ИСТИНА

Целью исследования является разработка принципиально нового типа генетически кодируемых биосенсоров для мультипараметрического исследования редокс-событий in vivo с применением подходов флуоресцентной микроскопии и спектроскопии КР. Для реализации проекта будут решены следующие задачи: (1) Анализ и отбор бактериальных сенсорных белков, функционирование которых обеспечивают гемовые группы и/или железо-серные кластеры, взаимодействующие с низкомолекулярными редокс-активными соединениями, например, с оксидами азота и углерода, супероксид анион-радикалом и др. Домены данных белков будут использованы для создания сенсорных систем; (2) Изучение спектральных характеристик указанных функциональных групп в разрабатываемых сенсорах, вызванных взаимодействием с целевым аналитом; (3) Исследование динамики аналита по флуоресцентному и КР сигналам биосенсоров, определение селективности и оптимальных условий применения сенсоров; (4) разработка нового комплексного методического подхода, основанного на регистрации спектров КР от дыхательной цепи митохондрий, спектров КР и флуоресценции разработанных сенсоров на активные формы азота и кислорода в условиях in vivo; (5) применение новых биосенсоров совместно с уже имеющимися биосенсорами на компоненты окислительного стресса для одновременной регистрации нескольких редокс-параметров в клетках in vivo; (6) изучение роли активных форм кислорода и азота в регуляции нейроглиоваскулярных взаимодействий в мозге мышей в норме и при патологиях.

This project is interdisciplinary and combines approaches from molecular biology, biochemistry, cellular biophysics and physiology, as well as modern optical research methods. Employees of the Department of Biochemistry will design a new type of protein biosensors that allow assessing changes in a certain biochemical parameter by changing the spectral properties of functional groups in their structures and will carry out their molecular assembly at the genetic level. The developed biosensors will be studied using Raman and SERS spectroscopy and fluorescence microscopy at the Department of Biophysics using in vitro and ex vivo preparations; optimal conditions for using the proposed sensors will be selected and their sensitivity limits will be determined. The developed genetically encoded tools will be used in in vivo models on neurons and glial cells of the cortex and hippocampus of rodents, either alone or in combination with fluorescent biosensors already available in the world collection. A multiparametric approach to studying redox processes in living systems will be developed using combined biological and physical approaches. The results obtained during the project will have important fundamental and applied significance and will be used in various applied biomedical studies aimed at studying the mechanisms of pathologies associated with mitochondria and changing the redox status of cells. This project is interdisciplinary in nature, since its implementation will develop new types of genetically encoded sensors, develop innovative integrated methodological approaches and, in parallel, conduct new detailed fundamental studies of redox processes underlying the interaction of neurons, glial cells and blood vessels in vivo. Thus, using the methods of genetic engineering and classical biochemistry, fundamentally new biosensors will be developed that have a fluorescence signal and Raman scattering, sensitive to certain active forms of oxygen and nitrogen. This “duality” of biosensors will increase their sensitivity and selectivity when used in vivo. To characterize the created biosensors, a variety of optical methods will be used: varieties of fluorescence micro- and spectroscopy, Raman spectroscopy and giant Raman spectroscopy. To test the developed biosensors in in vivo conditions, as well as to conduct fundamental scientific research on the role of reactive forms of nitrogen and oxygen in the regulation of intercellular interactions in the brain, complex physiological, microsurgical, biophysical and spectral methods and approaches will be used, such as: craniotomy, administration of adeno-associated viruses encoding biosensors into various parts of the rodent brain, two-photon fluorescence microscopy and Raman microspectroscopy.

В ходе реализации проекта будут получены принципиально новые генетически кодируемые инструменты для регистрации окислительно-восстановительных параметров в биологических системах любого уровня сложности: от органелл единичных клеток до тканей трансгенных организмов. Такой инструмент будет представлять химерную молекулу, состоящую из трех доменов разных белков, соединенных линкерными последовательностями. Флуоресцентная часть молекулы будет представлять уже созданный к настоящему моменту какой-либо из биосенсоров на основе флуоресцентного белка. Флуоресцентный домен позволит визуализировать экспрессию гена и последующую локализацию сенсора в системе. Кроме того, динамика флуоресцентного сигнала будет отображать динамику определенного параметра (в зависимости от того, на базе какого из имеющихся биосенсоров мы будем разрабатывать новый инструмент). Функционирование дополнительного сенсорного домена в составе такого инструмента и, следовательно, дополнительный регистрируемый параметр можно будет отслеживать с помощью спектроскопии КР. Многие природные сенсорные белки из бактерий представляют собой факторы транскрипции, которые запускают транскрипционный ответ при взаимодействии с определенным биохимическим параметром. Некоторые из таких белков в качестве функциональной части содержат железо-серные кластеры, гемовые группы, что затрудняет их использование для разработки классических флуоресцентных белков, но может быть применено для основы сенсора, сигнал которого будет отслеживаться с применением спектроскопии комбинационного рассеяния. Мы проанализируем структуры нескольких таких бактериальных белков и создадим библиотеку первичных версий химерных конструкций с дальнейшей оценкой их спектральных и оптических свойств. Таким образом, мы впервые создадим молекулярный инструмент, который будет использован в сочетании флуоресцентной микроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния. Описываемый подход позволит вывести исследования биохимических процессов на новый уровень, особенно в контексте исследований in vivo с участием разных типов высоко реакционноспособных соединений с коротким временем жизни. Одновременно с разработкой принципиально нового типа генетически кодируемых инструментов мы будем создавать и развивать подходы, объединяющие преимущества флуоресцентной микроскопии и микроспектроскопии КР. С помощью созданных к настоящему моменту биосенсоров на основе флуоресцентных белков и возможностей спектроскопии КР мы исследуем динамику некоторых внутриклеточных окислительно-восстановительных параметров при физиологических и патологических процессах. Данная технология будет отработана как в культуре клеток (разные типы клеток, в том числе первичные культуры кардиомиоцитов и нейронов), так и в тканях лабораторных животных (грызунов). В качестве патологических процессов будут применены модели ишемии, воспалительных реакций и нейродегенераций. Данный подход позволит впервые выявить пространственно-временную динамику некоторых окислительно-восстановительных событий в исследуемой системе одновременно. Так, впервые будут получены данные о взаимосвязи редокс-состояния митохондрий и пространственно-временной динамики появления активных форм кислорода (Н2О2 и др.), галогенов (HOCl, HOBr и их производных), серы (H2Sn, и др.) и азота (NO) в нейронах и астроцитах мозга мышей in vivo при физиологических воздействиях, при гипоксии и нейродегенерациях (болезни Альцгеймера и естественном старении). Полученные данные расширят современные представления о нейроглиоваскулярных взаимодействиях и роли активных форм кислорода, серы и азота в регуляции нормальных межклеточных взаимодействий и при развитии патологий; Достижимость указанных результатов обеспечивается тем, что образованный научный коллектив имеет большой опыт во всех областях данного проекта. Так, члены научного коллектива (кафедра биохимии) имеют большой опыт дизайне и получении различных белковых биосенсоров, позволяющих оценивать изменения различных внутриклеточных молекул с митохондриальной или цитоплазматической локализацией по изменению спектральных свойств функциональных групп в составе их структуры. Также научный коллектив имеет многолетний опыт в исследовании редокс-, конформационных и функциональных свойств биомакромолекул, включая комплексы дыхательной цепи митохондрий, в клетках разных типов in vitro и in vivo. Нами разработано открытое программное обеспечение, позволяющее проводить обработку и анализ спектров КР и изображений с выполнением картирования клеток по определенному маркеру спектров КР. Кроме того, мы впервые разработали использование комбинированного подхода in vivo, заключенного в идентификации клеток по характерным спектрам флуоресценции, детекции изменений интенсивности флуоресценции и регистрации спектров и карт КР с последующим анализом и получением информации о редокс-состоянии различных комплексов дыхательной цепи митохондрий.

Наш научный коллектив имеет уникальный опыт по созданию новых генетически-кодируемых конструкций, являющихся сенсорами на различные активные формы кислорода, хлора и проч, которые в настоящее время уже широко используются для исследования редокс-процессов в клетках in vitro и in vivo. При помощи разработанных сенсоров мы продемонстрировали их эффективность в разнообразных исследованиях воспалительных процессов, а также реакциях, развивающихся при гипоксии. Кроме того, наш научный коллектив имеет большой опыт исследований редокс-,конформационных и функциональных свойств биомакромолекул, включая комплексы ЭТЦ, в клетках разных типов in vitro и in vivo. Нами разработано открытое программное обеспечение, позволяющее проводить обработку и анализ Рамановских спектров и изображений с выполнением картирования клеток по определенному Рамановскому В настоящее время практически отсутствуют исследования, осуществляемые при помощи Рамановской спектроскопии in vivo, в особенности на клетках мозга. Также мы впервые разработали использование комбинированного подхода in vivo, заключенного в тканеспецифичной экспрессии в клетках флуоресцентных белков или флуоресцентных сенсоров, идентификации клеток по характерным спектрам флуоресценции, детекции изменений интенсивности флуоресценции и регистрации Рамановских спектров или карт.

В рамках проекта будет разработан новый тип генетически кодируемых инструментов для применения в биологических системах любого уровня сложности. Технология применения нового типа инструментов будет сочетать методы флуоресцентной микроскопии и Рамановской спектроскопии. На начальном этапе прежде всего будут разрабатываться биосенсоры для регистрации окислительно-восстановительных событий. В частности, к существующим на данный момент биосенсорам, например, к сенсору на пероксид водорода или хлорноватистую кислоту, будут добавлены домены, которые позволят регистрировать одновременно в этой же системе с помощью Рамановской спектроскопии дополнительные окислительно-восстановительные параметры (например, образование оксида азота или супероксид анион радикала, изменение свободных ионов железа при ферроптозе и т.д.). Генетически кодируемые инструменты просты в применении, с помощью стандартных трансфекционных агентов они могут быть доставлены в любые типы клеток. Применение вирусной системы доставки позволяет экспрессировать гены биосенсоров в тканях животных. Флуоресцентные биосенсоры нередко «сшивают» на уровне гена с белком интереса, в многочисленных работах неоднократно было продемонстрировано, что функции белков при этом изменяются незначительно или не изменяются вовсе. Таким образом, введение в имеющийся биосенсор дополнительного домена через специально подобранный линкерный участок представляется выполнимой задачей. В дальнейшем свойства всех полученных химерных белков будут детально нами охарактеризованы как в условиях in vitro, так в культивируемых клетках. Главной целью настоящего проекта является внедрение описываемой технологии в модели in vivo, поскольку все сигнальные процессы, включая редокс-реакции, протекающие как при нормальных, так и при патологических состояниях, существенным образом зависят от клеточного окружения и могут отличаться для клеточных культур и моделей in vivo.