ИСТИНА

В данном проекте предлагается использовать МТТ-тест в сочетании с гигантским комбинационным рассеянием (ГКР, SERS), что позволит получать спектр одной единственной бактерии и интерпретировать интенсивности сигналов ансамбля бактерий, не разделяя их микробиологическими методами

Prevention, accounting of infectious and inflammatory diseases and the appointment of correct antimicrobial therapy are invariably relevant in all areas of medicine, especially in surgery, intensive care, hematology, oncology, pediatrics. In an era of increasing drug resistance, the responsibility for the use of antibiotics is of paramount importance. Thus, one of the priorities in the diagnosis of infections is the speed of detection of the pathogen and determination of its properties, so that rational starting etiotropic therapy can become a reality. Traditional approaches based on the cultivation of microorganisms on selective nutrient media often do not allow to get a result in time and turn out to be uninformative due to the retrospective nature of the analysis. The use of polymerase chain reaction and DNA sequencing, which have already been widely used in practice, makes it possible to detect the determinants of resistance that correlate with the results of the phenotypic analysis of the sensitivity of the microorganism to antimicrobial drugs. However, all known molecular genetic methods are aimed at finding the determinants of antibiotic resistance, and not at an accurate, phenotypic determination of sensitivity to antimicrobial drugs. Despite the fact that molecular genetic methods often give fairly objective results, in some cases the accuracy of such methods is low. On the one hand, microorganisms with unknown mechanisms of antibiotic resistance are constantly being discovered, which requires the identification of the molecular basis of these new properties, the study of new mechanisms and the genes encoding them. And on the other hand, the total number of stability mechanisms is quite high in order to cover them all and give a completely correct result. A promising tool for developing such a rapid assessment method is Raman spectroscopy, which allows obtaining information about the concentration of components in a complex mixture by the intensity of their characteristic spectrum. There are methods for determining the antibiotic resistance of bacteria using the MTT reagent. MTT test is a widely used method for assessing the metabolic activity of cells, suitable for assessing the cytotoxic effects of drugs, the effectiveness of anti-cancer drugs, antifungal agents and antibiotics. It is shown that the combination of MTT and Raman spectroscopy can be used to determine the antibiotic resistance of pure bacterial cultures, including the quantitative assessment of the minimum inhibitory concentration (MIC) of the antibiotic. In this project, it is proposed to use the MTT test in combination with giant raman scattering (SERS), which will allow obtaining the spectrum of a single bacterium and interpreting the signal intensities of an ensemble of bacteria without separating them by microbiological methods. The method will allow you to quickly determine the sensitivity to antibiotics of bacteria directly isolated from biological media, without growing outside the body. This approach opens up fundamentally new possibilities for prescribing therapy, multiplying the speed of analysis and allowing bedside diagnostics, including patients in serious condition who need accurate and rapid selection of an antibiotic. To solve this task, an interdisciplinary approach is required: physicists will prepare membranes with a SERS coating that simultaneously filter bacteria from the biological environment and enhance the Raman spectrum, chemists will select a contrasting reagent that distinguishes a metabolically active cell from an inactive one, physicians will test a test system on biological fluids of patients. The proposed approach elegantly solves one of the main tasks of modern medicine using only domestic devices and consumables.

В рамках проекта будет разработан новый способ качественной и количественной оценки устойчивости бактерий к антибиотикам, не требующий выделения чистых культур и подращивания бактерий в средах. Метаболитическая активность бактерий будет оцениваться в присутствии антибиотиков с использованием МТТ-реагента, превращение которого в формазан будет оцениваться с помощью спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния, позволяющей получать спектры от единичных бактерий. Высокая чувствительность спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния позволяет изучать первые этапы восстановления МТТ-реагента в формазан с характерным временем реакции менее 1 часа. Результаты оценки жизнеспособности бактерий можно интерпретировать как результаты фенотипического определения устойчивости микроорганизмов к антимикробным препаратам. Предлагаемый тест может быть использован для быстрой (около 1 часа) диагностики устойчивости к антибиотикам чистых культур микроорганизмов и сложных смесей бактерий. Для сложных смесей планируется использовать спектроскопию гигантского комбинационного рассеяния в сочетании со световой микроскопией, что позволяет классифицировать бактерии по форме и размеру, измерять спектр интересующей фракции бактериальной смеси (спектры отдельных бактерий), что снимает необходимость традиционного разделения бактериальных смесей на селективных питательных средах. Кроме того, планируется исследование возможности применения разработанной диагностической тест-системы для анализа непосредственно в образцах биологического материала (моча, кровь и т.д.). К завершению реализации проекта планируется проведение технических и клинических испытаний на базе ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И.Кулакова» Минздрава России, подготовка документов для получения регистрационного удостоверения на медицинское изделие для последующего внедрения тест-системы в клиническую практику для нужд отечественной медицины. Совместно с организацией-партнером (Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов, обособленное структурное подразделение ФИЦ "Саратовский научный центр РАН") планируется разработать тест-полоски для селективной идентификации бактерий в смесях и определения их антибиотикорезистентности. Задача организации-партнера – разработка тест-полоски с МТТ-реагентом, ГКР-зоной, усиливающей сигнал, и иммобилизацией аптамеров. Работоспособность тест-полоски будет оценена в рамках совместной работы. Исследуемый патоген будет выделяться из биологических жидкостей за счет специфического взаимодействия с ДНК-аптамерами к поверхностным детерминантам бактерий. Идентификация патогенов будет происходить за счет их окрашивания МТТ-реагентом, что позволит определять титр бактерий в пробе. В варианте определения антибиотикорезистентности будет проведено сравнение зон с и без добавления антибиотика в реперной концентрации. Интенсивность окрашивания чувствительных бактерий в присутствие антибиотика будет снижаться. Такие тест-полоски упрощают инструментальную часть исследования, не требуя использования микроскопа и визуального выбора объекта для оценки. Полученные результаты позволят вывести на рынок уникальную технологию экспресс-определения чувствительности клинически значимых микроорганизмов к антимикробным препаратам. Предлагаемый подход не имеет аналогов в мире, позволяет проводить определение устойчивости бактерий к антибиотикам на новом, ранее не достижимом уровне. Возможные организации – потребители разработанной технологии – микробиологические лаборатории медицинских организаций, учреждения Министерства здравоохранения Российской Федерации. Технологию можно использовать как в стационарных условиях лаборатории, так и в качестве переносного варианта для быстрого определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам в качестве технологии «point-of-care» (по месту лечения).

Припутневич Татьяна Валерьевна - доктор медицинских наук, член-корреспондент РАН, 50 лет, директор института микробиологии, антимикробной терапии и эпидемиологии ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И.Кулакова» Минздрава России. Татьяна Валерьевна имеет непосредственное отношение к проблеме антибиотикорезистентности, имеет опыт работы с традиционными и инновационными методами идентификации бактериальных патогенов и использования их в клинической практике. Татьяна Валерьевна имеет опыт проведения клинических испытаний и имеют доступ к клиническим образцам, а также доступ к коллекции циркулирующих штаммов микроорганизмов, необходимых для масштабных испытаний применимости тест-системы в биологических образцах. Нечаев Александр Николаевич владеет технологиями создания мембран, совместимых с ГКР спектроскопией. Александр Николаевич имеет возможность осуществлять масштабное производство мембран на базе ОИЯИ с тщательным контролем параметров мембран (количество и размер пор, геометрия пор, толщина мембраны, проницаемость мембраны). Мембраны являются базовым материалом в разрабатываемой тест-системе. Кукушкин Владимир Игоревич - старший научный сотрудник Института физики твердого тела РАН, имеет большой опыт в разработке Рамановских спектрометров и ГКР-усиливающих подложек. Владимир Игоревич имеет опыт создания ГКР-усиливающих мембран, им отработаны протоколы создания наноструктурированных слоев металла на поверхности полимерных мембран с высокой адгезией в условиях фильтрации биологических жидкостей.

Метод экспресс-определение антибиотикорезистентности бактерий в биологических образцах с помощью спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния