| 1 |
6 мая 2024 г.-31 декабря 2024 г. |
Создание клеточных моделей лейкозов с хромосомными транслокациями гена MLL (KMT2A) для разработки перспективных подходов к их диагностике, риск-стратификации и терапии |
| Результаты этапа: В результате выполнения задач 2024 года были получены следующие результаты:
— Разработана эффективная методика получения моноклонов, содержащих целевые транслокации. Трансфекция проводится на приборе Neon transfection system (Thermo Fisher Scientific), используется 8 мкг плазмиды и 2 млн клеток, 2 пульса 1050В по 30 мс. Чтобы скриниг клонов был менее затратным как с точки зрения времени, так и ресурсов, мы разработали оптимальный протокол прямой ПЦР. Также мы уменьшили общее число реакций ПЦР-скрининга для выявления клонов с перестройкой за счет объединения по несколько образцов в одну реакцию с дальнейшим скринингом отдельных образцов внутри группы с положительным результатом. Так как мы рассчитываем лишь на единичные положительные образцы среди десятков субпопуляций, такая стратегия позволяет снизить общее число ПЦР. Для повышения чувствительности ПЦР на некоторых этапах работы использовали вложенную ПЦР.
— Определена примерная частота формирования целевых транслокаций после трансфекции клеток и отбора на клеточном сортере. Для транслокаций MLL-AF4 и MLL-ARHGAP26 в данном эксперименте она составила порядка 1 на 350 и 1 на 600 клеток, соответственно.
— Получены моноклоны модельных линий с транслокациями MLL-AF4 и MLL-ARHGAP26. Полученные моноклоны охарактеризованы на предмет наличия перестроек с помощью ПЦР и кариотипирования, а также методом FISH. Также клоны охарактеризованы на предмет экспрессии химерного гена методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией — показана экспрессия химерных генов. Для каждой транслокации было получено несколько клонов, но из них были выбраны те, чей кариотип наиболее приближен к кариотипу исходной линии клеток LCL. Участки перестройки были отсеквенированы по Сэнгеру.
— Для моноклонов с подтвержденной транслокацией, а также для моноклонов исходной линии без перестройки, получены РНК-библиотеки с обогащением по поли(А)-РНК.
— Проведено секвенирование полученных библиотек до глубины 30M пар ридов. Проведен анализ полученных данных: выполнен поиск слитых транскриптов для выявления дополнительных транслокаций; проведен анализ изоформ транскриптов; данные, полученные для клеточных линий, сопоставлены с данными, полученными на транскриптомах опухолевых клеток пациентов.
— Получены плазмидные векторы, содержащие гены РНК-гидов для внесения разрывов в целевые интроны гена MLL и получения клеток с делецией части этого гена. |
| 2 |
1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. |
Создание клеточных моделей лейкозов с хромосомными транслокациями гена MLL (KMT2A) для разработки перспективных подходов к их диагностике, риск-стратификации и терапии |
| Результаты этапа: |
| 3 |
1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. |
Создание клеточных моделей лейкозов с хромосомными транслокациями гена MLL (KMT2A) для разработки перспективных подходов к их диагностике, риск-стратификации и терапии |
| Результаты этапа: |
