ИСТИНА

Целью НИР будет получение модельных транскриптов и экспериментальное изучение условий образования их комплексов с мечеными олигонуклеотидными зондами на примере нескольких маркерных генов рака молочной железы В задачи работы будут входить анализ последовательностей транскриптов маркерных генов из баз данных, выбор участков идентификации, выбор структуры олигонуклеотидных зондов, изучение условий получения модельных транскриптов, их комплексов с зондами и их определение методом твердофазного анализа в 96-луночных планшетах

Breast cancer (BC) is a malignant tumor formed by epithelial cells of breast tissue. The development of this type of malignant tumors is the most common malignant disease in women and the main cause of their mortality. In Russia, every tenth woman faces this problem. Despite the external localization, the neoplasm is often detected already in the terminal phase (about 30% of cases are detected only at stages III and IV of the disease). However, this type of cancer is one of the most manageable and treatable when detected at an early stage: with early detection, the probability of complete recovery is 96%. Currently, several biological subtypes of breast cancer are distinguished, determined by differences in the expression profiles of several marker genes. Determining the subtype of breast cancer allows you to choose a method of drug therapy that can be based on the use of hormones and targeted drugs, which improves the prognosis of effectiveness. The determination of the biological subtype of breast cancer can be carried out on the basis of data on the expression of marker genes of tumor tissue. For these purposes, oligonucleotide probes that are complementary in structure to the gene under study can be used. To select the structures of oligonucleotide probes, it is necessary to develop experimental transcript models of breast cancer marker genes. The purpose of this work is to create experimental models for the determination of transcripts of breast cancer marker genes (the ESR1 estrogen receptor gene, the ERBB2 epidermal growth factor 2 receptor gene, and the PGR progesterone receptor gene). The objectives of the work included: selection of marker gene sites for obtaining model transcripts, selection of sequences of oligonucleotide probes for determining model transcripts, obtaining complexes of model transcripts with probes and their determination by solid-phase analysis in sandwich format.

Будут исследованы условия получения фрагментов маркерных генов из образцов кДНК методом ПЦР (температурный режим, время отдельных стадий циклов амплификации) и условия получения транскриптов из них (время реакции, добавление праймера Т7). Будет проведен анализ последовательностей транскриптов маркерных генов из баз данных, проведен выбор участка транскрипта для идентификации, выбраны структуры пар олигонуклеотидных зондов (не менее двух для каждого маркерного гена). Будет проанализировано их расположение относительно структуры определяемого транскрипта и рассчитаны характеристики. Будет проведено экспериментальное изучение условий формирования комплексов модельных транскриптов генов с парами олигонуклеотидных зондов. Анализ продуктов реакции будет проводиться методом электрофореза в агарозе и методом иммуноанализа в планшетах с использованием щелочной фосфатазы в качестве метки. Будет исследовано влияние молярности и состава буферной смеси, соотношения меченых зондов на эффективность образования комплексов и их последующее определение на планшетах. Будет исследовано влияние ингибитора РНКаз на стабильность модельных транскриптов и их комплексов при хранении.

Результаты НИР по договору 550/23, полученные в 2023 г.

Проведен анализ представленности альтернативных транскриптов выбранных маркерных генов РМЖ (ESR1, ERBB2, PGR) в базе данных NSBI, выбраны последовательности модельных транскриптов разных размеров, подобраны последовательности праймеров для амплификации соответствующих фрагментов 2х-цепочечных ДНК генов из кДНК, полученной из образцов транскриптов человека. Исследованы условия получения фрагментов исследуемых генов разной длины методом ПЦР из образцов кДНК, выбраны оптимальные структуры праймеров и оптимизирована температура их отжига в реакции ПЦР. Получены образцы модельных транскриптов генов РМЖ трех типов в реакции транскрипции in vitro. Показана необходимость использования ингибитора РНКаз для повышения стабильности модельных транскриптов. Подобраны по несколько пар олигонуклеотидных зондов для определения маркерных генов трех типов. Пары зондов различаются по положению относительно последовательности определяемого транскрипта. В качестве метки зондов использовались биотин и карбоксифлуоресцеин (FAM). Получены комплексы модельных транскриптов с парами меченых олигонуклеотидных зондов. Проведено определение комплексов модельных транскриптов с олигонуклеотидными зондами методом твердофазного анализа в формате сэндвич и щелочной фосфатазой в качестве метки. Выбраны лучшие пары зондов, обеспечивающие более высокую чувствительность определения транскриптов каждого из трех типов генов в твердофазном анализе. Проведено исследование влияния длины зондов, длины спейсера, добавок LNA и дополнительных зондов на чувствительность определения комплексов модельных транскриптов гена ESR1. Показано, что удлинение зонда, удлинение спейсера, введение LNA и добавление дополнительных меченных FAM зондов к другому участку последовательности транскрипта способствует увеличению чувствительности определения модельного транскрипта гена ESR1 в твердофазном анализе.