ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
роект направлен на изучение роли пост-трансляционных модификаций (ПТМ) в регуляции функций и активности каспазы-2, инициирующей апоптотическую гибель раковых клеток в ответ на различные индукторы и в первую очередь на ДНК-повреждающие химиотерапевтические препараты. В рамках проекта планируется с помощью протеомного, биоинформатического и биохимических анализов идентифицировать ПТМ каспазы-2 в раковых клетках и оценить их влияние на процесс апоптоза. Изучение механизмов ПГК является одним из наиболее быстро развивающихся областей биомедицинских исследований. В настоящее время ясно, что не только апоптоз, но и другие виды клеточной гибели, например, такие как некроптоз и аутофагия, участвуют в регуляции тканевого гомеостаза, а нарушения их механизмов приводят к развитию многих патологических состояний. Успехи в данной области знаний были отмечены присуждением 2х Нобелевских Премий (2002 и 2016). Установлено, что некоторые неврологические (болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона) и иммунологические (СПИД) заболевания, связаны с избыточной клеточной гибелью, а такое заболевание как рак - с ее недостатком. Известно также, что нарушение функционирования механизмов гибели клеток связано с устойчивостью патологических клеток к терапии. Хотя многие молекулярные механизмы определенных видов клеточной гибели известны, их контроль за счет пост-трансляционных модификаций, как фундаментального механизма регуляции активности жизненно-важных молекулярных путей, остается слабо изученным. Кроме того, разработка ингибиторов тирозинкиназ, осуществляющих пост-трансляционное фосфорилирование белков, ответственных за рост, деление и устойчивость раковых клеток к апоптозу, как противораковых препаратов, началась более 20 лет назад, однако остается открытым вопрос о точных молекулярных механизмах влияния этих препаратов на процессы клеточной гибели. Поиск новых путей контроля и регулирования гибели клеток за счет механизмов ПТМ каспаз – необходимый этап разработки нового класса лекарств, способных как стимулировать апотоз при лечении рака, так и ингибировать его для лечения нейро-дегенеративных заболеваний. ПТМ играют существенную роль при активации и в регуляции активности каспаз, контролируя не только их про-, но и неапоптотические функции. Проведенное нами исследование (Zamaraev et al., 2017) показало, что в качестве основных ПТМ каспаз можно выделить фосфорилирование остатков серина, треонина или тирозина и присоединение убиквитина и его цепей к остаткам лизина – моно- и полиубиквитинилирование. Убиквитинилировние может способствовать как активации каспаз, так и опосредовать их деградацию в зависимости от типа модификации. Фосфорилирование же в большинстве случаев приводит к блокированию активации или ферментативной активности каспаз. Например, при митозе киназа Cdk1-CyclinB1 ингибирует активность инициаторных каспаз-8 и -9 для успешного прохождения клеточного цикла и избегания случайной гибели при делении. Более того, проведенный нами биоинформатический анализ показал, что некоторые сайты фосфорилирования каспаз эволюционно консервативны как у беспозвоночных, так и у позвоночных животных. Также нами продемонстрировано, что наибольшее количество механизмов регуляции программируемой гибели за счет ПТМ описано для инициаторных каспаз-8 и -9, однако для инициаторной каспазы-2 в литературе описано только 3 случая фосфорилирования, причем один из них не подтвержден для человека (Рис.1). Каспаза-2 является одним из самых консервативных белков семейства цистеиновых протеаз, из которого только она обладает сигналом ядерной локализации. Этот фермент участвует в индукции и усилении апоптотического ответа при повреждении ДНК, например, после обработки химиотерапевтическими агентами, или индукторами, вызывающими стресс эндоплазматического ретикулума. Кроме того, каспаза-2 обладает онкосупрессорными функциями, участвует в поддержании генетической стабильности и регуляции клеточного цикла, толерантности к окислительному стрессу. Также было показано, что каспаза-2 может активироваться при заражении некоторыми микроорганизмами и участвовать в воспалительном ответе. В настоящее время исследование функций каспазы-2 и путей их регулирования является одной из «горячих точек» в изучении механизмов регуляции гибели клеток. Исследование ПТМ каспазы-2 в раковых клетках позволит установить механизм активации этого фермента, как один из механизмов регуляции апоптоза, а также даст новую информацию об его участии в процессах контролирования клеточного цикла, репарации и/или репликации ДНК. Настоящее исследование будет включать несколько этапов. В недавно (2016 г) проведенном нами масс-спектрометрическом анализе интерактомы каспазы-2 при индукции повреждений ДНК были обнаружены киназы, фосфатазы и белки, регулирующие клеточный цикл (белок 14-3-3, CaMKII, фосфатаза P1), а также Е3 убиквитин-лигазы. Регуляция каспазы-2 за счет ПТМ для некоторых из этих белков в литературе показана, однако роль большинства белков остается невыясненной. Для дальнейшего поиска белков, участвующих в регуляции ПТМ каспазы-2, предполагается выделить высокомолекулярный комплекс активации каспазы-2, формирующийся в раковых клетках в ответ на повреждение ДНК. Далее будут проведены масс-спектрометрический и протеомный анализы полученных образцов с целью идентификации белков, способных регулировать формирование этого комплекса за счет ПТМ. На следующем этапе будет проведено сравнение белков, идентифицированных в данном анализе, с выявленными ранее потенциальными партнерами с целью обнаружения общих кандидатов. Соответственно, дальнейшее исследование предполагает экспериментальную проверку идентифицированных кандидатов с применением методов иммунопреципитации, аффинного выделения, гель-фильтрации и метода siRNA. Для обнаружения сайтов фосфорилирования на втором этапе будет проведен биоинформатический анализ сайтов ПТМ каспазы-2 с целью выявления наиболее консервативных остатков среди различных организмов. Сравнение эволюционно-консервативных остатков в последовательности каспазы-2 и других каспаз даст информацию о предпочтительном с точки зрения эволюции расположении сайтов фосфорилирования в третичной структуре каспаз. Данный анализ может выявить потенциальные сайты фосфорилирования, еще не описанные в литературе. В качестве дополнительного подтверждения будет проведен биоинформатический анализ последовательности каспазы-2 с использованием алгоритмов и баз данных, предназначенных для предсказания ПТМ (NetPhos, PhosphoSite, Disphos, NetPhorest и т.д.). Сравнительный анализ полученных с помощью этих двух подходов сайтов ПТМ далее будет использован с целью нахождения общих сайтов. На следующем этапе предполагается экспериментальная проверка предсказанных участков фосфорилирования с использованием генетических конструктов, содержащих последовательности дикого или мутантных вариантов гена каспазы-2. Будет проведено сравнение способности этих мутированных вариантов каспазы-2 расщеплять специфические и эндогенные субстраты, а также влиять на развитие апоптоза в ответ на повреждение ДНК в раковых клетках. Для этих экспериментов будут использованы созданные нами с помощью системы CRISPR/Cas9 линии раковых клеток дефицитных по каспазе-2. Данный анализ предполагается проводить с помощью современных методов исследования клеточной гибели и ее молекулярных путей, таких как масс-спектрометрия, разные виды проточной цитометрии, иммуноблотинг, измерение активности каспаз и конфокальная флуоресцентная микроскопия. В литературе не встречаются данные, подтверждающие факт убиквитинилирования каспазы-2. Однако для других каспаз описаны механизмы регуляции их функции за счет данного вида ПТМ. Таким образом, одной из целей настоящего исследования является анализ убиквитинилирования каспазы-2. Для этого будет проведена иммунопреципитация каспазы-2 из раковых клеток в оптимизированных условиях с последующим иммуноблотингом полученных образцов и окраской антителами как к общему убиквитину, так и специфических антител к различным цепям полиубиквитина. Такой анализ выявит, в первую очередь, происходит ли убиквитинилирование каспазы-2 в раковых клетках. В ходе дальнейшего исследования будет выявлено, меняется ли степень и характер убиквитинилирования каспазы-2 при повреждениях ДНК химиотерапевтическими агентами, что позволит сделать вывод о регуляции активации и уровня каспазы-2 за счет этого вида ПТМ. Помимо этого, поскольку в проведенном в 2016 году масс-спектрометрическом анализе была выявлена Е3 убиквитин-лигаза (ТРИМ21), то будет проанализировано возможное взаимодействие данного фермента с каспазой-2 и его влияние на ее работу. Также, используя разработанный нами метод выделения ядер апоптотических клеток, будет проводиться оценка убиквитинилирования каспазы-2 я ядре. Такой анализ позволит выявить характер убиквитинилирования каспазы-2 в ядре (моно-, поли-, тип цепей), что даст ключ к пониманию ее роли в ядре в необработанных и подвергшихся генотоксическому стрессу раковых клетках. Таким образом, проект предполагает детальное исследование ПТМ каспазы-2 и их влияние на ее функции и активность после воздействия ДНК-повреждающих препаратов, используемых в терапии опухолей. Полученные знания в первую очередь будут использованы для оценки, каким образом нарушения механизмов ПТМ каспаз влияют на процессы, отвечающие за выживание/гибель здоровых и патологических клеток, а также каким образом возможно преодолеть устойчивость патологических клеток к терапии.
The project will be focused on PTM-mediated regulation of caspase-2 activity and function. This protein induces apoptotic death of cancer cells in response to DNA damage. The new PTMs of caspase-2 in cancer cells will be identified using bioinformatic, proteomic and biochemical approaches. We also will investigate the role of these PTMs in programmed death of cancer cells. Cell death is one of the most rapidly developed areas of biomedical research. The achievements in this research area were distinguished by two Nobel Prizes (2002, 2016). Nowadays it is clear that not only apoptosis, but also several other cell death modalities, such as necroptosis and autophagy, are involved in regulation of cellular homeostasis. Disturbances in cell death machinery lead to development of many disorders. Thus, several neurological (Alzheimer’s and Parkinson’ disease) and immunological (AIDS) disorders are associated with intensive cell death and the other, such as cancer, are linked to the deficiency of cell death. It is also known that inappropriate functioning of cell death mechanisms is associated with the resistance of malignant cells to therapy. Although molecular mechanisms of several cell death modalities have been described, their control through PTMs, as the main mechanisms of regulating crucial processes in the cell, is not fully understood. An additional point is that the investigations of tyrosine-kinase inhibitors which block growth and proliferation of cancer cells have been initiated for more than 20 years ago but the exact mechanisms of their action on apoptotic cell death still require clarification. The study of new molecular pathways of controlling PCD through caspase modifications is an essential step for the development of new drugs which would be able to induce apoptosis in the case of anti-cancer therapy or inhibit PCD for the treatment of neurodegenerative diseases. PTMs play an important role in regulation of caspases activation processes and their enzymatic activity, that allow controlling both proapoptotic and non-apoptotic functions of caspases. The main types of PTMs for caspases are the phosphorylation of the target protein at serine, threonine or tyrosine residues and conjugation with monoubiquitin or ubiquitin chains (reviewed in Zamaraev et al, 2017). Ubiquitination can promote the activation of caspases or their degradation depending on the type of linked ubiquitin chains. Phosphorylation in most cases inhibits the activation or proteolytic activity of caspases. For example, kinase Cdk1-CyclinB1 blocks activation of initiator caspase-8 and -9 during mitosis that prevents accidental cell death. Moreover, using bioinformatical analysis we have shown that some phosphorylated sites in caspases are very highly conserved between various organisms. It should be noted that the most examples of apoptosis regulation through phosphorylation have been described for initiator caspases-8 and -9, but only three phosphorylated sites have been found in caspase-2. Moreover, one of them has not been confirmed for human. Caspase-2 is the most evolutionary conserved member of the cysteine-dependent protease family, it has nuclear localization signal. This protease participates in the induction and amplification of apoptosis in response to DNA damage (e.g. after the treatment with chemotherapeutic agents) and stress of endoplasmic reticulum. Furthermore, caspase-2 could play an essential role in the maintenance of genomic stability, the regulation of cell cycle, the tolerance to oxidative stress and an immune response after infection by some bacteria. At present the study of caspase-2 function is a “hot spot” in the research field of PCD mechanisms. The investigation of caspase-2 regulation trough PTMs in cancer cells elucidates the mechanisms of its activation and could give us new knowledge about its non-apoptotic function. This research project includes several steps. Recently, using mass spectrometric analysis we have found several partners of caspase-2: kinases, phosphatases, proteins that regulate the cell cycle (14-3-3, CaMKII, PP1) and E3 ubiquitin ligases. The proteins 14-3-3, CaMKII, PP1 are known to be involved in the regulation of caspase-2 functions through PTMs, but a role of ubiquitin ligases has not yet been described and will be one of our research goals. We are also planning to isolate high molecular weight complexes of caspase-2 activation and analyze the samples using mass spectrometry for identification of proteins involving the regulation of caspase-2 activation complex through PTMs. The immunoprecipitation, gel-filtration, affinity chromatography and siRNA approaches will be applied to research in order to identify proteins that affect the processes of caspase-2 activation and apoptotic cell death. On the next step, new sites of caspase-2 phosphorylation will be determined using bioinformatics methods. The most evolutionary conserved sites of caspase-2 will be compared with analogous sites in other caspases for prediction of the most evolutionary preferable phosphorylation motifs. Additionally, we plan to use several algorithms and databases for prediction of new phosphorylation positions in caspase-2 (NetPhos, PhosphoSite, Disphos, NetPhorest etc). Comparative analysis of both predictions allows us to find out the sites, which require experimental verification. The experiments verifying new sites will be performed using genetic constructs containing wild type and mutant variants of caspase-2 gene and caspase-2 deficient cell lines made by us using CRISPR/Cas9 technology. The caspase-2 mutants will be compared with the wild type protein in ability to cleave substrates of caspase-2 and induce apoptotic death in response to DNA damage. This analysis will be performed using a set of modern methods of molecular and cell biology, such as flow cytometry, immunoblots, measurement of caspase activity and confocal fluorescent microscopy. The data confirming ubiquitination of caspase-2 are absent. However, for many other caspases the regulation via this type of PTM has been described. On the next step, we will address several questions: (1) whether caspase-2 undergoes ubiquitination; and (2) whether type and degree of caspase-2 ubiquitination change after treatment of cancer cells with DNA-damaging chemotherapeutic agents. Obtained data will allow us to make a conclusion about mechanisms of caspase-2 regulation through ubiquitination. We will also examine the potential interaction between caspase-2 and E3 ubiquitin ligase identified in previously performed mass spectrometry. We will analyze the possibility of caspase-2 ubiquitination in the nuclei using previously developed technique for isolation of apoptotic nucleus. This analysis will be focused on determination of ubiquitination type (mono- or polyubiquitination) that elucidate nuclear functions of caspase-2 upon genotoxic stress. Taken together, the project will be aimed the study of caspase-2 regulation through PTMs and their role in apoptosis induced with DNA-damaging chemotherapeutic agents. The new information will shed light on how dysregulation of PTMs of caspases can influence survival and death of normal or pathological cells.
В ходе выполнения проекта ожидается получить следующие результаты: 1) Будут выявлены новые сайты фосфорилирования каспазы-2 и установлено влияние этих сайтов на активность данного фермента и развитие апоптоза в целом. Полученные результаты в первую очередь прольют свет на механизмы регуляции функций и активности каспазы-2 в процессе запуска апоптоза и помогут восполнить пробел в знаниях механизмов действия ДНК-повреждающих химиотерапевтических препаратов. Несмотря на очевидную важность онкосупрессорных и проапоптотических функций каспазы-2 до сих пор не выяснен механизм активации и регуляции активности этого белка. Так, механизмы контроля ее активности и функций на уровне ПТМ изучены слабо и известно только 5 примеров модификаций в целом (в отличие от каспазы-8, для которой описано не менее 7 сайтов только фосфорилирования). Ответ на вопрос, каким образом происходит регуляция функций и активности каспазы-2 за счет фосфорилирования, является приоритетной задачей современной онкобиологии и медицины. Помимо этого, разработка методологии поиска новых сайтов ПТМ в будущем поможет выполнять аналогичные исследования для других белков, играющих существенную роль в процессах онкогенеза, ответе раковых клеток на терапию или их устойчивости к ней. 2) Будет установлено, подвергается ли каспаза-2 поли- или моноубиквитинилированию, каков характер этого убиквитинилирования, и как оно влияет на осуществление проапоптотических функций каспазы-2. На сегодняшний момент факт убиквитинилирования каспазы-2 не установлен, хотя известно, что данный тип ПТМ ответственен за широкий спектр функций подавляющего количества белков. Так моно- и полиубиквитинилирование регулируют фундаментальные процессы, такие как деградация белков, белок-белковые взаимодействия, трансляция, репарация ДНК и т.д. Необходимо отметить, что в литературе описаны примеры убиквитинилирования центральных белков апоптоза – инициаторных каспаз-8, -9 и эффекторных каспаз-3, -7. Данный тип модификаций тонко регулирует баланс активных и неактивных каспаз за счет контроля процессов активации или деградации, существенно влияя на ответ клеток на апоптотические стимулы. Есть все основания полагать, что функции и активность каспазы-2 также регулируются аналогичным образом. Следовательно, исследование пост-трансляционного убиквитинилирования каспазы-2 даст ключ к пониманию механизмов действия этого фермента и развития апоптотического ответа при генотоксическом стрессе. Таким образом, настоящий проект предполагает развернутое изучение наиболее важных типов ПТМ каспазы-2 и их влияния на процесс апоптоза в раковых клетках. Его значимость для биологии и медицины не вызывает сомнений, поскольку анализ современной литературы показывает, что только в конце 2016 и начале 2017 годов было опубликовано 3 статьи, посвященные исследованию функций и механизмам регуляции каспазы-2, в журналах с импакт-фактором от 7.9 до 26.3. Кроме того, все три экспериментальные работы, посвящённые фосфорилированию каспазы-2, были опубликованы в журналах EMBO J и Cell. Участие молодых ученых в семинарах и конференциях в рамках проекта будут иметь большое значение для теоретической и практической подготовки студентов и молодых научных кадров в области исследования клеточной гибели.
Kopeina G.S., Zamaraev A.V., Zhivotovsky B.D., Lavrik I.N. Identification of new complex for caspase-2 activation after DNA damage. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, издательство Maik Nauka/Interperiodica Publishing (Russian Federation), том 42, № 1, с. 74-82 Aksenova V.I., Kopeina G.S., Zamaraev A.V., Zhivotovsky B.D., Lavrik I.N. Mechanism of caspase-2 activation upon DNA damage. Doklady Biochemistry and Biophysics, издательство M A I K Nauka - Interperiodica (Russian Federation), том 467, № 1, с. 132-135
На предыдущем этапе были найдены новые потенциальные сайты фосфорилирования каспазы-2 - S384 и T380. В ходе научно-исследовательской работы было показано, что замена S384A, но не T380А, приводила к подавлению автокаталитического расщепления каспазы-2 и аккумуляции ферментативно-активных форм каспазы-2 – фрагментов р37 и р19. При этом индукция клеточной гибели цисплатином усиливала накопление активной каспазы-2 при трансфекции клеток конструктами, содержащими последовательности каспазы-2 дикого типа или с заменой T380А, но не с мутацией S384A. Более того, выделение каспазы-2 с помощью аффинной хроматографии показало, что в образцах мутантного варианта каспазы-2 с заменой S384A фрагмент р19, входящий в состав наиболее активного гетеротетрамера, практически не детектируется. Соответственно, данный эксперимент подтверждал, что замена потенциально фосфорилируемого остатка серина 384 на аланин приводила к практически полной блокировке автокаталического расщепления каспазы-2 и ингибированию формирования ее ферментативно-активных субъединиц. Измерение активности каспазы-2 в клетках, трансфицированных конструктами с последовательностью каспазы-2 дикого типа или с мутацией S384A, подтвердило, что мутированная каспаза-2 не обладает каталитической активностью. Полученные данные свидетельствовали о том, что замена S384A в последовательности каспазы-2 приводила не только к блокировке автокаталитического процессинга профермента, но и к практически полному подавлению ферментативной активности каспазы-2 при индукции апоптоза повреждением ДНК. Анализ параметров клеточной гибели с помощью Вестерн-блота показал, что накопление маркеров апоптоза - расщепленной активированной каспазы-3 и фрагмента PARP - было заметно снижено в клетках, экспрессирующих мутантный вариант каспазы-2 с заменой S384A, по сравнению с клетками, синтезирующими каспазу-2 дикого типа. Такое снижение уровня накопления маркеров апоптоза хорошо коррелировало с подавлением процессинга каспазы-2 с мутацией S384A. Анализ уровня клеточной гибели с помощью проточной цитометрии продемонстрировал, что обработка цисплатином приводила к индукции апоптоза как в контрольных клетках, так и при трансфекции геном каспазы-2 дикого типа или с заменой S384A. Однако после индукции гибели размер апоптотической популяции был заметно больше в клетках, продуцирующих каспазу-2 дикого типа, по сравнению с клетками, синтезирующих каспазу-2 с заменой S384A. Необходимо отметить, что гибель клеток, содержащих мутантную каспазу-2, была выше, чем в нетрансфицированных клетках. Данный феномен можно объяснить тем, что трансфицирующий агент Lipofactamine LTX, который использовали для введения конструктов в клетки, обладает собственной цитотоксичностью и вызывает усиление гибели клеток. Более того, поскольку в случае повреждений ДНК апоптоз может также активироваться не только за счет каспазы-2, но и за счет пути р53-PUMA/NOXA-каспаза-9 или за счет RIPoptosome-каспаза-8, то подавление активности каспазы-2 может быть компенсировано этими путями. Таким образом, мутация S384A в последовательности каспазы-2 снижала уровень апоптоза, вызванного химиотерапевтическим препаратом цисплатином. Суммарно полученные данные подтвердили, что замена потенциально фосфорилируемого остатка серина 384 на аланин в последовательности каспазы-2 приводила к блокировке автокаталитического процессинга этого фермента и ингибированию его ферментативной активности, что вызывало подавление процесса цисплатин-индуцируемого апоптоза. На первом этапе работы было показано, что каспаза-2 подвергается убиквитинилированию. Было отмечено, что в образцах каспазы-2 увеличивается количество именно полиубиквитина К48, присоединение которого к белкам обычно свидетельствует об усилении их протеосомной деградации. Исследование протеосомной деградации каспазы-2 продемонстрировало, что блокировка этого процесса ингибитором MG-132 приводила к существенному накоплению расщепленной активированной каспазы-2 - фрагмента р19 даже чрез 4-8 часов инкубации. Аккумуляция р19 существенно усиливалась при комбинировании MG-132 с ДНК-повреждающими препаратами – цисплатином, доксорубицином или этопозодом. Сочетание MG-132 с ДНК-повреждающими препаратами приводила также к усилению апоптотической гибели, о чем свидетельствовало аккумуляция фрагмента р89 белка PARP. Соответственно, блокирование протеосомной деградации при помощи MG-132 приводило к аккумуляции в клетках активных форм каспазы-2 и усиливало их гибель при комбинировании ингибитора с химиотерапевтическими препаратами. Поскольку не было отмечено какого-либо падения уровня проформы каспазы-2 в этих условиях, то было выдвинуто предположение, что накопление фрагмента р19 является результатом блокировки его протеосомной деградации, а не усиления расщепления проформы. Таким образом, вероятно, при индукции генотоксического стресса происходит усиление убиквитинилирования каспазы-2, в особенности ее активных расщепленных форм, что ведет к деградации фермента и замедляет апоптоз в опухолевых клетках. При блокировке этого процесса ингибитором протеосом происходит накопление активной каспазы-2, что способствует ускорению клеточной гибели наравне с другими путями. Так, известно, что ингибирование протеасомной деградации ведет к накоплению несвернутых белков и соответствующему ответу клетки (UPR – unfolded protein response), что стимулирует апоптоз. Помимо этого, было обнаружено, что каспаза-2 транслоцируется в ядро в ходе апоптоза наряду с другими инициаторными каспазами. Было показано, что данный процесс не зависел от того, каким образом был индуцирован апоптоз – повреждением ДНК, ингибированием киназ или стимуляцией рецепторов смерти. Более того, эксперименты подтвердили, что в моноубиквитинилированном состоянии каспаза-2 может локализоваться в ядре в норме. Поскольку эта моноубиквитинилированная форма каспазы-2 исчезает при генотоксическом стрессе, то, возможно, данный вид модификации играет роль в переключении функций каспазы-2 в норме и при повреждении ДНК. Таким образом, в то время как до настоящего момента в литературе отсутствовали какие-либо данные об убиквитинилировании каспазы-2, серия полученных нами результатов впервые предполагает важность убиквитинилирования каспазы-2 в регуляции ее активности и функций. Так, возможно, моноубиквитинилирование данной каспазы влияет на ее локализацию в клетке и неапоптотические функции. При этом полиубиквитинилирование регулирует уровень активных форм данного фермента в клетке, что влияет на интенсивность апоптоза. Таким образом, не исключено, что убиквитинилирование важно для переключения функции каспазы-2 с неапоптотических на апоптотические в ответ на определенный уровень повреждения ДНК в клетке. В ходе работы были подготовлены и приняты в печать три статьи в журналах Scientific Reports (ИФ=4.2, Q1), «Клеточные технологии в биологии и медицине» (ИФ=0.56) и Trends in Cell Biology (ИФ=18.6, Q1). Необходимо отметить, что иллюстрация к нашей статье в журнале Trends in Cell Biology была отобрана в результате конкурса и будет опубликована на обложке журнала (см. приложение к отчету). Статья посвящена одному из важнейших регуляторов внутреннего пути апоптоза, члену семейства Bcl-2 – Mcl-1. Mcl-1 контролирует центральное событие при запуске апоптоза при повреждении ДНК химиотерапевтическими препаратами – открытие митохондриальных пор, поэтому эффективность запуска каспазой-2 гибели опухолевых клеток зависит от этого белка. Поскольку уровень Mcl-1 зачастую повышен в опухолевых тканях, то этот белок представляет собой важную терапевтическую мишень. С помощью биоинформатических и структурных методов исследования нам удалось выявить молекулярные аспекты взаимодействия Mcl-1 с его природными антагонистами — белками Noxa и Bim, а также с одним из синтезированных низкомолекулярных ингибиторов. Полученные данные позволили сформулировать теорию о направленном создании соединений, вызывающих специфическую деградацию Mcl-1 в протеасомах. Также руководитель гранта был приглашен с устным докладом «Каспаза-2 регулирует три типа клеточной гибели - апоптоз, некроптоз и митотическую катастрофу - при воздействии генотоксического стресса» («Caspase-2 is a regulator of three modes of program cell death: apoptosis, necroptosis and mitotic catastrophe upon genotoxic stress») для участия в 26-й конференции Европейского сообщества по изучению клеточной гибели (Тhe 26th Conference of the European Cell Death Organization, entitled "Cell death in disease: from small molecules to translational medicine).
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 30 июля 2017 г.-30 июня 2018 г. | Роль каспазы-2 и ее пост-трансляционных модификаций в регуляции гибели раковых клеток, индуцируемой химиотерапевтическими препаратами |
Результаты этапа: С помощью протеомного, биоинформатического и биохимических анализов идентифицированы пост-трансляционные модификации (ПТМ) каспазы-2 в раковых клетках, а также оценено их влияние на процесс апоптоза. Выделен высокомолекулярный комплекс активации каспазы-2, формирующийся в раковых клетках в ответ на повреждение ДНК, проведены масс-спектрометрический и протеомный анализы полученных образцов и идентифицированы белки, способные регулировать формирование этого комплекса за счет ПТМ. | ||
2 | 9 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Роль каспазы-2 и ее пост-трансляционных модификаций в регуляции гибели раковых клеток, индуцируемой химиотерапевтическими препаратами |
Результаты этапа: На предыдущем этапе были найдены новые потенциальные сайты фосфорилирования каспазы-2 - S384 и T380. В ходе научно-исследовательской работы было показано, что замена S384A, но не T380А, приводила к подавлению автокаталитического расщепления каспазы-2 и аккумуляции ферментативно-активных форм каспазы-2 – фрагментов р37 и р19. При этом индукция клеточной гибели цисплатином усиливала накопление активной каспазы-2 при трансфекции клеток конструктами, содержащими последовательности каспазы-2 дикого типа или с заменой T380А, но не с мутацией S384A. Более того, выделение каспазы-2 с помощью аффинной хроматографии показало, что в образцах мутантного варианта каспазы-2 с заменой S384A фрагмент р19, входящий в состав наиболее активного гетеротетрамера, практически не детектируется. Соответственно, данный эксперимент подтверждал, что замена потенциально фосфорилируемого остатка серина 384 на аланин приводила к практически полной блокировке автокаталического расщепления каспазы-2 и ингибированию формирования ее ферментативно-активных субъединиц. Измерение активности каспазы-2 в клетках, трансфицированных конструктами с последовательностью каспазы-2 дикого типа или с мутацией S384A, подтвердило, что мутированная каспаза-2 не обладает каталитической активностью. Полученные данные свидетельствовали о том, что замена S384A в последовательности каспазы-2 приводила не только к блокировке автокаталитического процессинга профермента, но и к практически полному подавлению ферментативной активности каспазы-2 при индукции апоптоза повреждением ДНК. Анализ параметров клеточной гибели с помощью Вестерн-блота показал, что накопление маркеров апоптоза - расщепленной активированной каспазы-3 и фрагмента PARP - было заметно снижено в клетках, экспрессирующих мутантный вариант каспазы-2 с заменой S384A, по сравнению с клетками, синтезирующими каспазу-2 дикого типа. Такое снижение уровня накопления маркеров апоптоза хорошо коррелировало с подавлением процессинга каспазы-2 с мутацией S384A. Анализ уровня клеточной гибели с помощью проточной цитометрии продемонстрировал, что обработка цисплатином приводила к индукции апоптоза как в контрольных клетках, так и при трансфекции геном каспазы-2 дикого типа или с заменой S384A. Однако после индукции гибели размер апоптотической популяции был заметно больше в клетках, продуцирующих каспазу-2 дикого типа, по сравнению с клетками, синтезирующих каспазу-2 с заменой S384A. Необходимо отметить, что гибель клеток, содержащих мутантную каспазу-2, была выше, чем в нетрансфицированных клетках. Данный феномен можно объяснить тем, что трансфицирующий агент Lipofactamine LTX, который использовали для введения конструктов в клетки, обладает собственной цитотоксичностью и вызывает усиление гибели клеток. Более того, поскольку в случае повреждений ДНК апоптоз может также активироваться не только за счет каспазы-2, но и за счет пути р53-PUMA/NOXA-каспаза-9 или за счет RIPoptosome-каспаза-8, то подавление активности каспазы-2 может быть компенсировано этими путями. Таким образом, мутация S384A в последовательности каспазы-2 снижала уровень апоптоза, вызванного химиотерапевтическим препаратом цисплатином. Суммарно полученные данные подтвердили, что замена потенциально фосфорилируемого остатка серина 384 на аланин в последовательности каспазы-2 приводила к блокировке автокаталитического процессинга этого фермента и ингибированию его ферментативной активности, что вызывало подавление процесса цисплатин-индуцируемого апоптоза. На первом этапе работы было показано, что каспаза-2 подвергается убиквитинилированию. Было отмечено, что в образцах каспазы-2 увеличивается количество именно полиубиквитина К48, присоединение которого к белкам обычно свидетельствует об усилении их протеосомной деградации. Исследование протеосомной деградации каспазы-2 продемонстрировало, что блокировка этого процесса ингибитором MG-132 приводила к существенному накоплению расщепленной активированной каспазы-2 - фрагмента р19 даже чрез 4-8 часов инкубации. Аккумуляция р19 существенно усиливалась при комбинировании MG-132 с ДНК-повреждающими препаратами – цисплатином, доксорубицином или этопозодом. Сочетание MG-132 с ДНК-повреждающими препаратами приводила также к усилению апоптотической гибели, о чем свидетельствовало аккумуляция фрагмента р89 белка PARP. Соответственно, блокирование протеосомной деградации при помощи MG-132 приводило к аккумуляции в клетках активных форм каспазы-2 и усиливало их гибель при комбинировании ингибитора с химиотерапевтическими препаратами. Поскольку не было отмечено какого-либо падения уровня проформы каспазы-2 в этих условиях, то было выдвинуто предположение, что накопление фрагмента р19 является результатом блокировки его протеосомной деградации, а не усиления расщепления проформы. Таким образом, вероятно, при индукции генотоксического стресса происходит усиление убиквитинилирования каспазы-2, в особенности ее активных расщепленных форм, что ведет к деградации фермента и замедляет апоптоз в опухолевых клетках. При блокировке этого процесса ингибитором протеосом происходит накопление активной каспазы-2, что способствует ускорению клеточной гибели наравне с другими путями. Так, известно, что ингибирование протеасомной деградации ведет к накоплению несвернутых белков и соответствующему ответу клетки (UPR – unfolded protein response), что стимулирует апоптоз. Помимо этого, было обнаружено, что каспаза-2 транслоцируется в ядро в ходе апоптоза наряду с другими инициаторными каспазами. Было показано, что данный процесс не зависел от того, каким образом был индуцирован апоптоз – повреждением ДНК, ингибированием киназ или стимуляцией рецепторов смерти. Более того, эксперименты подтвердили, что в моноубиквитинилированном состоянии каспаза-2 может локализоваться в ядре в норме. Поскольку эта моноубиквитинилированная форма каспазы-2 исчезает при генотоксическом стрессе, то, возможно, данный вид модификации играет роль в переключении функций каспазы-2 в норме и при повреждении ДНК. Таким образом, в то время как до настоящего момента в литературе отсутствовали какие-либо данные об убиквитинилировании каспазы-2, серия полученных нами результатов впервые предполагает важность убиквитинилирования каспазы-2 в регуляции ее активности и функций. Так, возможно, моноубиквитинилирование данной каспазы влияет на ее локализацию в клетке и неапоптотические функции. При этом полиубиквитинилирование регулирует уровень активных форм данного фермента в клетке, что влияет на интенсивность апоптоза. Таким образом, не исключено, что убиквитинилирование важно для переключения функции каспазы-2 с неапоптотических на апоптотические в ответ на определенный уровень повреждения ДНК в клетке. В ходе работы были подготовлены и приняты в печать три статьи в журналах Scientific Reports (ИФ=4.2, Q1), «Клеточные технологии в биологии и медицине» (ИФ=0.56) и Trends in Cell Biology (ИФ=18.6, Q1). Необходимо отметить, что иллюстрация к нашей статье в журнале Trends in Cell Biology была отобрана в результате конкурса и будет опубликована на обложке журнала (см. приложение к отчету). Статья посвящена одному из важнейших регуляторов внутреннего пути апоптоза, члену семейства Bcl-2 – Mcl-1. Mcl-1 контролирует центральное событие при запуске апоптоза при повреждении ДНК химиотерапевтическими препаратами – открытие митохондриальных пор, поэтому эффективность запуска каспазой-2 гибели опухолевых клеток зависит от этого белка. Поскольку уровень Mcl-1 зачастую повышен в опухолевых тканях, то этот белок представляет собой важную терапевтическую мишень. С помощью биоинформатических и структурных методов исследования нам удалось выявить молекулярные аспекты взаимодействия Mcl-1 с его природными антагонистами — белками Noxa и Bim, а также с одним из синтезированных низкомолекулярных ингибиторов. Полученные данные позволили сформулировать теорию о направленном создании соединений, вызывающих специфическую деградацию Mcl-1 в протеасомах. Также руководитель гранта был приглашен с устным докладом «Каспаза-2 регулирует три типа клеточной гибели - апоптоз, некроптоз и митотическую катастрофу - при воздействии генотоксического стресса» («Caspase-2 is a regulator of three modes of program cell death: apoptosis, necroptosis and mitotic catastrophe upon genotoxic stress») для участия в 26-й конференции Европейского сообщества по изучению клеточной гибели (Тhe 26th Conference of the European Cell Death Organization, entitled "Cell death in disease: from small molecules to translational medicine). |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".
№ | Имя | Описание | Имя файла | Размер | Добавлен |
---|---|---|---|---|---|
1. | MOL0750.pdf | MOL0750.pdf | 862,8 КБ | 19 февраля 2020 [gelina] | |
2. | SciRep-localization.pdf | SciRep-localization.pdf | 2,2 МБ | 19 февраля 2020 [gelina] | |
3. | Cell_Prol-nuclei.pdf | Cell_Prol-nuclei.pdf | 818,4 КБ | 19 февраля 2020 [gelina] | |
4. | BEBM-04.pdf | BEBM-04.pdf | 1,3 МБ | 19 февраля 2020 [gelina] | |
5. | Bazanov_2019.pdf | Bazanov_2019.pdf | 4,1 МБ | 19 февраля 2020 [gelina] | |
6. | TICB-Mcl.pdf | TICB-Mcl.pdf | 3,0 МБ | 19 февраля 2020 [gelina] |