ИСТИНА

Целью данного проекта является описание паттернов распространенности неканонических миозинов класса I в популяциях Т-лимфоцитов человека, а также формулировка гипотезы об их роли в активации и клеточной подвижности Т-лимфоцитов в норме и при Т-ОЛЛ. Несмотря на сложившиеся представления о тканеспецифичном распределении миозинов I и важной роли, которую каждый из них может играть в ремоделировании плазматической мембраны, их дифференциальная роль в активации и клеточной подвижности Т-лимфоцитов человека остается не до конца изученной. Передача сигнала через иммунные рецепторы и миграция по сложным паттернам являются основой нормального созревания и функционирования лимфоцитов, а нарушения этого процесса играют роль в развитии воспаления и онкогематологических заболеваний. Анализ участия миозинов I в организации клеточных мембран при активации и миграции различных популяций Т-лимфоцитов позволит лучше понять механизмы нормальной и патологической активации этих клеток и, таким образом, является важным для фундаментальных и прикладных биомедицинских исследований.

Immune cells are the most motile and capable of quickly switching between different types of cellular movement in the human body. Thus, lymphocytes, especially T cells, migrating along complex patterns during their maturation and functioning, demonstrate transitions between all known types of cell motility (rolling, amoeboid motility, mesenchymal motility. The initiation of T lymphocyte movement can occur spontaneously or as a result of activation. In this process, the T cell immunophenotype and morphology are consistently changed: signal clusters and intercellular contacts of various types, as well as plasma membrane protrusions (filopodia and lamellipodia) are formed. The response to lymphocyte activation is proliferation, non-directed (kinesis) and directed (taxis) cell movement. In addition to directionality, T lymphocyte movement is characterized by speed, the shape of moving cells and the involvement of integrins in the formation of cell contacts. The change of the motility pattern and the acquisition of directional movement are associated with the reorganization of the plasma membrane, the submembrane actin network and cellular contacts. While acknowledging the crucial role that plasma membrane remodeling has in the process of lymphocyte activation and mobility, little attention is currently paid to the role of non-canonical class I myosins in this process. Myosins I are myosins with a single "head" catalytic domain and a "tail" domain capable of interacting with the plasma membrane. The main function of these molecules is the connection of the cell membrane with the submembrane actin cytoskeleton, the formation of protrusions, participation in the receptor endocytosis and the formation of cell contacts. At the same time, it is not completely clear which myosins of this class prevail in different populations of human T lymphocytes, whether their composition changes during lymphocyte maturation and activation, and what functions are assigned to each of the expressed myosins I. In this project, we propose to clarify the composition of class I myosins (demonstrating tissue-specific distribution), up to isoforms, in human T lymphocytes of varying maturation stages and activation stati, and then to trace the effect of in vitro activation on class I myosins’ expression in these cells. In addition, the main model cell lines of human T lymphocytes (Jurkat, MOLT-3, MOLT-4, corresponding to acute lymphoblastic leukemia, ALL) will be described by the representation pattern of class I myosins and compared with normal human T lymphocytes ex vivo. The selected cell lines will be used to confirm the data on the differential overexpression of some class I myosins in malignant T lymphoblasts. In the future, this will allow us to choose the optimal in vitro model for studies with myosin I knock-down, to assess the mechanistic role of these molecules in T cell activation and their prospects as therapeutic targets in the case of T-ALL. Thus, the data obtained will allow to propose the role of myosins I in normal and pathological human T cell activation and create a foundation for the new studies of the leukemia pathogenesis and other immune pathologies.

Общий план работы будет включать: 2025 год: 1) анализ представленности неклассических миозинов I в Т-лимфоцитах человека по открытым базам РНК секвенирования (RNAseq); 2) разработка ПЦР-системы для анализа экспрессии миозинов I методом ПЦР в реальном времени; 3) оценка иммунофенотипа и сортировка наивных/зрелых популяций Т-лимфоцитов крови человека ex vivo; оценка ключевых метрик распластывания и подвижности; заморозка клеток на РНК; получение кДНК. 4) активация отсортированных Т-лимфоцитов крови in vitro; оценка ключевых метрик распластывания и подвижности; заморозка клеток на РНК; получение кДНК. 5) анализ представленности неклассических миозинов I в популяциях нормальных Т-лимфоцитов человека методом ПЦР в реальном времени; сравнение с метриками Т-клеточной подвижности. 2026 год: 1) оценка иммунофенотипа линий Т-ОЛЛ человека; оценка ключевых метрик распластывания и подвижности; заморозка клеток на РНК; получение кДНК. 2) анализ представленности неклассических миозинов I в популяциях Т-ОЛЛ человека методом ПЦР в реальном времени; сравнение с метриками Т-клеточной подвижности. Выбор оптимальной клеточной модели с аберрантной представленностью миозинов I. 3) активация клеток Т-ОЛЛ in vitro; оценка ключевых метрик распластывания и подвижности; заморозка клеток на РНК; получение кДНК. 4) анализ представленности неклассических миозинов I в популяциях активированных клеток Т-ОЛЛ человека методом ПЦР в реальном времени; сравнение с метриками Т-клеточной подвижности. 5) визуализация ключевых миозинов I в нормальных Т-клетках и в культуре Т-ОЛЛ до и после активации. 6) вывод о предположительной роли неклассических миозинов I в активации Т-клеток и патогенезе Т-ОЛЛ. В ходе выполнения проекта в 2025 году будут разработаны ПЦР-системы и получены данные о представленности целевых миозинов I в нормальных Т-лимфоцитах в зависимости от зрелости и уровня активации. Результаты работы будут представлены на конференции. По результатам работы будет опубликована статья. В ходе выполнения проекта в 2026 году будет выбрана линия Т-ОЛЛ для сравнения с нормальными Т-клетками и получены данные о представленности целевых миозинов I при Т-ОЛЛ до и после активации. Также будут получены данные о распределении миозинов I в клетке и их связи с элементами цитоскелета. Вместе полученные данные создадут задел для дальнейших фундаментальных и прикладных исследований роли миозинов I в норме и при патологии Т-лимфоцитов.

У участников проекта накоплен большой опыт анализа клеточной подвижности и элементов цитоскелета (8 статей по данной тематике за последние 5 лет). Также с 2017 года по 2023 год участники данного проекта занимались изучением роли изоформы А миозина IC в онкогенезе на модели рака предстательной железы (4 научных статьи по данной тематике). Таким образом, коллектив обладает обширным опытом совместной работы и владеет методиками, применение которых запланировано в данном проекте.

В настоящем проекте будет установлена представленность восьми неклассических миозинов I в различных популяциях Т-лимфоцитов человека ex vivo. Для миозинов, имеющих изоформы, будет дополнительно впервые уточнен паттерн представленности изоформ. Популяции исследуемых лимфоцитов будут отсортированы из крови человека методом FACS. Будет оценено изменение представленности миозинов I в отсортированных популяциях при их активации in vitro. Будут обозначены ключевые миозины I, отвечающие за активацию и подвижность Т-лимфоцитов человека. В процессе разработки релевантной in vitro модели Т-ОЛЛ для исследования роли неканонических миозинов I класса в активации и подвижности опухолевых лимфоцитов, наиболее распространенные клеточные линии Т-ОЛЛ человека будут сравниваться по иммунофенотипу и паттерну экспрессии миозинов I с нормальными лимфоцитами человека ex vivo. Будут выявлены дифференциально представленные миозины класса I. На моделях нормальных Т лимфоцитов ex vivo и выбранной культуры Т-ОЛЛ in vitro будут проведены функциональные тесты на распластывание и клеточную подвижность до и после активации в модели ненаправленной миграции (свободное блуждание). Данные по клеточной подвижности будут сравниваться с паттерном представленности миозинов I класса. Для визуализации распределения целевых миозинов I в нормальных и опухолевых Т-лимфоцитах до и после активации и предположения их роли в Т-клеточной подвижности будет оценена их ко-локализация с основными компонентами цитоскелета (подмембранная актиновая сеть, клеточные контакты). Полученные в ходе работы данные будут способствовать пониманию внутриклеточных механизмов ремоделирования плазматической мембраны лимфоцитов, которые крайне важны для их функционирования в норме и патологии. Понимание роли миозинов I в этом процессе может сделать их эффективными мишенями при борьбе с рядом заболеваний.