Установлено, что способность дрожжевого белкового комплекса FACT в присутствии белка Nhp6 к АТФ-независимому разворачиванию нуклеосом является универсальной и не зависит от вида гистонов, на которых сформированы нуклеосомы. Нуклеосомы, собранные на октамерах гистонов Homo sapiens, реорганизуются дрожжевым FACT в присутствии Nhp6 с образованием асимметричной, почти линейной структуры, такой же, как и в случае нуклеосом, собранных на октамерах гистонов Xenopus laevis. Были наработаны и очищены препараты белков HMO1, HMGB1 и полноразмерного yFACT, а также его мутантных форм, содержащих делеции одного или обоих С-концевых фрагментом субъединиц Spt16 и Pob3. Показано, что взаимодействие HMO1 с FACT, которое способствует АТФ-независимому разворачиванию нуклеосом, происходит по С-концам субъединиц Spt16 и Pob3, как и в случае гомологичного белка Nhp6. Апробирована методика дизайна пептидов, связывающихся с кислотным лоскутом нуклеосомы, на основе нейросетевого алгоритма ProteinMPNN. Для сгенерированных нейросетью полипептидных последовательностей с помощью нейросетевого алгоритма AlphaFold предсказаны структуры комплексов этих полипептидов с нукле- осомой. Эти структуры позволят провести in silico скрининг предложенных искусственным интеллектом пептидных последовательностей и отобрать наиболее перспективные пептиды для дальнейших исследований. Для измерения констант связывания флуоресцентно-меченых пептидов с нуклеосомами разработан протокол высокоточных измерений на основе анализа поляризации флуоресценции в малых объемах в планшетном формате. Разработаны программы для анализа данных, полученных в ходе измерений, и для определения константы диссоциации изучаемых комплексов. С использованием разработанного протокола определена константа диссоци- ации комплекса пептида LANA(1-22) с нуклеосомой. Для анализа взаимодействия белков р53 и PARP-1 с нуклеосомами получены флуоресцентно-меченые нуклеосомы,отличающиеся ротационной ориентацией сайта свя- зывания белка p53, расположенного на расстоянии 11 или 16 п.н. от границы нуклеосомы. Методом spFRET-микроскопии охарактеризована конформация линкерной ДНК и ее отличия для этих двух типов нуклеосом. Установлены изменения конформации нуклеосом при различной ротационной ориентации сайта связывания белка p53, и показано, что фермент PARP1 формирует различные комплексы с этими нуклеосомами. Для исследования влияния антираковых препаратов кураксинов на формирование Z-ДНК была создана плазмида, содержащей классическую Z-ДНК-образующую последовательность и разработана экспериментальная система для детекции Z-ДНК в негативно сверхспирализованной плазмидной ДНК. С использованием этой экспериментальной системы было определено, что на сверхспиральной плазмиде pYPCG32 Z-ДНК образуется в ожидаемом положении. Были получены высокочистые активные препараты РНК полимеразы II и фактора транскрипции TFIIS дрожжей. С помощью полимеразной цепной реакции получена матрица для сборки нуклеосом, позволяющая детектировать их положение после транскрипции с помощью рестриктного анализа. Разработан новый, оптимальный протокол флуоресцентного пульс-мечения РНК для анализа РНК-продуктов различной длины, образующихся при транскрипции in vitro. Получены нуклеосомы с однонитевыми разрывами нематричной цепи в положениях +12 и +22 нт от начала нуклеосомы и на них продемонстрирована применимость разработанного метода мечения РНК для изучения остановок РНК полимеразы, индуцируемых разрывом. В ходе экспериментов по транскрипции in vitro определено положение наиболее эффективной ник-индуцированной остановки РНКП при прохождении нуклеосом с разрывом нематричной цепи ДНК после 2 нт от входа в нуклеосому. Методом ПЦР-мутагенеза сконструирована матричная ДНК, позволяющая в ходе транскрипции в условиях ограниченного набора рНТФ получить элонгационный комплекс с РНКП, остановленной в этом положении независимо от наличия разрыва ДНК. Для изучения локальных изгибов центромерной ДНК пекарских дрожжей методом spFRET-микроскопии сконструированы и получены короткие флуоресцентно-меченые дуплексы ДНК с нуклеотидной последовательностью, которая, как предполагается, не вызывает образования изгиба (ранее были получены аналогичные дуплексы с последователь ностью участка центромерной ДНК). Исследования методом spFRET микроскопии показали отсутствие изгиба ДНК в сконструированных «прямых» дуплексах и тем самым дополнительно подтвердили наличие локального из- гиба в участке центромерной ДНК пекарских дрожжей, выявленного ранее методом spFRET микроскопии.
2 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Эпигенетические механизмы биологических процессов и их роль в патогенезе онкологических заболеваний
Результаты этапа: Получен препарат белка Nhp6B и изучено его взаимодействие с ДНК. Показано, что связывание белков Nhp6А и Nhp6B приводит к деформации ДНК. Изменения в структуре ДНК, измеренные по эффективности Фёрстеровского резонансного переноса энергии, интерпретировали, как появление изгиба, который больше для Nhp6А, чем для Nhp6B. Изучение образования моно- и ди- тетрасом на тетрамерах гистонов Н3/Н4 X.laevis показало, что при недостатке тетрамера формируются моно- и ди- тетрасомы, а при соотношении 1:2 - только ди-тетрасомы. Показано, что в ди- тетрасомах частично реализуется нуклеосом-подобная укладка супервитков ДНК, а часть ди-тетрасом имеет альтернативную укладку, при которой расстояния между парами нуклеотидов 13/91, 35/112 и 57/135 не соответствуют расстояниям в нуклеосомах, существенно их превышая. Формирование структурированных субнуклеосомных и псевдонуклеосомных частиц с участием тетрамеров гистонов Н3/Н4 предположительно способствует поддержанию структуры хроматина во время ядерных процессов транскрипции и репликации, требующих временной диссоциации- реассоциации ядерных гистонов. Моделирование молекулярной динамики (МД) тетрасомы показало, что тетрамер гистонов стабильно связывает тетрасомную ДНК. При этом в микросекундном масштабе времен возможно динамическое нарушение контактов ДНК с гистонами (аналогично с откручиванием ДНК в нуклеосоме). В этом процессе может участвовать N-хвост гистона H4, препятствуя восстановлению исходных ДНК- гистоновых контактов. Глобулярная часть тетрамера гистонов (H3-H4)2 в составе тетрасомы обладает пластичностью как в вдоль оси супервитка ДНК, так и перпендикулярно ему, что важно для поддержания стабильной структуры тетрасомы в условиях торсионного стресса, связанного со сверх-спирализацией ДНК. Изучено влияние вариантных гистонов H2A.Z и Н3.3, а также миметика ацетилирования H3K56 на структуру нуклеосом, их комплексов с ферментом PARP1, участвующим в репарации ДНК, а также на структуру нуклеосом, высвобождающихся из комплексов с PARP1 в результате реакции поли-АДФ- рибозилирования. Выявлен и описан сложный характер воздействия этих гистонов на структуру нуклеосом и их комплексов, которое в зависимости от типа гистона или их комбинации может вызывать, усиливать, снижать или отменять реорганизацию нуклеосом, существенно модулируя, тем самым, доступ ядерныхИсследование флуоресцентно-меченых кор-нуклеосом, однолинкерных и двухлинкерных нуклеосом в комплексе в линкерным гистоном Н1.0 методами гель- шифт анализа и spFRET-микроскопии показало, что вне зависимости от наличия и числа линкерных участков ДНК образование комплексов стехиометрии 1:1 сопровождается структурными перестройками, затрагивающими всю нуклеосомную ДНК. Установлено, что тетрасомы, как и нуклеосомы, подвергаются реорганизации шапероном гистонов FACT. По данным электронной микроскопии реорганизованные тетрасомы не обладают асимметрией, их структура менее линейная, а их комплексы более компактные в сравнение с реорганизованными FACTом нуклеосомами. Установлено, что HMGB1 способен образовывать комплексы с FACTом (с димером Spt16/Pob3), однако он теряет эту способность при делеции С-концевого фрагмента хотя бы у одной субъединицы димера. Делеция С-концевого фрагмента у субъединицы Spt16 приводит к полной потере способности FACT к АТФ- независимому разворачиванию нуклеосом в присутствии белка HMO1, при сохранении этой активности в присутствии Nhp6. Разворачивания нуклеосом в присутствии HMGB1 мутантами содержащими делеции С-концевых фрагментов субъединиц не происходит. С использованием методов искусственного интеллекта и МД предсказаны последовательность и структура пептидов, нацеленных на связывание с кислотным лоскутом нуклеосом. Два наиболее перспективных пептида были синтезированы и в исследованиях показано их связывание с нуклеосомами с константами диссоциации 20 и 26 мкМ. Пептиды оказывают стабилизирующее действие на структуру нуклеосом. Установлено, что образование комплекса нуклеосом с PARP1 не препятствует связыванию c нуклеосомами ДНК-связывающего домена белка p53, которое не приводит к вытеснению PARP1 из комплексов. В тройных комплексах р53- нуклеосома-PARP1 происходит ограниченная реорганизация структуры нуклеосомы в области линкерной ДНК, не сопровождающаяся масштабным разворачиванием нуклеосомной ДНК. Показано, что кураксины CBL0100 и CBL0137 значительно понижают уровень сверхспирализации ДНК. Установлено, что кураксин CBL0137 приводит к ингибированию формирования Z-ДНК при концентрациях CBL0137 более 0,5 мкМ. Определено, что инкубация нуклеосом в присутствии CBL0137 приводит сначала к обратимому (3,5 и 5 мкМ), а потом необратимому (10 мкМ) разворачиванию нуклеосомной ДНК. Проведен сравнительный анализ транскрипции через нуклеосому в трёх описанных в литературе минимальных транскрипционных системах. Показано, что транскрипция через нуклеосому с использованием элонгационного комплекса (ЭК) на матрице с комплементарными цепями ДНК идёт с остановкой в районе +45 п.н. относительно входа в нуклеосому и сохранением наиболее приближенного к нативному паттерна паузирования. В результате сборки ЭК с некомплементарнымицепями ДНК или с выступающим концом ДНК при транскрипции через нуклеосому происходит изменение паттерна нуклеосом-специфических задержек РНК-полимеразы II. Определена роль субъединиц дрожжевого белкового комплекса FACT в транскрипции нуклеосом, содержащих однонитевые разрывы в нематричной цепи ДНК. Разработан протокол получения высокоочищенных концентрированных образцов ЭК+20 с однонитевым разрывом нематричной цепи ДНК в положении +12, соответствующих требованиям криоэлектронной микроскопии. Получены комплексы нуклеосом и элонгирующей РНК-полимеразы, в которых фермент остановлен в положении, соответствующем позиции наиболее выраженной спонтанной остановки РНКП при транскрипции нуклеосом с разрывом нематричной цепи ДНК после 2 нт от входа в нуклеосому. Отличия в структуре комплексов с разрывом ДНК и без него охарактеризованы методом ПЭМ. С помощью разработанных методических подходов установлено наличие протяженного изгиба в центромерной ДНК третьей хромосомы пекарских дрожжей, который локализован в районе диады и прилежащем к ней участке ДНК центромерной нуклеосомы. С разрешением 4 Å получена первая структура нуклеосомы с нуклеосом- позиционирующей последовательностью (НПП) 603. Эта НПП широко применяется в исследования транскрипции через нуклеосомы. Нуклеосомы с НПП 603 схожи по структуре с другими известными нуклеосомами, но характеризуются большей подвижность ДНК.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".