ИСТИНА

Спектроскопия ЯМР – важнейший метод исследования биомолекулярных систем, предоставляющий информацию структуре молекул, их динамических свойствах, межмолекулярных взаимодействиях и концентрации веществ. Настоящий проект посвящён решению нескольких актуальных биомедицинских задач, для которых спектроскопия ЯМР является оптимальным методом получения информации. Методы ЯМР будут использованы для изучения структуры, динамики и межмолекулярных контактов димеризующихся C2H2-доменов нового семейства архитектурных белков D. melanogaster, найденных коллегами из Института биологии гена РАН. Архитектурные белки участвуют в изменении трёхмерной структуры хроматина, координируя транскрипцию. Нарушение транскрипции приводит к развитию рака и других тяжёлых заболеваний, что определяет актуальность задачи. Методы ЯМР будут использованы для установления строения нескольких новых антибиотиков, выделенных из актинобактерий коллегами из ИБХ РАН. Их антибактериальные свойства и механизм действия определены коллегами с Химического факультета МГУ. Структура новых антибиотиков будет определена на основе данных ЯМР и квантово-химических расчётов спектральных параметров. Совместно с коллегами из НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе будет проведён поиск новых гибридных производных триазола и тиазолидина. Предварительные результаты показали высокую противогрибковую активность этих гибридов. Методы ЯМР будут использованы для выбора наиболее эффективных направлений синтеза этих соединений. Актуальность поиска новых антибиотиков и антимикотиков вызвана возрастающей резистентностью патогенов к препаратам, применяемым в медицинской практике. Методами ЯМР скрининга будут продолжены работы по поиску и дизайну новых ингибиторов бактериальных ферментов — неорганической пирофосфатазы из M. tuberculosis и формиатдегидрогеназы из S. aureus. Планируется поиск новых молекул, связывающихся с аллостерическими сайтами этих ферментов. Методы ЯМР метаболомики будут использованы для идентификации биомаркеров функционального состояния людей, человеческих клеток и генетически-модифицированных животных. Совместно с коллегами из ИФГ МГУ будет проведен метаболомный профайлинг мочи и крови двух линий мышей, нокаутных по генам METTL4 и THUMPD2. Эти гены кодируют метилтрансферазы, регулирующие сплайсинг. Мыши, нокаутные по этим генам, могут проявлять фенотип, характерный для диабета II типа. Метаболомное профилирование этих животных позволит оценить уровень метаболитов, ассоциированных с проявлениями диабета. Совместно с коллегами из Института питания будет проведена оценка влияния кетоновой диеты на метаболом человека. Для этого будет проведено метаболомное профилирование мочи и крови людей, принимавших 3 гидроксибутират в качестве добавки к пище. Будут проведены метаболомные исследования клеток человека, в которых воспроизведены мутации, обнаруженные у пациентов с раком лёгкого. Эти мутации найдены на основании результатов секвенирования биопсии опухолевой ткани. Методы ЯМР метаболомики позволят определить, вызывают ли такие мутации злокачественное перерождение клетки, то есть являются ли они драйверами онкогенеза. В отличие от нормальных клеток, большинство раковых клеток производят энергию преимущественно с помощью гликолиза с образованием молочной кислоты. Измерение концентрации метаболитов позволит выявить злокачественную трансформацию клеток под действием введённых в геном мутаций. Актуальность этой задачи связана с возможным использованием полученных данных для диагностики и лечения онкологических больных.

NMR spectroscopy is one of the most important methods for studying biomolecular systems, providing information on the structure of molecules, their dynamic properties, intermolecular interactions and concentration of substances. This project is dedicated to solving several biomedical problems for which NMR spectroscopy is the optimal method for obtaining information. NMR methods will be used to study the structure, dynamics and intermolecular contacts of dimerizing C2H2 domains of a new family of architectural proteins of D. melanogaster, discovered by colleagues from the Institute of Gene Biology. Architectural proteins are involved in changing the three-dimensional structure of chromatin by coordinating transcription. Transcription disruption leads to the development of cancer and other serious diseases, which determines the relevance of the problem. NMR methods will be used to determine the structure of several new antibiotics isolated from actinobacteria by colleagues from the Institute of Bioorganic Chemistry. Their antibacterial properties and mechanism of action were determined by colleagues from the Faculty of Chemistry of Moscow State University. The structure of new antibiotics will be determined based on NMR data and quantum chemical calculations of spectral parameters. Together with colleagues from the Gause Institute of New Antibiotics we will search for new hybrid derivatives of triazole and thiazolidine. Preliminary results showed high antifungal activity of these hybrids. NMR methods will be used to select the most effective routes for the synthesis of these compounds. The relevance of the search for new antibiotics and antimycotics is caused by the increasing resistance of pathogens to drugs used in medical practice. Using NMR screening techniques, we will continue to search and design new inhibitors of bacterial enzymes - inorganic pyrophosphatase from M. tuberculosis and formate dehydrogenase from S. aureus. It is planned to design new molecules that bind to allosteric sites of these enzymes. NMR metabolomics methods will be used to identify biomarkers of the functional state of people, human cells and genetically modified animals. Together with colleagues from the Institute of Physics and Geology of Moscow State University, metabolomic profiling of urine and blood of two strains of mice knockout for the METTL4 and THUMPD2 genes will be carried out. These genes encode methyltransferases that regulate splicing. Mice knockout for these genes may exhibit a phenotype characteristic of type II diabetes. Metabolomic profiling of these animals will allow us to assess the levels of metabolites associated with diabetes. Together with colleagues from the Institute of Nutrition, the effect of the ketone diet on the human metabolome will be analysed. To do this, metabolomic profiling of the urine and blood of people who took 3 hydroxybutyrate as a dietary supplement will be carried out. Metabolomics studies will be conducted on human cells that replicate the mutations found in patients with lung cancer. These mutations were found based on the results of sequencing a biopsy of tumor tissue. NMR metabolomics methods will make it possible to determine whether such mutations cause malignant degeneration of the cell, that is, whether they are drivers of oncogenesis. Unlike normal cells, most cancer cells produce energy primarily through glycolysis to produce lactic acid. Measuring the concentration of metabolites will reveal the malignant transformation of cells under the influence of mutations introduced into the genome. The relevance of this task is associated with the possible use of the obtained data for the diagnosis and treatment of cancer patients.

В результате выполнения проекта будут получены новые знания о белках, регулирующих процессы транскрипции, о биомаркерах функционального состояния лабораторных животных, людей и клеточных линий, а также о структуре новых соединений, обладающих антибактериальной и противогрибковой активностью. Кроме того, в ходе выполнения проекта будут оптимизированы методы спектроскопии ЯМР и анализа спектральных данных для решения актуальных биомедицинских задач. В результате исследований гомодимеризующихся N-концевых доменов типа ‘C2H2-цинковые пальцы’ нового семейства архитектурных белков D. melanogaster будет получена информация об их структуре в растворе, динамических свойствах белковой цепи и строении интерфейса межмолекулярного взаимодействия. Координаты атомов всех исследованных белков будут депонированы в международную базу белковых структур (https://www.rcsb.org/). Полученная информация важна для понимания деталей молекулярных механизмов регуляции транскрипции в клетках высших организмов, в частности роли архитектурных белков в поддержании дистанционных взаимодействий в хроматине. В результате выполнения части проекта, посвящённого установлению строения новых антибиотиков – ингибиторов трансляции, выделенных из природных объектов (актинобактерий), методами спектроскопии ЯМР и квантовой химии будет определена структура нескольких новых антибиотиков, в том числе соединений пептидной природы. Эти данные важны для создания новых антибактериальных препаратов, что является чрезвычайно актуальной задачей из-за возрастающей резистентности бактерий к уже применяемым антибиотикам. Ранее нами уже были идентифицированы структуры нескольких соединений, включая антибиотик принципиально нового строения, названный аурапланином. Предполагается, что в ходе реализации проекта будут найдены ещё несколько новых структур. В ходе поиска новых соединений, обладающих противогрибковыми свойствами среди гибридных аналогов оригинального препарата микозидина и широко применяемого препарата флуконазола, предполагается найти соединения, активные в отношении нескольких штаммов патогенных грибов, вызывающих серьёзные системные заболевания у людей. Такие соединения могут в дальнейшем послужить основой для создания новых антимикотиков, преодолевающих резистентность таких грибов, как Cаndida albicans, Candida auris, Candida parapsilosis, а также дерматофитов (грибов Arthrodermataceae). В ходе выполнения этой части проекта планируется получить и новые фундаментальные знания о химических превращениях производных тиазолидин-2,4-диона. Методами ЯМР метаболомики будет проведён поиск биомаркеров функционального состояния людей, человеческих клеточных линий и лабораторных животных. В результате анализа метаболома мочи и крови 135-ти добровольцев, принимавших 3 гидроксибутират в качестве пищевой добавки, будут выявлены потенциальные биомаркеры этого соединения и проведена оценка влияния кетоновой диеты на метаболом человека. Актуальность этого исследования состоит в оценке возможности применения экзогенных кетоновых тел в медицинской практике для реабилитации, поддержания когнитивной и физической деятельности, восстановления после нагрузок у спортсменов, и мобилизации жировых запасов в ходе лечения ожирения. Исследование влияния кетоновой диеты на метаболом с помощью ЯМР-метаболомики будет проведено впервые в мире. Результатом метаболомного профайлинга мочи и крови двух линий генетически-модифицированных мышей, нокаутных по генам METTL4 и THUMPD, будет установление функциональной роли соответствующих метилтрансфераз, модифицирующих компоненты сплайсосомы. Планируется, в частности, ответить на вопрос, ассоциированы ли эти ферменты с проявлениями диабета II типа. Актуальность таких исследований определяется не только необходимостью получения фундаментальных знаний, но и перспективой их применения для интерпретации аналогичных дисфункций у человека. Предполагается, что метаболомные исследования клеточных линий, в геноме которых воспроизведены мутации, потенциально вызывающих рак лёгкого, должна быть получена информация о возможности детектирования злокачественного перерождения клеток методами ЯМР метаболомики. Если изучаемые мутации окажутся драйверами онкогенеза, то скрининг на них будет в дальнейшем включён в линейку диагностических генетических тестов в онкологии. Ожидаемые результаты проекта имеют фундаментальную значимость и очевидные перспективы практического применения в медицине. Цели проекта соответствуют направлению Стратегии научно-технологического развития РФ «Переход к персонализированной медицине, высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения, в том числе за счёт рационального применения лекарственных препаратов (прежде всего антибактериальных)». Это относится как к поиску новых антибактериальных и противогрибковых соединений, так и к развитию методов ЯМР метаболомики для решения задач персонализированной медицины. Результаты исследования планируется публиковать преимущественно в ведущих международных высокорейтинговых научных журналах и престижных российских изданиях.

У научного коллектива имеется значительный научно-методический задел по всем планируемым направлениям исследований. Участники коллектива обладают значительным опытом проведения структурных исследований методом ЯМР. За предыдущие годы членами научного коллектива определено и депонировано в международный банк PDB (https://www.rcsb.org/) 26 структур белков или их комплексов. Руководителем проекта созданы компьютерные программы, предназначенные для автоматизации процесса расчёта трёхмерной структуры белка, для обработки результатов релаксационных измерений ЯМР, анализа спектральных данных в условиях химического обмена и т.п. Выполнено отнесение сигналов ЯМР для белковой цепи ферментов Mt-PPазы и Sa-ФДГ. Отработаны методики получения этих белков, обогащённых стабильными изотопами 13C, 15N и 2D. По направлению определения структуры димеризующихся эффекторных доменов транскрипционных факторов D. Melanogaster также имеется значительный научный задел, включая получение генетических конструкций для бактериальной и дрожжевой экспрессии N-концевых C2H2-доменов цинковых пальцев всех отобранных белков. Коллектив обладает необходимым научным заделом для выполнения запланированных исследований по ЯМР метаболомике. У научного коллектива имеется всё необходимое для выполнения задачи функциональной геномики — оценки влияния удаления генов THUMPD2 или METTL4 на метаболом мышей. В виварии у коллег уже живут выведенные линии мышей, нокаутных по генам THUMPD2 или METTL4, для которых запланировано метаболомное профилирование мочи и крови. Имеется значительный задел и в области поиска новых соединений с антимикробной и противогрибковой активностью. Таким образом, по всем планируемым направлениям исследований у научного коллектива уже есть задел, гарантирующий получение новых интересных научных результатов, имеющих как фундаментальную, так и потенциальную прикладную значимость.