| Результаты этапа: Итоги выполнения этапа в отчете по данному гранту РНФ:
1) Были созданы генетические конструкции, кодирующие человеческие ламин А, ламин В1 и прогерин, слитые с флуоресцентными белками (GFP, mRFP, mKate). На основе клеточных линий ракового (аденокарцинома человека HeLa, фибросаркома человека HT1080, аденокарцинома MCF-7) и нормального происхождения (эмбриональная почка свиньи) были получены и субклонированы клеточные линии, стабильно экспрессирующие данные химерные белки. Экспрессия целевых белков была подтверждена вестерн-блоттингом, их специфическая локализация подтверждена методами широкопольной флуоресцентной микроскопии и конфокальной микроскопии (рисунок 1).
2) созданы конструкции для нокдауна ламина А, В1 и B2 человека при помощи shRNA.. Для этого в вектор pG-Shin2 (Kojima et al., 2004, любезно предоставлен Е.С. Надеждиной) встроили следующие целевые последовательности:
LMNA T1, 5’-AGCAGTCTCTGTCCTTCGA-3’ (ген ламина A/C человека);
LMNA T8, 5’-ATGATCCCTTGCTGACTTA-3’ (ген ламина A/C человека);
LMNB1 T3, 5’- CGAGCATCCTCAAGTCGTA-3’ (ген ламина B1 человека);
LMNB1 T4, 5’-GAATCAGAGGCGAGTAGTA- 3’ (ген ламина B1 человека);
LMNB2 T7, 5’-CGGTGATGCGTGAGAAT GA-3’ (ген ламина B2 человека);
LMNB2 T8, 5’-TCAAGAACAACTCGGA CAA-3’ (ген ламина B2 человека);
Последовательность Neg-ctrl, 5’-ATGTACTGCGCGTGGA GA-3 использовали в качестве рандомизированного негативного контроля.
Последовательность петли между прямой и комплементарной последовательностями были 5’-GCTTCCTGTCAC-3’ (для LMNA T1 и T8) или 5’-TTCAA GAGA-3’ (для остальных). Короткие шпилечные РНК были вставлены по сайтам рестрикции HindIII и BglII.
По результатам проведенного анализа было показано, что все сконструированные плазмиды позволяют подавить экспрессию соответствующих целевых ламинов в трансфецированных клетках линии HEK 293, однако с разной эффективностью. Согласно результатам иммунофлуоресцентного анализа с использованием поликлональных антител против соответствующих белков, наиболее глубокое подавление экспрессии ламинов удалось достигнуть при помощи плазмид LMNA T1, LMNB1 T4 и LMNB2 T7 на 4 день после трансфекции. Эти условия предполагается использовать в дальнейшем для изучения миграции клеток на фоне РНК-интерференции ламинов. Поскольку данные конструкции экспрессируют также GFP, уровень которого, по данным микроскопического анализа, коррелирует со степенью подавления экспрессии целевых белков, данные конструкции будут использоваться в экспериментах по исследованию миграции клеток в формате высокоэффективного микроскопического скрининга с возможностью поклеточного анализа корреляции между скоростью миграции и уровнем подавления экспрессии белков ламины.
3) Первичный анализ влияния уровня экспрессии ламина А на клеточную подвижность проводился с использованием метода scratch assay в формате автоматического высокопроизводительного микроскопического скрининга. В данных экспериментах использовались гетерогенные популяции клеток фибросакомы человека HT1080, клетки которых экспреccировали GFP-ламин А на разном уровне (определяемом по интенсивности флуоресценции GFP на 1 мкм площади ядра). Такой подход (по сравнению с анализом гомогенных популяций в классическом scratch assay, где подвижность клеток оценивается по изменению ширины экспериментальной раны) позволяет более эффективно использовать возможности высокопроизводительного микроскопического скрининга и анализа подвижности индивидуальных клеток для получения статистически значимых результатов.
Для проведения эксперимента трансфецированные клетки высевали на чашку Петри со стеклянным дном толщиной 0.17 мм и по достижении 80-10% конфлюэнтности наносили экспериментальную рану шириной 350-650 мкм (рисунок 2). Анализ подвижности клеток осуществляли с использованием моторизованного инвертированного флуоресцентного микроскопа Eclipse Ti-E (Nikon, Япония), оборудованного EM CCD камерой DU-897 (Andor Technology, Ирландия) и климатической камерой с контролем температуры и газового состава (Tokai Hit, Япония), под контролем программного обеспечения Nis-Elements 4.60 c модулем для высокопроизводительного скрининга JOBS. Автоматическую съемку 80 полей зрения (суммарная площадь 72 000 мкм2) вокруг зоны раны осуществляли в течение 12-24 часов с использованием 40X фазовоконтрастного объектива в двух режимах: съемка фазово контрастного изображения проводилась каждые 5 минут, флуоресценции в канале возбуждения 488 нм - каждый час. Режимы съемки (интенсивность освещения, частота кадров, время экспозиции) были подобраны ранее для минимизации фототоксических эффектов (Zhironkina et al, 2016).
Анализ полученных изображений проводили в программе ImageJ. Сшивка панорамного изображения и двух каналов проходила автоматически. Далее вручную мы измеряли среднюю интенсивность флуоресценции в начальной точке и строили треки движения клеток с помощью пакета Tracking-Manual Tracking, который помимо треков вычислял расстояние, пройденное клеткой. Средние скорости миграции определяли путем определения пути, пройденного каждой клеткой за 4 часа (рисунок 3). В качестве контроля были использованы не трансфецированные клетки, средняя интенсивность флуоресценции GFP-ламин А у которых не превышала уровня фона. Обработка результатов и построение графиков проводились в программах Microsoft Excel и GraphPad Prism 6. Все данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение.
В результате анализа около 2000 треков было показано, что подвижность клеток дикого типа на двумерном субстрате в 2.5 раза выше, чем подвижность клеток, экспрессирующих GFP-меченный ламин А, вне зависимости от количества дополнительного ламина А (рисунок 4). В настоящее время разрабатываются программные модули анализа данных scratch assay для автоматического анализа клеточной подвижности не только от уровня экспрессии ламинов, но и от локальной плотности клеточной популяции.
Разработанные алгоритмы высокопроизводительного скрининга были также использованы применительно к клеточной популяции, экспрессирующей GFP-прогерин, в настоящий момент проводится обработка полученных массивов данных. В дальнейшем разработанные схемы экспериментов будут использованы для анализа подвижности клеток в микрофлюидных камерах с микроканалами.
4) Оптимизирована процедура пробоподготовки для двойного мечения хроматина и белков ядерной оболочки для электронномикроскопического анализа. Для этой цели использовалась детекция экзогенного GFP-ламина А (с использованием мышиных моноклональных антител против GFP) и митоз-специфичной модификации гистона Н3, фосфорилированной по серину 10. Выбор данной пары мишеней дает возможность легко оценивать качество детекции (уровень контраста, соотношение сигнал/шум) благодаря наличию "внутренних контролей" - клеток, не несущих специфического сигнала (нетрансфецированные клетки в случае GFP-ламин А, и интерфазные ядра в случае H3S10ph). Для одновременной визуализации двух мишеней использовали вторичные антитела, коньюгированные с 1.4 нм-частицами золота (для GFP-ламина А) и с пероксидазой хрена (для H3S10ph). Визуализацию наночастиц золота осуществляли с помощью Ag-амплификации по методу Dansher (1984). Поскольку данный протокол несовместим с методами выявления активности пероксидазы на ультраструктурном уровне из-за окисления серебра тетраокисью осмия, перед проявлением пероксидазы применялась импрегнация хлорным золотом. Далее были оптимизированы условия окисления диаминобензидина (ДАБ) для получения максимального контраста с минимизацией диффузии контрастера и условия импрегнации осмием. В последнем случае применялись протоколы OTO или OTOTO. В результате серии тестовых экспериментов были определены оптимальные концентрации реагентов и условий инкубации для достижения наилучшего контраста при минимальной степени деградации серебряных наночастиц (рисунок 5).
5) Разработан дизайн микрофлюидных камер для прижизненного анализа изменений морфологии ядер клеток при движении в узких каналах. За основу был взят дизайн, описанный в работе Iserman et al, 2012. Модификации, внесенные в оригинальную конструкцию, касаются в первую очередь расположения и ширины входных и выходных каналов для обеспечения более стабильного и равномерного градиента хемоаттрактантов и эффективного заполнения камеры для наблюдений клетками. Кроме того, отдельное внимание было уделено оптимизации параметров обходного канала, задача которого состоит в поддержании постоянного давления в камере для наблюдения в процессе загрузки ее клетками (рисунок 6). Параметры микроканалов в камере для наблюдения были выбраны исходя из данных о микрации клеток в камерах Бойдена.
6) Проведено молекулярное моделирование структуры ZMPSTE24 в липидном бислое. Для ZMPSTE24 человека в банке данных рентгенографических структур PDB представлены две трехмерные структуры, которые не содержат мутаций. В структуре 4AW6 отсутствуют N- и С-концевые остатки и участки 107-114 и 285-320. В структуре 5SYT N-концевой участок с 1 по 8 остаток и два участка в середине последовательности — 265-273 и 292-309. Отсутствующие в структурах участки 285-320 (L1) и 265-273 (L2) располагаются близко как к активному центру, так и к интерфейсу между белком и мембраной, поэтому могут играть важную роль в расположении белка в бислое, а также в доставке субстратов. Таким образом, первоочередной задачей является получение полной трехмерной модели белка в мембране, отражающей все особенности фермента, а также содержащей все участки аминокислотной последовательности.
Структура фермента была построена в программе MODELLER на основе аминокислотной последовательности ZMPSTE24 человека с использованием структур 4aw6 и 5syt. На основе 4aw6, содержащей петлю L2, и полной последовательности фермента была построена предварительная модель, которая еще не содержала петлю L1. Cтруктура, содержащая эту петлю, была создана с помощью класса automodel программного пакета MODELLER на основе модели, полученной на предыдущем шаге, в качестве шаблона, а также структуры 5syt, которая содержит участки 285-292 и 309-320 петли L1. Конечная полная модель фермента использовалась в работе (рисунок 7).
Поскольку зарядовые состояния ряда аминокислот зависят от значения pH среды, для различных состояний одних и тех же остатков в белковых силовых полях Amber были подготовлены соответствующие параметры в каждом из случаев. Для расчета таких состояний использовалась программа pdb2pqr, которая подготавливает структуру белка в терминах заданного силового поля при определенном pH. Зарядовые состояния были рассчитаны для pH = 7. Так как данный метод не учитывает атом цинка в активном центре фермента, то при таком значении pH два остатка гистидина His335 и His339, отвечающие за координацию иона металла, протонируются программой в δ (дельта) положении. Однако на основе анализа структур ZMPSTE24 было установлено, что данные остатки должны быть протонированы в ε (ипсилон) положении (рисунок 8). Поэтому зарядовые состояния His335 и His339 были установлены в ε-положение вручную.
Вокруг фермента сформирован липидный бислой. Для мембраны использовались липиды POPC (фосфатидилхолин 16:0/18:1, с зарядом 0). Комплекс был помещен в виртуальную ячейку, с водой типа TIP3P. Для нейтрализации заряда в системе были добавлены ионы Cl-. В программе tleap белок был параметризован в поле Amber ff14SB, а молекулы липидов – в поле lipid14. Параметры для иона цинка взяты из поля frcmod.ionslrcm_iod, для которых было показано верное распределение расстояний и координационное число иона ZN в ходе компьютерных симуляций.
Для готового фермента в липидном бислое получена молекулярно-динамическая траектория длинной 100 нс. На первых наносекундах динамики липидный бислой изменил свое положение вокруг белка. Весь слой сместился по оси Z в соответствии с распределением заряда и типов аминокислот на интерфейсе взаимодествия фермента с липидным бислоем (рисунок 9).
Уплотнение в мембране наблюдается в области петли 265-273, что частично открывает поверхность белка на входе в активный центр. Важным критерием качества модели является ее стабильность в течение всей траектории. Анализ функции максимального стандартного отклонения (RMSD) показывает, что белок остается стабильным на протяжении всей динамики (рисунок 10).
После получения полной структуры ZMPSTE24 петля 285-320 (L1) оказалась разупорядочена и направлена в раствор. Хотя точное влияние L1 на активность фермента неизвестно, отсутствие петли в данных рентгеноструктурного анализа и наличие большого числа заряженных остатков в петле может говорить о том, что она играет важную роль в ассоциации с мембраной. С другой стороны, петля L1 напрямую связана с участком 265-273 (L2), поэтому конформация петли 285-320 может влиять на открытие и закрытие входа в активный центр. Таким образом, моделирование L1 является важной задачей.
В программе loopmodeling комплекса Rosetta был создан набор начальных конформаций L1. В ходе процесса накопления различных конформаций получено 20000 структур петли L1. Построено распределение структур по энергии на основе энергетической функции Rosetta. Для конформаций, находящихся в области отрицательных энергий, была проведена кластеризация с радиусом кластера 5Å (для любых двух структур RMSD <= 5Å). Ядро самого большого кластера далее использовалось для точного моделирования L1.
Так как ZMPSTE24 является трансмембранным белком, а поиск конформаций в программном комплексе Rosetta не учитывает липидного бислоя вокруг белка, а также проводит расчеты в среде только лишь неявного растворителя, необходимо использовать более продвинутый метод и более жесткие критерии отбора для определения структуры потенциально важного участка белка. Поэтому моделирование структуры петли L1 на основе полученной из Rosetta начальной конформации проводилось методом сканирующей метадинамики (reconnaissance metadynamics). Этот метод является надстройкой над стандартной молекулярной динамикой с возможностью указания так называемых коллективных переменных (CV), энергетическое состояние которых можно варьировать в течение компьютерной симуляции. Такой подход позволяет при правильном определении CV изучить все пространство состояний этих переменных. Это дает возможность за приемлемое время изучать различные процессы, такие как изменение конформации большого участка белковой последовательности. В качестве коллективных переменных использовались углы φ и ψ пептидных связей аминокислотных остатков 285-320. Координаты сохраняли каждые 5 пс. Для последующего анализы структуры отбирались каждые 25 пс и для каждого кадра проводилась процедура минимизации. В полученных таким образом структурах белок-мембранного комплекса в растворителе рассчитывались потенциальные энергии взаимодействия L1 с водой (UL-WAT), липидами (UL-LIP), остальной частью белка (UL-PROT) и внутренняя энергия самой петли (UL):
E = UL + UL-WAT + UL-LIP + UL-PROT
Определена структура самой стабильной и обладающей минимальной энергией конформации (рисунок 11).
7) Осуществлен структурный поиск и анализ потенциальных карманов связывания в структуре ZMPSTE24. Траектория динамики ZMPSTE24 в мембране использовалась для определения карманов и каналов, отвечающих за связывание субстратов, а также за удаление из полости белка продуктов реакции, которые бы сохранялись во время динамики. Покадровый анализ осуществлялся программой fpocket. На первом этапе были определены все полости, стабильные все время динамики. Для детально анализа в течение всей траектории были выбраны все карманы внутренней камеры фермента, а также полости, образующие каналы с внешней поверхностью: область активного центра, вход во внутреннюю камеру белка, область внутри камеры между активным центром и входом в камеру (P1, 2, 3, рисунок 12) и 4 кармана в интерфейсах между альфа-спиралями, противолежащими входу в активный центр (P4, 5, 6, 7, рисунок 12).
Для каждого участка fpocket определяет набор параметров, таких как объем кармана, гидрофобность, оценка полярности остатков, оценка гидрофобности и оценка общего заряда кармана. Данные получены путем усреднения значений каждого из параметров по все траектории динамики и приведены в таблице 1. Распределение заряда рассчитано программой APBS и представлено на рисунке 12.
P1 — самый большой по объему карман, который также соответствует активного центра. Карман сохраняет постоянный объем в течение всей симуляции. На рисунке 12 видно, что активный центр заряжен отрицательно и окружен гидрофобной областью. Это отражается высоким показателем оценки полярности и относительно средним значением оценки гидрофобности. С другой стороны эти оценки — средние значения по всему размеру кармана и могут плохо воспроизводить реальные свойства областей смешанных типов.
P2 — вход в активный центр. В отсутствии субстрата закрывается и открывается случайным образом, объем кармана не стабилен.
P3 — область под активным центром. В течение моделирования на поверхности образуются отверстия, так как она сформирована гидрофобными аминокислотами и располагается внутри мембраны, что позволяет остаткам свободно обращаться к липидным хвостам. Предположительно, данная область участвует в связывании фарнезилированного цистеина полипептидной цепи субстрата. Гидрофобность этого участка характеризуется двумя параметрами в таблице 1: средней локальной гидрофобностью — характеризующей наличие сконцентрированных локально гидрофобных участков — который по значению можно сравнить только с Р5 и Р6, и низким значением оценки полярности (следует иметь ввиду ограниченность данной оценки, см. комментарии к P1).
Канал P4 это сквозная полость, которая, предположительно, отвечает за удаление полипептида в ходе второй реакции, катализируемой ZMPSTE24.
Моделирование и подробное изучение данных областей имеет важное значение, так как мутации на этих участках приводят к частичной или полной потере активности ферментом. Карманы со сквозными полостями P3, P5 и P6 представляют интерес как возможные места связывания фарнезилированного конца преламина А.
8) Построена модель фермент-субстратного комплекса ZMPSTE24 c С-концевым фрагментом преламина А. Процесс связывания ферментом естественного субстрата – С-концевого фрагмента преламина А остается малоизученным до сих пор, затрудняя выявление структурных особенностей каталитического процесса ZMPSTE24. Остается неизвестным механизм распознавания и связывания ферментом субстрата, включая участвующие в этом процессе полости и интерфейсы взаимодействия. Нами было предположено, что механизм связывания может быть осуществлен благодаря реализации в ферменте нескольких альтернативных сайтов специфического узнавания неполярной группы аминокислотного остатка фарнезилцистеина на различных этапах протеолиза. Исследование электростатического потенциала на молекулярной поверхности фермента позволило выявить наиболее вероятные участки связывания этой группы во внутренней полости. В непосредственной близости от каталитических аминокислот была обнаружена полость P3 с характерным неполярным углублением между α-спиралями, образованными группами остатков 342-367 и 396-425. При исследовании траектории молекулярной динамики было выявлено, что принципиальной особенностью данной полости является возможность формировать объемные интерфейсы взаимодействия (площадь контакта порядка) с неполярными соединениями, включая алифатическую ненасыщенную фарнезил-группу модифицированного цистеина. Аминокислоты каталитического центра фермента были определены в составе другого кармана – P1. Участок этого кармана с явно выраженными неполярными аминокислотами в периферической от иона цинка области предположен как основной сайт связывания боковых групп аминокислот в +1 позиции от сайта гидролиза пептидной цепи C-концевого участка преламина А, включая изолейцин в составе CSIM С-концевого пептида.
Данные предположения позволили уменьшить объем потенциального конформационного пространства при построении первоначальной модели фермент-субстратного комплекса посредством пакетов automodel и dopehr_loopmodel программного обеспечения MODELLER v.12. В качестве модельного субстрата был использован олигопептид SPRTQSPQNCSIM идентичный продолжительному региону С-конца преламина А. Процедуры моделирования automodel и dopehr_loopmodel проводилась при условии квадратичных ограничений на позиции атомов основной цепи цистеина и серина относительно атома Zn2+, взятые из анализа рентгенографической структуры 2ypt банка данных PDB; дополнительные ограничения были введены также для атома серы боковой группы цистеина для ориентации фарнезил-группы в пределах неполярного интерфейса полости P3 и атомов боковой группы изолейцина для характерных взаимодействий в полости P1. Расчет молекулярно-динамической траектории позволил оптимизировать первоначальное положение субстрата в активном центре и дополнительных полостях узнавания (рисунок 14): итоговая конформация олигопептидного субстрата оставалась стабильной в последующих запусках молекулярной динамики. Структурный анализ образующегося комплекса показал участие остатков Leu283, Val332, Leu438 кармана P3 в образовании контактной поверхности с гидрофобной боковой группой изолейцина преламина А. Неполярные остатки полости P1 Ile351,Leu407, Leu410, Phe414 формируют интерфейс взаимодействия с фарнезил-группой модифицированного цистеина С-конца преламина А. В соответствии с этим было предположено, что именно сайты P1 и P3 (рисунок 15) определяют специфическое узнавание С-конца преламина ферментом ZMPSTE24 на первой стадии протеолиза и формирование характерной укладки основной цепи субстрата, при которой карбонильная группа гидролизуемой пептидной связи необходимым образом ориентируется относительно иона цинка каталитического центра (рисунок 16). |
| Результаты этапа: 1) Анализ содержания ламина А и ламина В в ядерной оболочке клеток отобранных на первом этапе работы линий (Ras-трансформированные фибробласты хомяка с разным метастатическим потенциалом). Во всех клеточных линиях антитела к обоим ламинам ярко окрашивают ядра. У клеток HET-SR (низкометастазирующие) ядра имеют правильную форму, ламин А выявляется и в ядерной оболочке, и в нуклеоплазме, ламин В ярче в основном присутствует в оболочке ядра. У всех высокометастазирующих линий клеток наблюдается большое разнообразие форм ядер, а также образование складок или неравномерных скоплений ламинов (рис. 1).
У спонтанно трансформированных клеток, у которых трансформация произошла в результате длительного культивирования in vitro линии эмбриональных клеток сирийского хомяка (ST-HET – низкометастазирующие клетки, ST-HET клон 83/20 – высокометастазирующие клетки) наблюдались сходные изменения – при отсутствии достоверной разницы в интенсивности окрашивания ламинов А и В между низко- и высокометастатическими линиями была отмечена большая изменчивость форм ядер у высокометастатической линии ST-HET clone 83/20 и неравномерное распределение обоих ламинов (рис.2).
Вестерн-блот-анализ экспрессии ламинов также не показал существенного различия в содержании ламинов А и В между низко и высокометастазирующими клетками (рис.3).
Поскольку различия в метастатической активности in vivo могут зависеть от активности матриксных металлопротеаз, был проведен зимографический анализ в исследуемых линиях. Для этого рассаживали клетки на 35 мм чашки Петри в концентрации 150000 клеток на чашку, культивировали 1 сутки, потом 3 раза отмывали средой без сыворотки и оставляли в бессывороточной среде на 12 часов и собирали кондиционированную среду. После этого подсчитывали количество клеток в чашках для нормирования нанесения белка при исследовании активности металлопротеиназ. Для анализа желатиназной активности матриксных металлопротеаз 10 мкл аликвоты кондиционированной среды смешивали с 10 мкл буфера для нанесения белков для зимографии и наносили на гель. Проводился стандартный SDS-ПААГ электрофорез в стандартных условиях в 8% полиакриламидном геле, содержащем 0,2% желатина, осуществляли ренатурацию в течение 30 мин и проводили желатиназную реакцию в течение 4 часов. Для всех исследованных линий быявлялась активность металлопротеиназы 2, однако достоверных различий в активности металлопротеиназ между низко и высокометастатическими клетками обнаружено не было (рис.4). Таким образом, различия в метастатическом потенциале клеток сирийского хомяка при разных способах трансформации вызвано не изменением содержания ламина А или ламина В, но ассоциировано с изменением формы ядер и распределения ламинов, что указывает на возможные нарушения как в таргетинге ламинов во внутреннюю ядерную мембрану, так и в регуляции сборки микродоменов ламинов.
2) Анализ миграционной активности клеток в ограниченном пространстве.
Миграционную активность клеток в зависимости от уровня экспрессии ламина А и его сплайс-вариантов проводили в камерах Бойдена с диаметром пор 3 и 8 мкм. Для создания градиента хемоаттрактанта в нижнюю камеру добавляли эмбриональную сыворотку, клетки в верхней камере инкубировали в бессывороточной среде (рис.5). Анализ проводили на клеточных популяциях линии HT1080 (фибросаркома человека), гетерогенных по уровню экспрессии GFP-ламина А и GFP-прогерина, а также клетках с нокдауном ламина А (уровень нокдауна в индивидуальных клетках пропорционален флуоресценции GFP, коэкспрессирующегося со шпилечной РНК против ламина А). Анализ эффективности миграции осуществляли на следующие сутки после посева при помощи высокопроизводительного микроскопического скрининга и автоматической детекции количества клеток с надпороговым уровнем сигнала GFP с обеих сторон мембраны с использованием алгоритмов, оптимизированных на предыдущем этапе выполнения проекта.
Результаты анализа показали, что доля клеток, экспрессирующих как экзогенный ламин А, так и прогерин, существенно снижена в популяции клеток, мигрировавших через поры, что свидетельствует о торможении миграции (рис.6). Данный эффект зависит от размера пор: эффективность миграции через 8-мкм поры снижается на 25% и 32% для ламина А и прогерина, соотвественно, а при миграции через 3-мкм поры, эффективность снижалась еще существеннее — на 61% и 66%. В то же время подавление экспрессии ламина А не приводит к активации миграции (рис.7). По-видимому, поскольку в данных исследованиях использовались трансформированные клетки с изначально высоким миграционным потенциалом и высокой пластичностью ядерной оболочки, дополнительное снижение уровня ламина А не вносит существенного вклада в способность клеток мигрировать через поры. Поэтому на следующем этапе экспериментов планируется использовать описанные в предыдущем отчете линии HSR, демонстрирующие разные возможности к метастазированию (инвазии в ткани организма), а также их трансгенные варианты.
3). Для исследования миграции клеток в 3D коллагеновом геле совместно в компанией PhaseView был разработан оптимизированный алгоритм регистрации изображений методом микроскопии планарного освещения (SPIM). Данный алгоритм и его аппаратная имплементация обеспечивают трехмерную световую микроскопию планарного освещения (SPIM) с лазерным световым листом с повышенной однородностью и глубиной распространения по всему полю зрения в прозрачных и полупрозрачных образцах от среднего до крупного размера. В частности, в этой системе предусмотрены средства для поддержания минимальной толщины лазерного светового листа внутри объекта на максимально возможной для данной оптической конфигурации площади, что обеспечивает равномерное и максимально возможное аксиальное разрешение по всему полю зрения. В основе системы лежит синхронизация скорости и фазы Rolling shutter КМОП-камеры, используемой для регистрации изображений, с перемещением седловины лазерного листа при помощи адаптивной оптики, установленной в оптическом пути возбуждения (рис. 8). Система была специально адаптирована для анализа миграции клеток в трехмерном геле, поскольку SPIM-микроскопия обеспечивает пониженную фототоксичность и существенно более высокую скорость захвата изображения по сравнению с лазерной конфокальной микроскопией с поточечным сканированием, что позволяет проводить длительные прижизненные наблюдения, анализируя при этом существенно больший объем образца с высоким пространственным и временным разрешением (рис.9). Данная система будет в дальнейшем использована для анализа влияния ингибирования Zmpste24 на миграционную активность раковых клеток в 3D-гелях.
4) Влияние экспрессии экзогенных ламина А и прогерина на механические свойства ядерной оболочки в живых клетках анализировали при помощи сканирующей ион-проводящей микроскопии (SICM). Данный метод, помимо возможности высокоскоростного сканирования рельефа поверхности живых культивируемых клеток с высоким латеральным и аксиальным разрешением, позволяет измерять эластические свойства клеток (рис.10а,б). Измерение коэффициентов упругости ядра также возможно благодаря незначительному по толщине слою цитоплазмы над ядром клетки, распластанной на стеклянной подложке. Для минимизации вклада цитоплазмы в определяемые параметры ядра использовались клетки фибросаркомы человека HT1080, демонстрирующие высокую степень распластывания. Клетки трансфицировали плазмидой, кодирующей GFP-ламин А или GFP-прогерин. Измерения проводили на приборе МНТ (ООО «Медицинские нанотехнологии»), установленном на инвертированной флуоресцентной платформе Eclipse Ti2 (Nikon) на второй день после трансфекции. В качестве сканирующего элемента использовались стеклянная микропипетка на пьезоконтроллере (Рис. 10,а). Клетки для сканирования выбирали по уровню флуоресценции в канале GFP. Сначала проводили сканирование рельефа исследуемой клетки. В данном случае детекция поверхности происходит, когда при достижении ее границы стеклянной микропипеткой сила ионного тока падает на ~0,25-1%. Далее осуществлялось определение эффективной жесткости, вычисляемое из регистрируемого конечного смещения мембраны после продавливания ее ионным током, при этом определяется следующая точка падения ионного тока на ~1%. Клетка сканировалась целиком, далее определялось положение ядра по самой высокой точке на рельефе. В этой области для обработки брались 10 точек, значение жесткости для еще 10 точек выбирались по периферии клетки, при этом эти точки не должны были находиться совсем вблизи края цитоплазмы, чтобы в выборку не попали значения жесткости подложки (рис. 10,в). Результаты измерений упругости ядра нормировали на упругость цитоплазмы в области ламеллы. В ряде экспериментов измерения проводили на фоне разборки актинового и тубулинового цитоскелета (под действием нокодазола и цитохалазина D), степень разборки оценивали при помощи иммуноокрашивания клеток антителами против бета-тубулина или прижизненной окраски SIR-актином. Предварительные результаты показали прямую корреляцию между концентрацией экзогенного GFP-ламина А в ядре и жесткостью клеточного ядра (рис.11). Исследования будут продолжены для оптимизации метода (подбор диаметра капилляра, модификация алгоритмов расчета жесткости и т. д.) с целью повышения точности измерений, увеличения размеров выборки, а также для исследования эффективности ингибиров Zmpste24.
5). Исследование влияния экспрессии прогерина на структурную организацию и позиционирование периферического гетерохроматина проводили на модели клеточных линий китайского хомячка (CHO), в геном которых бы интегрирован искусственный хромосомный локус, содержащий множественные тандемные повторы Lac-оператора. Визуализацию локусов осуществляли при помощи экспрессируемого в клетках GFP-Lac-репрессора (Robinett et al, 1996). В работе использовали клон AO_3, содержащий амплифицированный искусственный локус (HSR), демонстрирующий высокую степень гетерохроматинизации и перманентно ассоциированный с ядерной ламиной (Li et al, 1998; Жиронкина и др., 2014).
Клетки CHO AO_3 трансфицировали плазмидой, кодирующей GFP-прогерин, через 48 часов клетки фиксировали и иммуноокрашивали антителами против ламина А для дифференцирования сигналов GFP-Lac-репрессора и GFP-прогерина. Иммунофлуоресцентная микроскопия и микроскопия с суперразрешением показали, что экспрессия прогерина не вызывает уменьшения степени компактизации, оцениваемого по изменениям площади HSR или средней интенсивности флуоресценции GFP в нем (рис. 12). Также не наблюдалось значительных изменений в позиционировании HSR относительно ядерной оболочки: в клетках с высоким уровнем экспрессии прогерина выявляется типичная для прогерии Хатчисона-Джилфорда лобулярная структура ядра и образование многочисленных инвагинаций ядерной оболочки, и HSR всегда остается ассоциированным либо с ядерной периферией, либо с ламинов в области инвагинаций.
Для исследования ультраструктурной организации хроматина в клетках, экспрессирующих GFP-прогерин, была использована иммуноэлектронная микроскопия с антителами против GFP с последующей Ag-амплификацией сигнала вторичных Nanogold-меченых антител. Такой подход позволил идентифицировать трансфицированные клетки на светооптическом уровне в при помощи светлопольной оптической микроскопии и эффективно находить их на ультратонких срезах. Эдектронно-микроскопический анализ показал, что как искусственные хромосомные локусы, так и эндогенные гетерохроматические района хромосом, вопреки высказанным ранее гипотезам, сохраняют свою конденсированную структуру. Однако при этом часто наблюдается утрата ассоциации периферического гетерохроматина с ядерной ламиной и перемещение его во внутренние районы ядра (Рис. 13, а). Значительные участки ядерной ламины в этих условиях остаются свободными от контактов с гетерохроматином (рис.14).
6). Выявление круга наиболее перспективных конкурентных ингибиторов при использовании методов молекулярного моделирования, дальнейшее изучение стабильности фермент-ингибиторных комплексов методами молекулярной динамики с целью отбора кандидатных соединений для экспериментального исследования
Для ZMPSTE24 структурная информация определена кристаллографическими данными рекомбинантного человеческого фермента и белка из Saccharomyces cerevisiae Ste24p. При этом известна только одна структура комплекса ZMPSTE24 с одним из ингибиторов растворимых цинк-зависимых металлопротеаз, обеспечивающих слабое конкурентное ингибирование ZMPSTE24, – фосфарамидоном, характеризующаяся низкими показателями разрешения кристаллографического метода. Несмотря на схожесть активного центра ZMPSTE24 с некоторыми цинк-зависимыми металлопротеазами, как например термолизин и неприлизин, связывание фосфорамидона обеспечивалось на значительно более низком уровне. Т.к. эксперименты проводились in vitro прямых доказательств эффективности данного класса ингибиторов в качестве лекарств не выявлено. Ожидание эффективности действия in vivo на данный момент не подкреплено какими-либо методами, более того, доставка подобных соединений может быть затруднена сложным входом в активный центр ZMPSTE24, образованным интерфейсом взаимодействия фермент-липид-вода, как было описано нами в ходе предыдущего этапа работы в 2017 году. С другой стороны, обнаружено, что класс молекул, применяемых в антиретровирусной терапии пациентов с ВИЧ, может вызывать у них липодистрофию, как результат нецелевого связывания этих молекул с ZMPSTE24. При этом наиболее эффективным образом показал себя лопиновир, для которого экспериментально показан конкурентный механизм ингибирования ZMPSTE24.
Ввиду описанных ограничений применение классической схемы in silico скрининга библиотек химических соединений, как правило, представляющей собой перебор большого количества случайных или синтезированных на данный момент структур органических молекул и их последующий докинг в статическую кристаллографическую структуру ZMPSTE24, видится малоэффективным. Структура ZMPSTE24 представляет собой довольно уникальную форму, образованную семи трансмембранными спиралями, охватывающими заполненную водой внутреннюю полость объемом 14000 кубических анстрем, помещенную в липидный бислой. Большинство современных программ докинга используют в своих расчетах исключительно неявную форму водного раствора при расчете энергий связывания и не могут учитывать влияние липидного бислоя. Использование же статических структур ZMPSTE24, погруженных в бислой, не смогут учесть специфику карманов, образованных на интерфейсе фермент-липид-вода, а также их динамические характеристики – модель липидного слоя предполагает высокую подвижность гидрофобной части молекул бислоя в сравнении с устройством полостей и карманов структурно-стабильных белков. Сочетание этих факторов приводит к неэффективности и такого популярного метода поиска ингибиторов, как SAR-исследования (structure-activity relationship), приспособленные к моделям чистого водного растворителя.
Наиболее рациональный путь в данном случае предполагает использование базовой структуры молекул, потенциал которых уже показан в экспериментах in vitro и in vivo, в качестве отправной точки для поиска модификаций, ввод которых обеспечит высокую эффективность связывания. На данный момент лучшим кандидатами являются синтетические пептидомиметики, применяемые при ингибировании аспартат протеаз, в т.ч. и ВИЧ протеазы.
Для поиска механизма действия подобного класса молекул, который для ZMPSTE24 неизвестен до сих пор, нами был разработан in silico метод поиска сайтов связывания, а также пути доставки молекул из раствора, с учетом как интерфейса фермент-липиды-вода, так и самой динамической структуры фермента и окружающей мембраны. Метод основывается на применении моделирования молекулярной динамики в сочетании с расширенным методом метадинамики (см.ниже). Важность подхода обусловлена тем, что в литературе уже было попытка модификации структур пептидомиметиков ВИЧ протеазы, основанная на гипотезе общего механистического действия аспартат протеаз и цинк-зависимых растворимых протеаз. По аналогии механизм был предложен и для ZMPSTE24. При этом никакими структурными исследованиями эта гипотеза не была подтверждена.
В ходе нашего исследования был обнаружен совершенно новый механизм действия пептидомиметиков ВИЧ протеаз, который открывает целый ряд особенностей и идей рационального дизайна эффективного ингибитора ZMPSTE24.
Разработанный алгоритм был применен для установления распределения возможных конформационных состояний и типов связывания лопиновира относительно всей поверхности ZMPSTE24, погруженного в липидный бислой, а также в его внутренней полости и на удалении от поверхности в толщине раствора – как водного, так и липидного. Это обеспечило возможность энергетической оценки связывания лопиновира во всех потенциальных сайтах связывания, а также барьеров между ними и возможных путей миграции из внешнего растворителя. Подобные энергетический карты построены относительно трех координат фазового пространства и представлены в виде срезов на отдельных значениях одной из выбранной переменных и изоповерхностей (Рис. 1,2). Т.е. для интерпретации полученных многомерных энергетических карт удобно использовать фиксированные значения только одной переменной, например расстояния центра масс лопиновира от центра масс фермента, но прорисовывать распределения относительно других двух переменных – угловых θ и φ.
Анализ показывает, что проникновение лопиновира из водного раствора в мембрану затруднительно ввиду наличия барьера. Данный барьер формируется в результате особенностей строения липидного бислоя: в сторону водного раствора ориентируются заряженные части составляющих мембрану фосфолипидов – фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина, образующих дипольный поверхностный потенциал, который на первоначальном этапе прохождения лопиновира в мембрану обеспечивает барьер, как стерический, так и, возможно, энтропийный, наблюдаемый в системах липиды-вода. Т.к. лопинавир – гидрофобное соединение, то его попадание в липидный слой – выгодный процесс сам по себе. Однако путь концентрирования его в мембранах проходит через барьер, образованный дипольным поверхностным потенциалом. При этом возможно наблюдать, что проникновение лопинавира в мебрану энергетически более выгодно в области значений 60<θ<75 и -160<φ<-180. Эта область соответствует границе липидной мембраны с водным раствором над входом во внутреннюю полость ZMPSTE24, используемым белковым субстратом для проведения каталитического протеолиза. Детальное исследование этой области в процессе молекулярной динамики позволило выявить проседание липидного бислоя вблизи входа в активный центр фермента относительно общей поверхности мембраны (Рис.3). Подобное проседание обеспечивается специфическим распределением заряда на поверхности ZMPSTE24, показанное в ходе одного из этапов работы в 2017г. По всей видимости, мы предполагаем, что проседание формирует разрыв в дипольной части бислоя и облегчает доступ гидрофобных молекул к внутренней гидрофобной части мембраны. Однако, при этом, наименьшим значением энергии соответствует связывание лопинавира на интерфейсе, образованным входом в активный центр фермента и липидным бислоем (75<θ<100 и -160<φ<-180,160<φ<180). Несмотря на возможность проникновения лопиновира во внутреннюю полость фермента, специфического взаимодействия с остатками каталитического центра или областью связывания субстрата обнаружено не было (Рис. 1). Косвенно эти результаты подтверждаются отсутствием кристаллографической структуры ZMPSTE24 в комплексе с лопинавиром в активном центре. Обнаруженный нами механизм связывания также подтверждает и ингибирование лопинавиром фермента по конкурентному типу. Мы также провели подобное исследование в системе фермент-вода без липидного слоя. Подобного типа связывания обнаружено не было (Рис. 2). Это может объяснить отсутствие электронной плотности лопинавира в кристаллах ZMPSTE24, выращенных при добавлении ингибитора, ввиду отсутствия в кристаллах упорядоченной структуры мембраны.
Для установления специфических взаимодействий лопинавира в процессе связывания на входе в активный центр мы провели кластерный анализ ансамбля структур ингибитора, обнаруженных в процессе его нахождения в обнаруженном нами центре связывания. Для этого был использован непараметрический байесовский метод кластеризации по основным двугранным углам, определяющим конформацию лопинавира (см. ниже). На предмет специфических взаимодействий был использован самый населенный кластер. Ориентация и конформация лопинавира характеризуется стэкинг-взаимодействием одной из боковых фенильных групп с фениаланиновым аминокислотным остатком фермента, обеспечивающих структуру петли на входе в активный центр, плотным контактном гидрофобных групп аминокислот образующих вход спиралей фермента с боковыми гидрофобными группами лопинавира. Также гидрофобные группировки лопинавира частично остаются в липидном бислое. Кетотетрагидропиримидиновая группировка лопинавира – наиболее полярная часть ингибитора – обращена во внутренню полость фермента, наполненную молекулами воды.
Таким образом, мы предлагаем данный центр связывания, как наиболее перспективный с точки зрения связывания конкурентных ингибиторов пептидомиметиков, ввиду наличия как функционально важных заряженных и гидрофобных групп фермента со специфическим паттерном распределения в пространстве, так и особым способом доставки и проникновения в мембрану.
В метадинамике к основному потенциалу системы добавляется смещающий гауссов потенциал от коллективных переменных через определенные промежутки времени (формула 1). Высота ω и ширина δs гауссова потенциала и частота τG добавления этого смещающего потенциала к полному потенциалу системы, а также выбор коллективных переменных (CV) являются важнейшими параметрами при таком моделировании. Для построения полной трехмерной карты свободной энергии лопинавира при движении относительно ZMPSTE24 мы должны были подобрать такие CV, который бы описывал этот процесс наиболее точно. Каждую точку на поверхности белка в системе координат связанной с центром масс белка можно задать тремя переменными: два сферических угла θ и φ и расстояние между центром масс белка и лиганда r (Рис. 4). ZMPSTE24 представляет собой мембранный белок, содержащий структуру из трансмембранных альфа-спиралей, образующих камеру внутри белка существенного объем. Поэтому выбор именно таких трех коллективных переменных позволяет исследовать внешнюю и внутреннюю поверхности белка, а также процесс проникновения лопинавира в камеру внутри фермента. Таким образом положение лиганда относительно центра масс белка описывалось обычными сферическими координатами, которые легко перерассчитывались из декартовых компонент радиус-вектора между белком и лигандом (формула 2). Значение ω для потенциала смещения равнялось 5 кДж/моль, ширина потенциалов δsθ и δsφ выбраны 0.1 радиан и 1Å для δsr. Такой выбор этих параметров позволил плавно исследовать всю поверхность свободной энергии.
При движение лопинавира от одной точки поверхности белка к другой может быть энергетически выгодно его смещение в раствор. Однако отдаление на значительное расстояние может, с одной стороны, замедлить расчеты, а с другой внести артефакты, связанные с сильным изменением радиуса. Чтобы избежать сильного удаления лопиновира от белка было введено ограничение на координационное число. Координационное число позволяет количественно охарактеризовать степень близости лиганда к белку и рассчитывается по формуле 3. Само число состоит из слагаемых sij, которые равняются 1, если атом j, в данном случае, лиганда расположен не дальше, чем на расстоянии r0 от атома белка i (то есть образует «контакт»), и в любом другом случае равно нулю. Введения ограничения на координационное число позволяет, варьируя параметр r0, контролировать расстояние, на которое ингибитор может отходить от поверхности белка. Параметры для ограничения системы по координационному числу были подобраны в ходе ряда калибровочных запусков метадинамики таким образом, чтобы лиганд имел возможность отходить от белка на расстояние, на котором между ними может оказать растворитель, но при этом достаточно малое, чтобы в случае можно было почувствовать взаимодействие с поверхностью.
При сильном отдалении лопиновира от белка средства программы для метадинамики вводят дополнительную энергию таким образом, чтобы сблизить их друг с другом. Это, без дополнительного контроля, может привести к тому, что белок может начать разрушаться. Так происходит потому, что при удалении ингибитора все меньше атомов белка будут находиться в контакте с ингибитором (Рис. 5), а это, в свою очередь, приведет к тому, что системе может оказаться более выгодным начать разрушение белка вместо того, чтобы двигать лиганд в сторону поверхности. Для предотвращения такого исхода дополнительно было введено ограничение значение RMSD всех атомов основной цепи белка. Такой выбор атомов для RMSD позволил предотвратить разрушение структуры фермента, но также не стал препятствием для свободного движения аминокислотных радикалов, которое может происходить в растворе, при взаимодействии с мембраной, а также при взаимодействии с ингибитором. Молекула лопинавира не является стандартной для атомных силовых полей. Точечные заряды на атомах были рассчитаны с применением процедуры RESP. Однако, лопинавир – достаточно большая молекула, поэтому для расчета зарядов он был логично разделен на три части, которые были параметризованы по отдельности (Рис. 6). Такой подход позволил избежать возможных артефактов при расчете заряда, в связи с наличием большего количества конформеров лопинавира. Кроме того, при дальнейшем поиске новых ингибиторов на основе лопинавира, можно будет легко заменять одну или две части молекулы, используя уже известные параметры для остальных константных частей.
Параметры силового поля для атомов были выбраны в соответствии с атомным силовым полем GAFF (General Amber Force Field). Молекулярно механическая энергия итоговой молекулы была сопоставлена с квантовой энергией. Сравнение показало, что молекулярно механическая модель, рассчитанные точечные заряды и выбранные параметры поля с высокой степенью точности совпадает с квантовой.
Кластеризацию цельной структуры субстрата проводили на базе значений дигедральных углов между углеводными мономерами, с использованием следующей модификации:
Отображение фазового пространства углов – в общем случае L-мерного бокса Pc (формула 4). Продуктом отображения является тор Te – L-мерная поверхность на единичной сфере S2L-1. Отображение является локальной изометрией с сохранением меры расстояний.
Преобразованные переменные использовали для кластеризации с помощью Байесовского непараметрического метода, имплементированного в программе dpMMlowVar. Оптимизацию углового параметра для данного метода проводили в пределах [-0.6;-0.3] с шагом 0.01 на основании оценочной функции силуэт. При визуализации результатов кластеризации использовали метод главных компонент для трансформированных значений углов с выделением первых трех главных компонент.
|
