Агробиотехнологический потенциал автохтонного метафункционального почвенного микробиомаНИР

Agrobiotechnological potential of autochthonous metafunctional soil microbiome

Соисполнители НИР

МГУ имени М.В.Ломоносова Координатор

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 апреля 2024 г.-31 декабря 2024 г. Агробиотехнологический потенциал автохтонного метафункционального почвенного микробиома
Результаты этапа: 1. В процессе выполнения проекта планируется комплексная оценка разнообразия микробного комплекса, включающая прокариотную (бактерии и археи) его составляющую; выявление способности систем к процессам, направленным на деструкцию труднодоступных соединений (ксенобиотики, биополимеры), трансформацию окисленных и восстановленных форм азота (азотфиксация, нитрификация), синтез вторичных метаболитов (антибиотиков); определение наличия функциональных генов у микроорганизмов, обладающих биотехнологическим потенциалом способных к метаболической активности в почвах, различающихся параметрами основных экологических факторов. К концу первого года выполнения проекта предполагается получение коллекции метафункциональных штаммов почвенных актиномицетов, обладающих одновременно способностью к деградации ксенобиотиков (углеводородов нефти), биополимеров (хитина) и антибиотической активности. У выделенных штаммов планируется детектирование хитиназного гена группы А (chiA), отвечающего за процесс гидролиза хитина, а так же генов xylE, nahC и dmpB, кодирующих синтез ферментов катехол-2,3-диоксигеназа, 1,2-гидроксинафталиндиоксигеназа, ответственных за преобразование субстратов в полуальдегиды. Оценка антибиотической активности выделенных культур актиномицетов будет проведена как в отношении бактерий (грамположительных и грамотрицательных), так и в отношении коллекционных штаммов грибов. У выделенных штаммов с использованием панорамной хромато-масc-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС) будут определены вторичные метаболиты. Предпосевная обработка семян и внесение в почву метафункциональных актинобактерий на фоне искусственного заражения в лабораторных условиях предположительно будет ингибировать рост патогенных грибов Fusarium graminearum, улучшая тем самым показатели энергии прорастания и всхожести, морфологические параметры растений пшеницы. Полученные штаммы почвенных актиномицетов могут быть использованы в биотехнологии для создания биопрепаратов при борьбе с фитопатогенными бактериями и грибами, биоремедиации почв при экологическом земледелии. Вторичные метаболиты выделенных высокоактивных полифункциональных штаммов хитинолитических почвенных актиномицетов могут быть полезны как с точки зрения синтеза эффективных антибиотиков, так и в качестве получения препаратов биоконтроля. 2. В процессе выполнения проекта планируется комплексная оценка разнообразия микробного комплекса, включающая прокариотную (бактерии и археи) его составляющую; выявление способности систем к процессам, направленным на деструкцию труднодоступных соединений (ксенобиотики, биополимеры), трансформацию окисленных и восстановленных форм азота (азотфиксация, нитрификация), синтез вторичных метаболитов (антибиотиков); определение наличия функциональных генов у микроорганизмов, обладающих биотехнологическим потенциалом способных к метаболической активности в почвах, различающихся параметрами основных экологических факторов. К концу первого года выполнения проекта предполагается получение коллекции метафункциональных штаммов почвенных актиномицетов, обладающих одновременно способностью к деградации ксенобиотиков (углеводородов нефти), биополимеров (хитина) и антибиотической активности. У выделенных штаммов планируется детектирование хитиназного гена группы А (chiA), отвечающего за процесс гидролиза хитина, а так же генов xylE, nahC и dmpB, кодирующих синтез ферментов катехол-2,3-диоксигеназа, 1,2-гидроксинафталиндиоксигеназа, ответственных за преобразование субстратов в полуальдегиды. Оценка антибиотической активности выделенных культур актиномицетов будет проведена как в отношении бактерий (грамположительных и грамотрицательных), так и в отношении коллекционных штаммов грибов. У выделенных штаммов с использованием панорамной хромато-масc-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС) будут определены вторичные метаболиты. Предпосевная обработка семян и внесение в почву метафункциональных актинобактерий на фоне искусственного заражения в лабораторных условиях предположительно будет ингибировать рост патогенных грибов Fusarium graminearum, улучшая тем самым показатели энергии прорастания и всхожести, морфологические параметры растений пшеницы. Полученные штаммы почвенных актиномицетов могут быть использованы в биотехнологии для создания биопрепаратов при борьбе с фитопатогенными бактериями и грибами, биоремедиации почв при экологическом земледелии. Вторичные метаболиты выделенных высокоактивных полифункциональных штаммов хитинолитических почвенных актиномицетов могут быть полезны как с точки зрения синтеза эффективных антибиотиков, так и в качестве получения препаратов биоконтроля. 3. Почва представляет собой главный природный банк культур микроорганизмов с полезными для человека свойствами. Выяснение свойств почв, способствующих формированию и сохранению биоразнообразия, получение консорций микроорганизмов, обладающих биотехнологическим потенциалом (способность к азотфиксации, гидролизу природных полимеров и ксенобиотиков, синтезу вторичных метаболитов) – важнейшая научная задача современной микробиологии. Целью исследований являлось выявление специфики устойчивости и развития гидролитических (хитинолитических, углеводородокисляющих) микробных комплексов, обладающих биотехнологическим потенциалом (гидролиз природных полимеров и ксенобиотиков, способность к азотфиксации, синтез вторичных метаболитов) в почвенных экосистемах, установление закономерностей их распространения и зависимости функциональной активности от основных экологических факторов. Проведены исследования филогенетического и функционального разнообразия микробных сообществ широкого набора почвенных объектов с различной степенью нарушенности. В качестве основного стрессорного фактора было выбрано воздействие углеводородов нефти, полиароматических углеводородов (ПАУ) и биополимера хитина в условиях in situ и лабораторных экспериментов. Исследовали воздействие антропогенного фактора на прокариотные сообщества почв как в природных экосистемах (например, на месте разлива нефти (чернозем, торфяная олиготрофная, дерново-подзолистая) или поступления и накопления ПАУ (дерново-подзолистая), так и в модельных опытах с искусственным добавлением углеводородов или биополимеров (чернозем, серая лесная, дерново-подзолистая, каштановая, бурая пустынно-степная, подкурганные каштановые почвы, погребенные вулканические слоисто-пепловые почвы Камчатки, грунты Антарктиды). Для наиболее полной оценки функций почвенного микробиома в работе использовали комплекс методов анализа генетической информации микробиома, ПЦР-определения генов- биомаркеров, оценки физиологически активной части микробиома и измерения функциональной активности. С применением молекулярно-биологических методов и биоинформатического анализа исследовано филогенетическое и функциональное разнообразие прокариотного комплекса почвенных микрокосмов. Установлено снижение биомассы и альфа-разнообразия, а так же смена метаболически активных доминантов – представителей доменов Bacteria и Archaea за счет выхода в доминанты определенных родов – автохтонной микрофлоры, специфичной для определенных условий в микрокосмах, загрязненных нефтью по сравнению с контрольными образцами в процессе микробной сукцессии. Для образцов нефтезагрязненных почв южных широт доминирующая роль принадлежала представителям актинобактерий, для почв центральной и северной широт – протеобактериям. Наряду с сокращением разнообразия и численности прокариот в почвах, подверженных антропогенным или абиогенным нагрузкам установлено возрастание количества генов, маркирующих способность сообщества к биодеградации ксенобиотиков, генов, кодирующих превращения азота и уровень метаболизма кофакторов и витаминов. На фоне сокращения биоразнообразия в загрязненных образцах по сравнению с контролем определено увеличение содержания функциональных генов (в 2-4 раза), отвечающих за синтез катехол-диоксигеназы (xylE), алкан-монооксигеназы (alkB) и 1,2-гидроксинафталиндиоксигеназа (nahC), маркирующих начальный этап деградации углеводородов. При анализе функционального генетического разнообразия сообщества методом восстановления полного метагенома по данным высокопроизводительного секвенирования гена 16 s рРНК было выявлено, что количество генов, маркирующих способность сообщества к биодеградации ксенобиотиков выше в многолетнемерзлых грунтах по сравнению с современными почвами. Внесение субстрата увеличивает долю генов, ответственных за деградацию ксенобиотиков. На длительных сроках загрязнения наблюдается последействие поллютанта и дальнейшее снижение разнообразия при одновременном увеличении численности функциональных генов в сравнении со свежим разливом. Показано наличие ряда ключевых генов цикла азота (nifH, amoA, nirK, chitA) как в современных, так и погребенных горизонтах исследуемых почв. Наличие копий гена nifH бактерий азотфиксаторов, способных обеспечить систему азотом можно рассматривать как один из этапов самовосстановления почв. В современных почвах наличие генов, отвечающих за возможность фиксации молекулярного азота из воздуха было выше по сравнению с погребенными и достигало 4.54×106 копий гена/г.п., для погребенного горизонта 2.5×104 копий гена/г.п. Важно отметить присутствие, хотя и незначительное, гена nifH в более глубоких слоях почвы, что указывает на возможный потенциал обитающих там микробных сообществ. Для вулканических почв (как современных, так и погребенных) удалось выявить наличие генов аммоний окисляющих бактерий и архей. Динамика присутствия гена amoA в современном горизонте вулканической перегнойно-охристой почвы демонстрирует увеличение его концентрации в бактериальном комплексе в вариантах с нефтью (2.3×107 копий ДНК/г.п.) к 10 суткам сукцессии. Бактериальный комплекс способен к нитрификации при высоком загрязнении почвы нефтью, а также его роль возрастает в нижних слоях почвенного профиля. Таким образом, влияние антропогенной нагрузки изменяет «метаболический профиль» почвенных сообществ, что выражается, как в увеличении количества микроорганизмов, обладающих биотехнологически ценными свойствами (кол-во функциональных генов), так и в изменении состава этих микроорганизмов, что открывает возможность для поиска новых биотехнологически ценных штаммов.
2 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Агробиотехнологический потенциал автохтонного метафункционального почвенного микробиома
Результаты этапа: Наиболее важные проблемы XXI века включают борьбу с изменением климата, улучшение состояния почв и создание возобновляемых источников энергии. На сегодняшний день нефть и ее производные остаются одними из основных источников энергии, одновременно представляя собой опасные и стойкие вещества, загрязняющие природную среду. Этот тип загрязнения существенно угрожает наземным экосистемам, снижая качество почвы, изменяя среду обитания флоры и фауны, продовольственную безопасность и здоровье человека. Следствием нефтяных разливов являются глубокие изменения физических, химических и биологических свойств почв, в том числе изменения численности и состава почвенных микроорганизмов. Передовым методом ликвидации нефтезагрязнения и восстановления почвенных экосистем является биоремедиация, в частности, биостимуляция, основанная на подборе наиболее оптимальных условий для углеводородокисляющей деятельности автохтонных микроорганизмов. Многие научные работы демонстрируют положительное воздействие биосорбентов на почвенные процессы и гумусообразование. Примером таких сорбентов может служить биочар, внесение которого в почву стимулирует рост растений и развитие микроорганизмов за счет повышения ферментативной активности, биомассы и разнообразия микробиома. Биочары - твердые углеродистые вещества, получаемые из биомассы различного происхождения (древесные опилки, органические отходы, навоз) с помощью пиролиза (неполного сжигания сырья) при температурах от 200 до 800°C в условиях ограниченного присутствии кислорода. Свойства биочаров изменяются в зависимости от использованного сырья и условий пиролиза. Они могут способствовать задержке воды в песчаных почвах и увеличению дренажа в глинистых почвах во время орошения или затопления, удерживать в почвах аммоний, кальций, фосфор и калий, а также могут использоваться в качестве сорбента, иммобилизуя ксенобиотики, уменьшая тем самым их токсическое воздействие и препятствуя выносу за пределы почвенного профиля. Несмотря на успешные результаты применения биочара, существуют неопределенности в понимании механизмов его влияния на микробное сообщество и процессы трансформации органических соединений в почвах вследствие неодинаковых свойств биочаров, произведенных из различных типов биомассы и при разных условиях пиролиза. Окисление углеводородов микроорганизмами – ведущий фактор природного процесса деградации нефти, в связи с этим, для разработки эффективных стратегий биоремедиации требуется подробное изучение метаболически активного прокариотного комплекса почв, его таксономического разнообразия и биотехнологического потенциала. Цель: оценка таксономического и функционального разнообразия прокариотного сообщества почв, загрязненных нефтепродуктами при внесении биочара. Объектами исследования были прокариотные сообщества гумусовых горизонтов следующих типов почв, отобранных в Московской области: (1) подзола, или подзола глееватого или Podzol histic gleyic fluvic; Орехово-Зуевский городско округ, вырубка в сосновом бору, злаково-разнотравный луг на водоразделе (N 55°49′17″, E 38°56′37″); С 8,28±0,03%, N 0,43±0,02%, C/N 19, рН 4,5; (2) дерново-подзолистой или Luvisol podzolic; Одинцовский городской округ, территориальное управление Жаворонковское, залежь, разнотравно-злаковый луг на водоразделе (55°38′18″, 37°6′59″); С 1,18±0,03%, N 0,13±0,01%, С/N 9, рН 4,0; (3) серой лесной или Luvisol mollic; городской округ Кашира, деревня Сорокино, Новая улица, залежь, разнотравно-злаковый луг на склоне (54°49′48″, 38°14′19″); С 1,44±0,03%, N 0,15±0,01%, С/N 9, рН 4,0. Элементный анализ твёрдых проб проводили на CHNS-анализаторе Vario EL III (Elementar). Было исследовано влияние на аборигенные прокариотные сообщества высокозольного биочара, полученный из древесного сырья при температуре 700°C (C 51,75±0,03, N 0,10±0,01, зольность 44,5±0,03%). Рассматривали две серии инкубационных экспериментов: в одной оценивали влияние биочара на разнообразие и функции прокариотного сообщества почв, загрязненных нефтепродуктами, в другой – влияние биочара в незагрязненных углеводородами нефти образцах. В качестве загрязняющего нефтепродукта использовали зимнее дизельное топливо 3-го класса ДТ-3-К3. Дизельное топливо вносили в подготовленную почву в концентрации 10% от массы, через 7 дней после удаления легколетучей фракции нефтепродуктов во флаконы с почвой добавляли биочар в количестве 5% от массы почвы. Эксперимент проводили в течение месяца при постоянных значениях влажности почвы (значения матричного давления соответствовали (Р = –300 кПа) средней влажности) и температуры (28°C) методом инициированной сукцессии. Аналогичным образом инкубировали почвенные образцы, незагрязненные углеводородами, с внесением и без внесения биочара. Для анализа биоразнообразия прокариотного комплекса исследуемых образцов почв применяли метод высокопроизводительного секвенирования консервативного участка гена 16S рРНК. Для экстракции тотальной ДНК применяли стандартные методы Power Soil DNA Isolation Kit (MO BIO, США), руководствуясь инструкциями производителя. Амплификацию фрагментов гена 16S рРНК осуществляли с помощью вырожденных праймеров, комплементарных последовательностям как бактерий, так и архей: PRK341F (CCTACGGGRBGCASCAG) и PRK806R (GGACTACYVGGGTATCTAAT). Полученные ПЦР-фрагменты очищали на колонках QIAquick согласно протоколу производителя. Нуклеотидные последовательности вариабельных фрагментов генов 16S рибосомальных РНК из образцов метагеномной ДНК определяли с помощью высокопроизводительного секвенирования. Секвенирование проводили на полигеномном секвенаторе Illumina Miseq, время прочтения 39 ч, количество pair-endreads (парных прочтений) ̶ 8 млн. Обработку данных секвенирования проводили с использованием автоматизированного алгоритма QIIME 1.9.1. Люминесцентно-микроскопическим методом с использованием флуорохрома акридина оранжевого определяли общую численность и рассчитывали биомассу в исследуемых образцах. Для прямого учета микроорганизмов использовали микроскоп Axioskop 2 plus, ZEIZZ, Германия. Метод ПЦР в реальном времени применяли для количественного анализа числа копий ДНК функциональных генов xylE, в исследуемых вариантах почвенных микрокосмов. Измерение проводили на детектирующем амплификаторе DТLite4 ДНК-Технология. Обработка полученных результатов была сделана с использованием пакета программы Realtime_PCR. Для проведения анализа на содержание нефтяных углеводородов после окончания инкубации образцы почв высушивали до воздушно-сухого состояния, гомогенизировали и пропускали через сито 0,25 мм. Экстракцию углеводородов проводили с использованием системы ускоренной автоматической экстракции субкритическими растворителями ASE 200 (Dionex). В пробах определяли суммарное содержание алкилированных и неалкилированных двух- и трех-ядерных полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) - нафталинов, бифенилов, флуоренов, фенантренов. Качественную идентификацию и количественное определение ароматических углеводородов в пробах проводили методом капиллярной газо-жидкостной хроматографии на газовом хроматографе Agilent 7890B с квадрупольным масс-селективным детектором MSD5977B и системой обработки данных MassHunter, MSDChem. Идентификацию соединений проводили по временам удерживания и масс-спектрам (библиотека NIST Mass Spectral Library, 2.0ver., 2008, 986100 соединений). Количественное определение каждой группы ПАУ проводили по доминирующим фрагмент-ионам. В качестве внешнего стандарта для калибровки использовали растворы ПАУ СОП 0118-03 ER-PAH. Калибровку проводили по четырем уровням, отклонения от линейности не превышали 10%. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы STATISTICA 8.0. Все пробы почв анализировали в 5-кратной повторности. РЕЗУЛЬТАТЫ Люминесцентно-микроскопическим методом установлено, что значения общей численности и биомассы клеток прокариот в загрязненных нефтепродуктами почвах были ниже (в 2-3 раза) по сравнению с контрольными образцами. Такая закономерность прослеживалась во всех исследуемых образцах почв. Добавление биочара в почвенные незагрязненные образцы незначительно влияло на изменение численности прокариотной компоненты. Интересно отметить, что при добавлении биочара в почвенные системы, загрязненные углеводородами нефти, численность и биомасса прокариот значимо возрастала, достигая наибольших значений для образцов подзола (700 мкг/г почвы), что на порядок выше по сравнению с опытными вариантами без биочара (25 мкг/г почвы). Отмеченную особенность можно объяснить существующими механизмами взаимодействия микроорганизмов с биочаром, как со средой обитания. Микроорганизмы могут адсорбироваться на поверхности частичек биочара за счёт различных процессов, включая гидрофобное и электростатическое притяжение. Иммобилизация микроорганизмов на биочаре включает и инкапсуляцию в пористую матрицу, и агрегацию, что приводит к оструктуриванию загрязненных образцов. Также могут иметь место процессы адгезии. Интенсивность этого процесса зависит от содержания в биочаре минеральных обломков, а также от количества и размера пор. Кроме того биочар может изменять кислотность почвенных образцов в сторону подщелачивания, что в свою очередь воздействует на структуру микробного сообщества почв. Метод высокопроизводительного секвенирования позволил изучить филогенетическую структуру бактериального сообщества исследуемых почв. Наибольшее разнообразие (индекс Шеннона 5,88) отмечалось для образцов серой лесной почвы, наименьшее – для образцов подзола (индекс Шеннона 2,61). Важно отметить, что при наличии загрязнения во всех исследуемых образцах почв, происходило снижение альфа-разнообразия по сравнению с контролем, аналогично снижению общей численности клеток прокариот, что согласуется с ранее проведенными исследованиями. Внесение биочара к загрязненным образцам не приводило к значимым изменениям в микробном разнообразии, альфа-разнообразие оставалось пониженным по сравнению с контрольным образцом, доминантами в бактериальном комплексе становились представители, способные к деструкции углеводородов нефти. Наиболее устойчивые к загрязнению нефтепродуктами представители исследуемых почв различались уже на уровне филумов. Так, для подзола и дерново-подзолистой почв, загрязненных нефтепродуктами представители филума Pseudomonadota занимали 50% от всего выявляемого сообщества прокариот вне зависимости от добавления биочара, что согласуется с ранее полученными в других исследованиях данными. Интересно отметить, что добавление биочара заметнее всего изменило структуру сообщества в образцах подзола: при доминировании представителей Pseudomonadota, доля Acidobacteriota снижалась до 9%, в то время как доля Actinomycetota возрастала. Очевидно, это может быть связано, как отмечалось выше, с изменением кислотности почвенных образцов при внесении биочара в сторону подщелачивания, а также с гранулометрическим составом биочара, на что указывают некоторые авторы. На сегодняшний день известно, что некоторые штаммы видов Pseudomonas pickettii и P. fluorescens способны проводить биодеградацию бензола, толуола, этилбензола и ксилола с участием катехол-2,3-диоксигеназы и с использованием нитрата в качестве альтернативного акцептора электронов в условиях ограниченного доступа кислорода в водоносных почвенных горизонтах, загрязненных нефтью. Для образцов серой лесной почвы в контрольных вариантах и с добавлением биочара наблюдается наибольшее разнообразие и выравненность прокариотного сообщества. После внесения нефтепродукта (вне зависимости от наличия биочара) разнообразие снижается и в доминанты выходят представители филума Actinomycetota (до 42% от всего выявляемого сообщества), что согласуется с данными, полученными авторами ранее. Анализ бета-разнообразия родового и видового состава сообщества методом главных компонент с применением метрики Дженсена-Шеннона на уровне сходства 97% достоверно разделил исследуемые варианты на три кластера, наиболее значимым фактором кластеризации выступал тип почв, второй уровень проходил по наличию в почве нефтепродуктов. При внесении углеводородов нефти и биочара в подзоле в доминанты выходили роды протеобактерий Massilia и Paraburkholderia (20% и 16% от выявляемого сообщества, соответственно). В дерново-подзолистой почве – Ramlibacter solisilva 26%, Masillia 6%. Для образцов серой лесной почвы стрептомицеты занимают 14% от всех бактерий, Nocardioides 8%, Gaiella 3%, Bacillus 8% . Катаболизм нефтяных углеводородов не ограничен некоторыми определенными родами, особенно учитывая, что большинство бактериальных филогенетических семейств до сих пор неизвестны. Многие катаболические пути передаются на плазмидах, большинство плазмид деградации могут быть конъюгированными или самопередаваемыми. Катехол-2,3-диоксигеназа является продуктом гена xylE и катализирует реакции разложения таких ароматических соединений, как бензол, толуол, ксилол, фенол, нафталин и бифенил. Фермент имеет четыре идентичных субъединицы, каждая с молекулярной массой 35 кДа, и для его активности требуется молекулярное железо. Ген xylE в основном обнаруживается у грамотрицательных бактерий, однако также присутствует у некоторых грамположительных бактерий, таких как Rhodococcus и Arthrobacter. Таким образом, обнаружение функциональных генов, участвующих в деградации загрязняющих веществ, может использоваться как прямой метод мониторинга биодеградации нефтяных углеводородов. В исследуемых почвенных образцах была проведена детекция функционального гена xylE, кодирующих синтез фермента катехолдиоксигеназы. Применение методов математической статистики дало возможность оценить влияние различных параметров (наличие углеводородов нефти и биочара в исследуемых типах почв) на содержание функциональных генов, кодирующих синтез ферментов, отвечающих за деструкцию ароматических углеводородов. С применением статистического анализа установлено, что в нефтезагрязненных почвах, при инкубировании образцов с биочаром, на фоне возрастания общей биомассы прокариот по сравнению с загрязненными почвами без биочара, наблюдается достоверное увеличение численности копий функционального гена xylE. Наибольшее содержание гена, кодирующего синтез катехол-2,3-диоксигеназы, было отмечено для образцов загрязненного подзола с внесением биочара. Любой конкретный ген на плазмидах поддерживается в популяции всего несколькими клетками, что требует минимальной энергии от популяции в целом, но готово распространяться под селективным давлением, таким как загрязнение нефтью. Таким образом, кинетика обилия конкретных катаболических генов на загрязненных участках может обеспечить перспективу для прерывания процессов рекультивации. Как чрезвычайно сложная смесь, нефтяные углеводороды можно классифицировать на множество фракций, и существуют различные функциональные гены, ответственные за биодеградацию определенных классов углеводородов. Следует уточнить, что число копий гена характеризует лишь потенциально возможное протекание процесса. Для оценки же интенсивности процесса необходимо дальнейшее исследование на экспрессию этого гена в системе. Тем не менее, оценка содержания внесенных с дизельным топливом ПАУ на 30 сутки эксперимента показала, что наименьшее суммарное содержание нафталинов, бифенилов, флуоренов и фенантренов установлено именно для вариантов с биочаром, причем указанная особенность отмечается для всех исследуемых почв. Авторами был рассчитан «отклик прокариотного сообщества» исследуемых загрязненных почвенных образцов на внесение биочара. «Отклик» представляет собой отношение общей биомассы всех клеток прокариот в варианте с дизелем и биочаром к биомассе в варианте с дизелем. Величина «отклика» достигает наибольших значений для образцов подзола. Следует отметить, что суммарное содержание двух- и трех-ядерных ПАУ в почвах имеет обратную корреляцию с откликом прокариотного сообщества на внесение биочара. На 30 сутки эксперимента для образцов подзола отмечается наименьшее содержание всех ПАУ при наибольшем «отклике» прокариот на внесение биочара в загрязненную систему. Напомним, что именно для этих вариантов во всех исследуемых почвах установлена максимальная численность биомассы и наибольшее число копий гена хylE. На сегодняшний день известны несколько механизмов воздействия биочара на функциональную микробную компоненту. Один из механизмов ускорения биодеградации нефтепродуктов в почве связан со снижением токсического стресса за счет обратимой селективной сорбции наиболее токсичных углеводородов (полиаренов) и их промежуточных продуктов окисления. Другой механизм положительного действия сорбентов и снижения токсичности нефтезагрязненной почвы объясняется повышением влагоемкости и пористости почв за счет внутрипорового пространства внесенного сорбента. Однако в присутствии повышенных доз сорбентов этот процесс может замедляться вследствие цементирования почвенных агрегатов в результате выделения избыточных концентраций двухвалентных катионов или моно- и поликремниевых кислот. Третий механизм действия сорбентов может быть связан с изменением рН почвы. Динамика его изменения показывает, что внесение сорбентов может повлиять на рН почвы как в ту, так и в другую сторону. Внесение некоторых минеральных сорбентов, например, цеолита и вермикулита, может привести к небольшому повышению рН почвы, а органических и углеродистых сорбентов с высоким содержанием растительных остатков (торф и опилки) или аморфного углерода (биочар) – к избыточному подкислению почвы, особенно в присутствии высоких доз минеральных удобрений. Поэтому внесение повышенных доз сорбентов может привести к замедлению процесса биоремедиации, как в результате излишнего подкисления, так и подщелачивания почвы. Этот факт следует учитывать при выборе дозы сорбента. С применением молекулярно-биологических методов (RT-PCR, метабаркодинг) и люминесцетной микроскопии исследовано влияние биочара на структуру прокариотного комплекса почв, загрязненных нефтепродуктами (подзола, дерново-подзолистой и серой лесной). Внесение биочара к почвенным образцам с нефтепродуктами приводило к значимому увеличению (на порядок для подзола) биомассы прокариот по сравнению с вариантами без него. На фоне возрастания биомассы, разнообразие прокариотной составляющей при добавлении биочара в почвы с НП (спустя месяц) остается ниже контрольных незагрязненных образцов за счет выхода в доминанты определенных представителей углеводородокисляющих бактерий. Так, для подзола и дерново-подзолистой почв, загрязненных нефтепродуктами, представители филума Pseudomonadota занимали 50% от всего выявляемого сообщества прокариот вне зависимости от добавления биочара. Для образцов серой лесной почвы после внесения нефтепродукта (вне зависимости от наличия биочара) в доминанты выходят представители филума Actinomycetota (до 42% от всего выявляемого сообщества). Для каждой из исследуемых почв определены наиболее устойчивые к нефтезагрязнению роды бактерий. В загрязненных образцах с добавлением биочара наблюдается увеличение содержания функциональных генов, отвечающих за синтез катехол-2,3-диоксигеназы (xylE) маркирующих начальный этап деградации углеводородов. Установлено, что при внесении биочара в загрязненные дизельным топливом почвы к 30 суткам эксперимента отмечается наибольшее число копий гена xylE и наименьшее содержание остаточных 2-3-ядерных полициклических ароматических углеводородов, внесенных с дизельным топливом. В загрязненных почвах снижение суммарного содержания нефтяных ПАУ в результате деградации через 30 суток составило 5-10%, в присутствии биочара 17-27%. Полученные результаты численности, биомассы, таксономического разнообразия прокариотного сообщества почв могут быть полезны для разработки эффективных стратегий биоремедиации нефтезагрязненных территорий.
3 1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. Агробиотехнологический потенциал автохтонного метафункционального почвенного микробиома
Результаты этапа: -

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".