Рекомбинантные антигены коронавируса, полученные в бактериальной системе экспрессии, как основа универсальной вакцины против ряда вариантов SARS-CoV-2НИР

Recombinant coronavirus antigens, obtained in the bacterial expession system as the basis of a universal vaccine against a number of SARS-CoV-2 variants

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 7 мая 2024 г.-31 декабря 2024 г. Получение и характеристика рекомбинантных RBD-содержащих антигенов коронавируса SARS-CoV-2; накопление ВТМ для создания структурно модифицированных вирусных частиц.
Результаты этапа: 1.Рекомбинантные коронавирусные антигены Co1, CoF и PE экспрессированы в клетках Е. coli, выделены и очищены методом металл-аффинной хромотографии на Ni-NTA-агарозе (Qiagen, Германия) в денатурирующих условиях согласно протоколу производителя. 2.Очищенные рекомбинантные коронавирусные антигены охарактеризованы с помощью ряда физико-химических методов, в том числе с помощью методов спектрофотометрии, электрофореза и иммуноблота. Концентрацию антигенов определяли с помощью метода спектрофотометрии. Выход рекомбинантных белков Co1, CoF и PE составлял 11мг, 34 мг и 110 мг соответственно на 1л культуральной среды. Всего получено 15 мг очищенного белка Co1, 15 мг белка CoF и 30 мг белка PE. Все белки получены в количествах достаточных для проведения экспериментов в 2025 и 2026 г. Молекулярные массы белков, полученные по результатам электрофоретического анализа, составили 27.5 кДа для Co1, 29.3 кДа для CoF и 21.8 кДа для PE, что соответствует ожидаемому значению, рассчитанного по аминокислотной последовательности с помощью ProtParam EXPaSy. Антигенная специфичность рекомбинантных белков была подтверждена Вестерн-блот анализом с использованием коммерческих поликлональных антисывороток к полноразмерному S-белку SARS-CoV (Cat# MBS432054, MyBioSourse), к полноразмерному S-белку SARS-CoV-2.(Cat# MBS434243, MyBioSourse). Результаты Вестерн-блот анализа подтвердили антигенную специфичность рекомбинантных белков к S-белку коронавирусов SARS-CoV (антиген PE) и SARS-CoV-2 (антигены Co1 и CoF). 3.Исследована возможность связывания RBD-содержащих антигенов Co1 и CoF, полученных в клетках бактерий, с рекомбинантным рецептором ACE2 человека из коммерческого набора «SARS-CoV-2 Surrogate Virus Neutralization Test Kit» (ATO00040, AtaGenix Laboratories, Ухань, Китай). Установлено, что RBD-содержащие антигены Co1 и CoF, экспрессированные в клетках E. coli, специфически взаимодействовали с рецептором ACE2 человека. Представленные результаты подтверждают высокий потенциал RBD-содержащих антигенов, экспрессированных в клетках E. coli, для разработки вакцин. 4. Проведен анализ возможности взаимодействия RBD-содержащих антигенов Co1 и CoF с сыворотками крови людей, переболевших COVID-19. Сыворотки крови людей были получены из Референсного центра по коронавирусной инфекции ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (от всех пациентов было получено информированное добровольное согласие на использование образцов крови). Было проанализировано 26 образцов сывороток крови, семь из которых были получены от пациентов до начала пандемии COVID-19. На основании результатов иммунохроматографического анализа на тест-кассетах LeccurateTM (Lepu Medical), сыворотки крови были разделены на две группы: иммунные и неиммунные образцы. К положительным иммунным образцам было отнесено 16 сывороток, к отрицательным неиммунным –10 сывороток (среди них 7 сывороток, собранных до начала пандемии COVID-19). Все сыворотки были проверены на возможность взаимодействия с RBD-содержащими антигенами с помощью непрямого метода ИФА. Результаты ИФА показали, что RBD-содержащие антигены Co1 и CoF эффективно реагировали с иммунными к SARS-CoV-2 сыворотками крови людей. Медиана титров антител для антигена Co1 составляла 1/213000, медиана титров антител для антигена CoF 1/285000. Более того, полученные нами значения титров антител коррелировали с международными единицами определения антител BAU/мл (binding antibody units) к SARS-CoV-2. Таким образом, продемонстрирована возможность взаимодействия RBD-содержащих коронавирусных антигенов, эспрессированных в прокариотической системе экспрессии, с сыворотками крови людей иммунных к вирусу SARS-CoV-2. Это подтверждает перспективность использования RBD-содержащих антигенов, полученных в системе экспрессии E. coli, в вакцинных препаратах и диагностических системах. 5. Получены антисыворотки иммунные к варианту Ухань SARS-Cov-2. Для получения антисывороток аутбредных мышей ICR (CD-1) иммунизировали очищенными рекомбинантными белками Co1, CoF и PE в присутствии адъюванта Фрейнда. 6. Вирус табачной мозаики (ВТМ), штамм U1 (коллекция кафедры вирусологии МГУ) накоплен в растениях Nicotiana tabacum, выделен и очищен из зараженных листьев в препаративных количествах согласно Trifonova et al., 2015. Впервые выращивание растений N. tabacum было выполнено на проточных гидропонных установках FT-3.2 (Cipolino Hydroponics) без использования субстрата. Проведено сравнение параметров накопления вирусного материала в сравнении с классическими методами выращивания и инфекции табака обыкновенного: выход очищенного вируса из растений табака, выращенных на проточных гидропонных установках составил около 450 мг в пересчете на 100 г листовой массы; выход ВТМ, накопленного в растениях табака в классических условиях выращивания, составил 320 мг в пересчете на 100 г листовой массы. Всего выделено 700 мг очищенного препарата ВТМ. 7. Качество выделенного препарата ВТМ контролировали методами спектрофотометрии, электрофоретического анализа и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭM). Анализ препарата ВТМ методом TEM подтвердило наличие частиц палочковидной формы со средней длиной около 300 нм и диаметром около 18 нм. Какой-либо контаминации препарата растительным или вирусным материалом другой природы не обнаружено. Методом спектрофотометрии показано, что препарат ВТМ имеет типичный нуклеопротеидный спектр: соотношение А260/А280 составляло 1.2, что характеризует высокоочищенные препараты ВТМ. При анализе ВТМ методом электрофореза в денатурирующем градиентном полиакриламидном геле детектировалась одна белковая полоса, соответствующая по электрофоретической подвижности белку оболочки ВТМ. 8. В дополнениe к заявленному плану получены предварительные данные о том, что сыворотки, собранные при иммунизации мышей антигенами на основе последовательности уханьского варианта Co1, PE и CoF (см. пункт 5), являются перекрестно реактивными и обладают способностью связываться с полноразмерным S-белком варианта SARS-CoV-2 Омикрон, полученным в системе экспрессии млекопитающих.
2 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Изучение взаимодействия RBD-содержащих коронавирусных антигенов, созданных на основе последовательности уханьского варианта, с сыворотками крови людей, перенесших инфекцию COVID-19, вызванную различными вариантами SARS-CoV-2; отработка технологии получения и очистки структурно модифицированных частиц на основе ВТМ.
Результаты этапа: 1. Сферические частицы (СЧ), которые будут использоваться в проекте в качестве одного из адъювантов для вакцинных композиций, были получены методом термической перестройки из вирионов вируса табачной мозаики (ВТМ), как описано ранее с некоторыми модификациями (Atabekov et al., 2011; Трифонова и др., 2015). Полученные СЧ были охарактеризованы с помощью ряда физико-химических методов. Методами электрофореза в геле было показано, что СЧ ВТМ состоят только из белка оболочки (БО) вируса, РНК в составе СЧ отсутствует. Продемонстрировано, что БО ВТМ не деградирует в процессе формирования СЧ: молекулярная масса БО ВТМ и белка, выделенного из СЧ идентичны. Методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) показано, что полученные частицы по своей морфологии имеют форму сферы и рассчитано среднее значение диаметра СЧ. Для изучения размеров СЧ в жидкости, а также для определения их агрегационного состояния был использован метод анализа траекторий наночастиц (NTA). Среднее значение гидродинамического диаметра СЧ, рассчитанное методом NTA, было сопоставимо с данными ПЭМ. Это свидетельствовало о том, что в жидкости не происходит существенная агрегации СЧ. В результате проведенного исследования методом NTA была определена общее количество CЧ в 1 мл. Несмотря на термическую обработку в процессе формирования СЧ (98ºС), была исследована возможность и подбор условий для дополнительной стерилизации СЧ в стандартных условиях автоклавирования сред с последующей оценкой физико-химическими методами (ПЭМ, NTA) формы, размеров и агрегационного состояния препарата. Установлено, что метод стерилизации препарата СЧ в паровом стерилизаторе при температуре 121 °C, давлении 1 атмосферы и экспозиции длительностью 15 минут является оптимальным по своим параметрам. Выбранные условия стерилизации не оказали существенного влияния на размер, морфологию и количество СЧ в препаратах. Стерильность препарата СЧ подтверждена методом прямого посева в жидкую среду. 2. Разработана методика оценки концентрации белка в составе препарата СЧ с использованием додецилсульфата натрия (ДСН) и спектрофотометрического анализа при длине волны 280 нм. Методика, позволяющая определять концентрацию СЧ, необходима при дальнейшей стандартизации препарата структурно модифицированных вирусов в качестве компонентов вакцинных кандидатов. 3. Изучена возможность формирования комплексов рекомбинантных коронавирусных антигенов с СЧ, стерилизованными методом автоклавирования. Формирование комплексов осуществлялось посредством адсорбции на поверхности СЧ смеси трех рекомбинантных антигенов коронавируса Co1, PE и CoF, взятых в равных соотношениях. Исследование адсорбционных свойств стерилизованных СЧ проведено методом непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием мышиных антисывороток специфичных к антигену CoF, PE или CoF. Результаты иммунофлуоресцентной микроскопии комплексов СЧ-антигены продемонстрировали точное соответствие положения СЧ, наблюдаемых в режиме фазового контраста и флуоресценции. Это означает, что все СЧ покрыты антигенами, что является важным подтверждением сохранением адсорбционных свойств СЧ для формирования комплексов с белками. Это также указывает на сохранение антигенной специфичности рекомбинантных антигенов в комплексах с СЧ, стерилизованными методом автоклавирования. 4. Проведен анализ возможности взаимодействия RBD-содержащих антигенов Co1 и CoF, созданных на основе последовательности уханьского варианта, с сыворотками крови людей, перенесших инфекцию COVID-19, вызванную вариантом Ухань, Дельта и Омикрон. Все сыворотки были проверены на возможность взаимодействия с RBD-содержащими антигенами Co1 и CoF с помощью непрямого метода ИФА. Показано, что RBD-содержащие антигены Co1 и CoF, эффективно реагировали с сыворотками крови людей, инфицированных различными вариантами вируса SARS-CoV-2. Титры антител в сыворотках крови пациентов, переболевших не только вариантом Ухань, но и вариантами Дельта и Омикрон, достоверно отличались от титров антител в неиммунных сыворотках. 5. Получены результаты анализа, свидетельствующие о возможности сывороток животных, иммунизированных рекомбинантными коронавирусными антигенами, обладать перекрестной активностью к S-белку вируса другого варианта (Омикрон). Методом вестерн-блоттинга проанализирована способность поликлональных антител, полученных от животных, иммунизированных смесью антигенов Co1, PE и CoF, распознавать рекомбинантный S-белок SARS-CoV-2 B.1.1.529/«Омикрон» , полученный в системе экспрессии млекопитающих. Показано, что S-белок варианта Омикрон распознаётся мышиной поликлональной антисывороткой, специфичной к смеси антигенов Co1, PE и CoF. Антисыворотка распознавала не только основную полноразмерную форму S-белка, соответствующую основной электрофоретической полосе, но также набор фрагментов и изоформ S-белка с различной электрофоретической подвижностью.
3 1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. Получение вакцинных композиций на основе рекомбинантных антигенов коронавируса и их иммунологическая характеристика.
Результаты этапа: -

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".