ИСТИНА

Проект посвящен разработке комплексного препарата на основе природного полимера хитозана и пептидаз из насекомых и растений для лечения аутоиммунных заболеваний ЖКТ на примере целиакии. Целиакия– это хроническое наследственное заболевание, характеризующееся стойкой непереносимостью проламинов (белков глютена) семян злаковых культур. На сегодняшний день лекарств от целиакии нет: больным предписана строгая пожизненная безглютеновая диета. Нами предлагается использовать для лечения целиакии комплексный препарат на основе пептидаз, который будет способен эффективно гидролизовать неперевариваемые человеком глутамин- и пролинбогатые иммуногенные пептиды проламинов. Акцент будет сделан на глутаминспецифичных (ГСП) и пролинспецифичных пептидазах (ПСП). Российская сторона будет изучать пищеварительные ГСП и ПСП важнейших вредителей зерновых запасов Tenebrio molitor и Tribolium castaneum, а сторона ЮАР будет исследовать пептидазы семян пшеницы, ячменя, риса, кукурузы и сорго. Преимуществом и оригинальностью предлагаемого подхода является то, что именно эти две группы ферментов в природе гидролизуют проламины семян злаков. Использование двух различных групп организмов, обладающих разными протеолитическими комплексами, позволит расширить спектр пептидаз, используемых для создания лечебного препарата. Предполагается употребление разрабатываемого препарата вместе с пищей, содержащей глютен. В рамках проекта планируется выделение пептидаз, характеристика их физико-химических и энзиматических свойств, идентификация первичной структуры, моделирование пространственной структуры, докинг иммуногенных пептидов. Сопоставление биохимических данных о специфичности пептидаз со строением их активного и субстрат-связывающего центров позволит расширить круг используемых пептидаз и включить в состав комплекса высокоактивные ферменты с требуемой специфичностью. Южноафриканские коллеги клонируют кДНК и экспрессируют пептидазы. Будет исследован механизм гидролиза иммуногенных пептидов и их флюорогенных аналогов очищенными и рекомбинантными ГСП и ПСП. Для доставки и стабилизации препарата предполагается иммобилизация пептидаз на биосовместимом природном полимере хитозане. Сторона ЮАР исследует природные белковые ингибиторы ГСП и ПСП, которые также могут быть использованы для адресной доставки препарата в соответствующие отделы ЖКТ. В результате будет предложен комплексный ферментный препарат, обладающий максимальной стабильностью в условиях ЖКТ человека, способный эффективно гидролизовать трудногидролизуемые иммуногенные пептиды проламинов, являющихся важными пищевыми белками для большинства населения земного шара, и пригодный для лечения целиакии. Токсичность препарата будет протестирована на клетках крови в ГУ Научный центр здоровья детей РАМН. Успешное внедрение препарата позволит больным целиакией, число которых составляет более 1 млн человек в России и около 500000 тыс в ЮАР, повысить качество жизни и не терять продуктивность на работе. Кроме того, российская и южноафриканская стороны смогут обучиться методам и воспользоваться оборудованием каждой из сторон, отсутствующим в их лабораториях, а участвующие в проекте студенты и аспиранты получат навыки международного сотрудничества.

Предложен оригинальный набор специфичных пептидных субстратов для выявления активностей РSР и GSP, использованный как российской, так и южно-африканской стороной. С помощью этих субстратов были выделены, очищены и идентифицированы пищеварительные РSР личинок T. molitor: пролилкарбоксипептидаза (РСР) и дипептидилпептидаза IV (DPP IV). РСР впервые обнаружена среди пищеварительных пептидаз животных, а DPP IV впервые выявлена в пищеварительном комплексе насекомых. Впервые показано, что именно цистеиновые эндопептидазы из кишечника личинок T. molitor обладают постглутамин-расщепляющей активностью. Российская сторона совместно со стороной ЮАР провела поиск последовательностей РSР и цистеиновых пептидаз (ЦП) в транскриптомах кишечников личинок T. molitor и T. castaneum и в секвенированном геноме T. castaneum, и оценила уровни экспрессии этих ЦП. С использованием этих данных установлена первичная структура главных пищеварительных ЦП T. molitor: катепсин В- и катепсин L-подобной. Проведен подробный структурный анализ этих катепсинов, изучена их субстратная специфичность и стабильность. Выявлены сходные активности пищеварительных РSР и GSP у личинок T. castaneum. Показано, что все исследованные пептидазы гидролизуют проламины пшеницы – глиадины, однако наиболее активно их гидролизуют ЦП. Российской стороной впервые предложена гипотетическая схема полного гидролиза пролин- и глутамин-богатых пептидов глиадинов пищеварительными ферментами из личинок T. molitor. Согласно этой схеме, первым и ключевым этапом гидролиза глиадинов в кишечнике T. molitor является их расщепление по связям глутамина под действием ЦП. Исследование расщепления трудногидролизуемых токсических пептидов глиадинов и их флуорогенных аналогов позволило подтвердить ключевую стадию предложенной схемы. Полученные при этом продукты расщепления токсических пептидов по литературным данным не обладают токсическим эффектом. Сравнительные исследования с использованием пищеварительных цистеиновых катепсинов личинок T. molitor, лизосомальных катепсинов млекопитающих и близкородственных растительных ЦП из семейства С1 показали, что наиболее активно глиадиновые пептиды гидролизовал папаин. Поэтому именно папаин, обладающий к тому же высокой стабильностью, коммерческой доступностью, дешевизной и экологической безопасностью был выбран в качестве основного компонента лекарственного препарата для лечения целиакии. В качестве активатора папаина был выбран цистеин. Коллеги из ЮАР сосредоточились на исследовании пролилолигопептидазы (РОР). Был проведен поиск последовательностей РОР в базе данных NCBI, сравнительный анализ структур растительных и животных РОР и построено филогенетическое дерево. Выявлен высокий уровень сходства растительных и животных РОР, обуславливающий сходство их каталитических функций. Показано также, что у растительных РОР отсутствует сигнальный пептид, что делает невозможным их локализацию вместе с запасными белками семян. Была исследована динамика активности РОР в процессе прорастания семян пшеницы. В первые 3 дня прорастания, когда идет интенсивный гидролиз запасных белков семян, активность РОР была минимальной, что вместе с данными по локализации РОР указывает на отсутствие значительной роли этого фермента в гидролизе запасных белков. Для предсказания наиболее вероятных функций РОР были впервые предсказаны регуляторные элементы в промоторной области генов РОР из овса и арабидопсиса, у которых расшифрованы геномы. Были выявлены cis-элементы, связанные с реакцией на свет, абиотический стресс и с гормональной регуляцией. Данные о том, что участие РОР в гидролизе проламинов при прорастании семян маловероятно, совпадают с данными российских участников проекта об отсутствии РОР в комплексе пищеварительных PSP тенебрионид, и указывает на невысокую целесообразность продолжения исследований растительных РОР с целью включения их в ферментный препарат для лечения целиакии. Поэтому дальнейшие исследования по созданию и тестированию препарата были проведены российской стороной с предложенным ранее препаратом на основе папаина. Проведены опыты по ковалентной иммобилизации папаина на природном биосовместимом, низкотоксичном полимере хитозане, однако активность папаина в результате иммобилизации снизилась более чем в 12 раз. Анализ структуры папаина показал, что это снижение вероятнее всего обусловлено затруднением поступления субстрата в активный центр фермента при иммобилизации. Поэтому ковалентная иммобилизация на хитозане была признана нецелесообразной. Проведено исследование токсичности предложенного препарата на клетках крови человека, в результате которого никакого патологического действия препарата на клетки крови и исследованные параметры выявлено не было. По результатам, полученным в ходе выполнения проекта, мы можем предложить для дальнейшей апробации препарат, содержащий папаин и цистеин