ИСТИНА

Цель работы – сравнить склонность систем репарации двуцепочечных разрывов ДНК путём негомологичного соединения концов (NHEJ) и путём соединения концов, опосредованного микрогомологией (MMEJ), к ошибочному соединению концов ДНК и образованию хромосомных транслокаций.

Chromosomal translocations are driver events in the development of leukemia and lymphoma. Translocations occur as errors in the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) by joining the ends of the breaks. Mammalian cells utilize two major repair pathways involving DSB end joining — non-homologous end joining (NHEJ) and an alternative pathway involving small regions of homology (MMEJ). In recent years, there has been increasing evidence for a role of MMEJ in the formation of chromosomal translocations. However, it has not been directly shown whether MMEJ is utilized more frequently in the formation of chromosomal translocations in human cells compared to NHEJ. Our project aims to identify the mechanisms of DNA break end joining, which are more often involved in the formation of chromosomal translocations. To accomplish this goal, we will use a сell model obtained in our laboratory. This model is a culture of lymphoblastoid cells with the CRISPR/Cas system integrated into the genome under the control of the Tet-ON system. When doxycycline is added to the cell media, CRISPR/Cas introduces breaks at two target loci (at the AML1 and ETO genes), between which translocation occurs at a certain frequency — when the repair of breaks is "in-trans", i.e. when the ends of breaks from different chromosomes are joined. Depending on the repair pathway — NHEJ or MMEJ — different mutations in the region of rearrangement can be observed: either indels or deletions with signs of joining of DSB ends along microhomology sites. The same pathways are involved in cis-repair of breaks (i.e., joining of the ends of a break without the formation of a translocation). The number of translocations is counted using quantitative PCR. Identification of the repair pathway is possible by sequencing the locus in which repair occurs. To determine the share of a particular repair pathway, massive parallel sequencing of this locus in the cell population after break induction and analysis of sequencing data with mutation classification is required. To better understand the repair mechanisms, namely the importance of different proteins for translocation formation, experiments with the addition of inhibitors of these proteins and with knockdowns will be performed. Translocation frequencies will be determined, and the rearrangement loci and non-rearranged target loci will be sequenced. The project will elucidate the mechanism most responsible for translocation formation in human cells. This will make it possible to identify targets for protective drugs that protect cells from translocations under conditions where cells are susceptible to double-stranded DNA breaks. Such conditions, for example, are radio- and chemotherapy of tumors and autoimmune diseases. New data will also be obtained on the mechanisms of repair of double-stranded DNA breaks and the functions of proteins involved in this process.

В результате выполнения проекта планируется достичь следующих результатов. 1. Будет отработана методика определения числа транслокаций в образце ДНК клеток: необходим точный метод детекции редких мишеней в смеси ДНК. Для этого будут проведены исследования с использованием линеаризованной плазмиды, содержащей последовательность области транслокации, как положительного контроля. В качестве метода будет выбрана ПЦР в реальном времени или цифровая капельная ПЦР. 2. Будут определены условия амплификации участков ДНК для дальнейшего секвенирования — участков перестройки и участков неперестроившихся целевых локусов генов АML1 и ETO. Для выявления оптимального фермента для препаративной ПЦР будут проверены высокоточные ДНК-полимеразы разных производителей. 3. Будет определен вклад каждого из путей репарации в образование транслокаций («репарация в транс-») и в нормальную цис-репарацию разрывов. Для этого будут подготовлены библиотеки и проведено секвенирование участков перестройки и участков неперестроившихся целевых локусов генов АML1 и ETO. 4. Будет проведен биоинформатический анализ полученных данных, в том числе с применением методов статистики, для классифицирования мутаций и определения исходных долей разных мутаций в образцах. 5. Будет определено, как ингибирование белков тех или иных путей репарации, а также нокдаун их генов, влияют на вклад каждого из путей репарации как в образование транслокаций, так и в нормальную цис-репарацию разрывов.

Хромосомные транслокации являются драйверными событиями при развитии лейкозов и лимфом. Транслокации возникают как ошибки репарации двуцепочечных разрывов ДНК при соединении концов разрывов. В клетках млекопитающих используются два основных пути репарации, предполагающих соединение концов разрыва — негомологичное соединение концов разрыва (NHEJ) и альтернативный ему путь, задействующий небольшие участки гомологии (MMEJ). В последние годы появляется все больше свидетельств роли MMEJ в образовании хромосомных транслокаций. Однако напрямую не было показано, используется ли чаще MMEJ при формировании хромосомных транслокаций в клетках человека, по сравнению с NHEJ.

В результате выполнения проекта будет выяснен механизм, в наибольшей степени отвечающий за образование транслокаций в клетках человека. Это позволит выявить мишени для препаратов-протекторов, защищающих клетки от возникновения транслокаций в условиях, когда клетки подвержены возникновению двуцепочечных разрывов ДНК. Такими условиями, например, является радио- и химиотерапия опухолей и аутоиммунных заболеваний. Также будут полученные новые данные о механизмах репарации двуцепочечных разрывов ДНК и функциях белков, участвующих в этом процессе.