![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
В последние несколько лет биомиметический подход к решению различных проблем в медицине и фармакологии используется все активнее. Особенно актуально и оправдано использование материалов и технологий, заимствованных у природы, в инженерных направлениях биологии – биоинженерии и биотехнологии. Использование природных биополимеров для создания новых гибридных биоинженерных конструкций является одним из наиболее перспективных биомиметических подходов. Однако зачастую их медицинское использование никак не учитывает их роль и функции в природе. Так, если в водорослях альгинаты выполняют преимущественно структурно-механическую функцию, то у бактерий, способных к синтезу этого полисахарида родов Azotobacter и Pseudomonas, их функции более разнообразны, но главная из них – защитная. Клетки этих бактерий синтезируют и секретируют этот экзополихасахарид для формирования внешней слизистой оболочки отдельных клетоки и их скоплений - цист или биофильмов, соответственно, которые защищают бактериальные клетки от неблагоприятных внешних факторов, в т.ч. фагоцитоза макрофагов, воздействию антибиотиков, антител, токсинов и ферментов других бактерий. Эти уникальные свойства бактериальных альгинатов можно использовать для создания биоинженерной конструкции, содержащей пробиотические бактерии, обладающие потенциальной терапевтической способностью для регенеративной медицины. Роль бактерий микробиоты кишечника в процессах заживления повреждений его стенки в настоящее время активно исследуется, и многие устоявшиеся представления претерпевают иногда серьезный пересмотр. Имеется ряд исследований, в которых показано, что некоторые пробиотические бактерии способствуют ускорению процессов регенерации поврежденных тканей стенки кишечника при различных хронических воспалительных его заболеваниях. Целью проекта является создание биоинженерной химерной конструкции из бактериального альгината и пробиотических бактерий для регенерации повреждений стенки кишечника. Для решения основной цели Проект выстроен в форме нескольких направлений, каждое из которых относится к различным областям науки, но все они тесно переплетены друг с другом. Первым направлением является разработка технологии биосинтеза бактериальных альгинатов с заданными физико-химическими и биологическими свойствами, наиболее соответствующими свойствам биоматериала биофильма для пробиотических бактерий, и разработка на его основе полимерной конструкции, которую можно использовать в качестве заплаты стенки кишечника. Вторым направлением является исследование микробиоты в области дефекта стенки кишечника в процессе его регенерации при использовании композитной полимерной конструкции и разработка состава пробиотических бактерий для биоинженерного биофильма. Третьим направлением является создание системы пролонгированного высвобождения противобактериальных препаратов широкого спектра действия из разработанной композитной полимерной конструкции и исследование их воздействия на процессы регенерации дефекта стенки кишечника и бактерий микробиоты кишечника в области дефекта. Наконец, создание самого биоинженерного биофильма, что требует разработки методики помещения пробиотических бактерий отобранных штаммов в полученный бактериальный альгинат и проведение исследований их жизнеспособности, роста и миграции. Проект обладает новизной в различных аспектах решения поставленных задач. Прежде всего, впервые в мире будет применен биомиметический подход, заключающийся в использовании бактериальных экзополисахаридов – альгианатов с заданными свойствами, синтезируемых с помощью технологии контролируемого биосинтеза бактериями-продуцентами, в качестве полимерного биоматериала, в который будут помещены пробиотические бактерии с целью создания биоинженерного биофильма. Впервые альгинаты бактериального происхождения будут использованы для исследования их регенеративного потенциала при восстановлении стенки кишечника на экспериментальной модели ее дефекта на лабораторных животных. Впервые пробиотические бактерии будут использованы в качестве потенциального терапевтического агента в составе биоинженерного изделия и будет исследована их функциональность при регенерации стенки кишечника. Впервые будет исследовано изменение состава бактерий локально в области дефекта стенки кишечника в процессе ее регенерации при использовании биоинженерного изделия, а полученные данные будут использованы при создании биоинженерного биофильма, в составе которого в качестве потенциальных терапевтических агентов используются пробиотические бактерии. Впервые будет исследовано воздействие антибактериальных препаратов (антибиотика и антибактериального белка) на функционирование биоинженерного биофильма, в т.ч. при его применении для регенерации повреждений стенки кишечника. Таким образом, используемые в проекте новые оригинальные подходы в решении поставленной задачи в полной мере реализуют принципы направления по переходу к персонализированной медицине, высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения, в том числе за счет рационального применения лекарственных препаратов (прежде всего антибактериальных).
In the last few years, the biomimetic approach to solving various problems in medicine and pharmacology has been increasingly used. Particularly relevant and justified is the use of materials and technologies borrowed from nature, in engineering biology - bioengineering and biotechnology. The use of natural biopolymers to create new hybrid bioengineering structures is one of the most promising biomimetic approaches. However, often their medical use does not take into account their role and functions in nature. So, if in algae alginates perform a predominantly structural-mechanical function, then the bacteria capable of synthesizing this polysaccharide of the genera Azotobacter and Pseudomonas, their functions are more diverse, but the main one is protective. The cells of these bacteria synthesize and secrete this exopolysaccharide to form the outer mucous membrane of individual cells and their clusters - cysts or biofilms, which respectively protect bacterial cells from unfavorable external factors, including phagocytosis of macrophages, the action of antibiotics, antibodies, toxins and enzymes of other bacteria. These unique properties of bacterial alginates can be used to create a bioengineering design containing probiotic bacteria that have potential therapeutic capacity for regenerative medicine. The role of bacteria of the intestinal microbiota in the healing processes of damages to its walls is being actively investigated, and many of the established ideas undergo a serious revision sometimes. There are a number of studies in which it is shown that some probiotic bacteria contribute to the acceleration of regeneration of damaged tissues of the intestinal wall with various chronic inflammatory diseases. The aim of the project is to create a bioengineered chimeric construction from bacterial alginate and probiotic bacteria for regenerating damage to the intestinal wall. To solve the main objective, the Project is built in the form of several directions, each of which relates to different fields of science, but all of them are closely intertwined with each other. The first direction is the development of the technology of biosynthesis of bacterial alginates with predetermined physico-chemical and biological properties, most appropriate properties of biomaterial biofilm for probiotic bacteria, and development on its basis of a polymeric structure that can be used as an intestinal patch. The second direction is the study of the microbiota in the area of the bowel wall defect during its regeneration with the use of a composite polymeric structure and the development of the composition of probiotic bacteria for bioengineering biofilm. The third direction is the creation of a system for prolonged release of broad-spectrum antibacterial drugs from the developed composite polymer structure and the investigation of their effect on the processes of regeneration of a defect in the intestinal wall and the bacterium of the intestinal microbiota in the region of the defect. Finally, the creation of the bioengineering biofilm, which requires the development of a methodology for placing the probiotic bacteria of selected strains in the bacterial alginate obtained and carrying out studies of their viability, growth and migration. The project has a novelty in various aspects of the solution of the tasks. First of all, for the first time in the world, a biomimetic approach will be applied, consisting in the use of bacterial exopolysaccharides - alginates with pre-determined properties, synthesized with the technology of controlled biosynthesis by producer bacteria, as a polymeric biomaterial into which probiotic bacteria will be placed in order to create bioengineering biofilm. For the first time alginates of bacterial origin will be used to study their regenerative potential when restoring the intestinal wall on the experimental model of its defect in laboratory animals. For the first time, probiotic bacteria will be used as a potential therapeutic agent in the bioengineering product and their functionality will be investigated in the regeneration of the intestinal wall. For the first time, a change in the composition of bacteria locally in the area of the defect of the intestinal wall during its regeneration using a bioengineering product will be investigated, and the obtained data will be used in the creation of bioengineering biofilm, in which probiotic bacteria are used as potential therapeutic agents. For the first time, the effect of antibacterial drugs (antibiotic and antibacterial protein) on the functioning of bioengineering biofilm will be studied, including it’s ability to regenerate damage to the intestinal wall. Thus, the new original approaches used in the project realize the principles of the direction for the transition to personalized medicine, high-tech health care and health saving technologies, including through the rational use of medicines (especially antibacterial drugs).
Результатами научно-исследовательской работы по Проекту будут: 1) промежуточные и заключительный отчёт о НИР, включающие: - программу экспериментальных исследований; - акты получения поли-3-оксибитирата и его сополимеров методом контролируемого биосинтеза; - акты получения бактериальных альгинатов методом контролируемого биосинтеза; - акт получения полимерной конструкции для биоинженерного биофильма; - описание методики контролируемого биосинтеза бактериальных альгинатов; - описание методики изготовления композиционной полимерной конструкции для биоинженерного биофильма; - описание методики культивированиея бактерий микробиоты кишечника; - описание методики инкапсулирования бактерий микробиоты в гидрогель на основе бактериальных альгинатов; - описание методики инкапсулирования в композиционную полимерную конструкцию антибактериальных веществ; - описание методики получения биоинженерного биофильма; - описание модели повреждения стенки кишечника; - результаты исследования физико-химических свойств полученных бактериальных альгинатов; - результаты исследования физико-химических свойств полученных бактериальных ПОБ и его сополимера; - результаты исследования морфологии полимерной конструкции для биоинженерного биофильма; - результаты исследования жизнеспособности и роста бактерий микробиоты в гидрогеле на основе бактериальных альгинатов; - результаты исследования воздействия антибактериальных препаратов на жизнеспособность бактерий микробиоты, инкапсулированных в гидрогель на основе бактериальных альгинатов; - результаты исследования механических свойств бактериального альгината и бактериального альгината, содержащего бактерии микробиоты; - результаты исследования высвобождения антибактериальных веществ из композиционной полимерной конструкции; - результаты исследования регенерации тканей стенки кишечника при использовании композитной полимерной конструкции для биоинженерного биофильма; - результаты исследования состава микробиоты кишечника при регенерации стенки кишечника при использовании композитной полимерной конструкции для биоинженерного биофильма. - результаты исследования функциональной эффективности полученных стентов-эндопротезов на лабораторных животных in vivo: 2) отчет о патентных исследованиях по ГОСТ Р 15.011-96 в области разработки кишечных заплат и пробиотиков для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта; 3) 2 заявки на патенты: композитной полимерной конструкции для биоинженерного биофильма и биоинженерного биофильма; 4) авторский курс лекций – 1 монография; 5) учебно-методическое пособие для практических занятий – 1 монография; 6) 8 публикаций в рецензируемых российских и зарубежных научных изданиях, индексируемых в базах данных «Сеть науки» (Web of Science) и «Скопус» (Scopus). Будет разработана технология биосинтеза бактериальных альгинатов с заданными физико-химическими и биологическими свойствами, наиболее соответствующими свойствам биоматериала биофильма для пробиотических бактерий. Бактерии из рода Azotobacter обладают уникальной особенностью – они способны к биосинтезу сразу двух полимеров биомедицинского назначения: альгинатов, которые они секретируют наружу и поли-3-оксиалканоатов, которые они накапливают внутри клетки в специальных гранулах. В нашей работе помимо альгинатов мы будем использовать и бактериальные поли-3-оксиалканоаты – сополимер поли-3-оксибутирата с 3-оксивалератом (ПОБВ). Поэтому нами будет осуществлен отбор штаммов-продуцентов, подобраны условия биосинтеза и разработана технология конкурентного биосинтеза альгината и ПОБВ, позволяющая получать оба полимера для целей Проекта. Для разработки технологии получения полимеров с заданными свойствами будет проведение комплексное исследование физико-химических свойств полимеров, полученных в различных условиях. Для исследования роли бактерий микробиоты в регенерации повреждений кишечника, будет разработана композиционная полимерная конструкция на основе пористой подложки из ПОБВ, заполненной альгинатным гидрогелем, которую можно использовать в качестве кишечной заплаты. Для создания полимерной конструкции будет разработана модель повреждения стенки кишечника крысы in vivo с помощью хирургических методов. Для разработки дизайна полимерной подложки и всей композиционной конструкции будет проведено исследование морфологии образцов изделия различного строения, их физико-химические свойства - эти исследования патентоспособны. Эти исследования направлены на решение проблемы перехода к высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения, т.к., к сожалению, кишечные заплаты отечественного производства очень редко используются в нашей клинической практике, практически все подобные высокотехнологические медицинские изделия импортные. Будет исследована микробиота в области дефекта стенки кишечника в процессе его регенерации при использовании композитной полимерной конструкции для биоинженерного биофильма. На основании этих данных, а также данных, полученных при исследовании жизнеспособности и роста пробиотических бактерий будет разработан состав пробиотических бактерий для создания биоинженерного биофильма. Также будет исследовано воздействие бактерий, помещенных в альгинатный гидрогель, на его физико-химические, в т.ч. механические свойства. Эти исследования направлены на решение проблемы перехода к персонализированной медицине. Будет исследовано воздействия противобактериальных препаратов: антибиотиков (например, левофлоксацина) и противобактериальных белков (например, лизоцима) широкого спектра действия, используемых для лечения язв кишечника, на процессы регенерации дефекта стенки кишечника и бактерии микробиоты кишечника в области дефекта. С этой целью будет разработан метод загрузки в разработанную композитную полимерную конструкцию на основе бактериального альгината и ПОБВ антибактериальных веществ: антибиотика (например, левофлоксацина) и противобактериального терапевтического белка (например, лизоцима) для их пролонгированного высвобождения. В модельных условиях in vitro будет исследовано воздействие антибактериальных препаратов на жизнеспособность бактерий микробиоты, введенных в альгинатный гидрогель. Эти исследования направлены на решение проблемы рационального применения лекарственных препаратов (прежде всего антибактериальных). Таким образом, Проект представляет собой несколько направлений, каждое из которых относится к различным областям науки, но все направления тесно переплетены друг с другом за счет использования определенных биоматериалов и методик. И такой комплексный междисциплинарный подход через параллельное решение основных задач при их пересечении в определенных точках ведет к достижению основной цели – созданию биоинженерного биофильма для регенеративной медицины. Т.е. проблема решается согласно ведущей стратегии «снизу-вверх», которая в последнее время широко применяется в инженерных направлениях в биологии: биоинженерии, биотехнологии, бионанотехнологии. Такая стратегия определяет расширяющийся масштаб решения проблемы, возможность масштабирования в широких пределах результатов Проекта. Полученные результаты будут превышать мировой уровень исследований в этой области, т.к. данное научное направление находится в настоящее время только в самом начале своего развития, тогда как тематика инженерии тканей кишечника бурно развивается. Благодаря наличию большого задела в указанной области, а также всего спектра методов для биосинтеза и исследования бактериальных альгинатов, изготовления биоинженерной конструкции на их основе, исследования регенерации тканей стенки кишечника полученные результаты будут соответствовать мировому уровню, а благодаря новизне и актуальности заявляемой темы и превышать его. Поиск научной литературе в базе данных PubMed по теме «тканевая инженерия» дает больше 87 тыс. статей с практически экспоненциальной динамикой роста их числа, по теме «микробиота» больше 27 тыс. статей с экспоненциальной динамикой роста их числа. Тогда как при пересечении этих тем мы сможем найти только 65 статей, из которых 61 вышли в последние 5 лет. Работа по Проекту построена таким образом, чтобы при использовании различных методов, не только высокотехнологичных, но и доступных для освоения молодыми специалистами (в т.ч. студентами), была возможность получения интересных новых научных данных, соответствующих мировому уровню и превышающих его, на стыке отдаленных друг от друга дисциплин (например, биосинтетической микробиологии и регенеративной медицины), за счет реализации биомиметического подхода в биоинженерии и за счет постановки нетривиальных задач, которые могут открыть новые горизонты в, казалось бы, уже глубоко и разносторонне разработанных областях науки, как, например, использование пробиотических бактерий для регенерации тканей или бактериального альгината для создания искусственного биофильма. Такая концепция проекта позволит молодым специалистам, вовлеченным в работу освоить максимум компетенций и получить большой объем знаний в новых междисциплинарных направлениях науки, что в свою очередь может привести к формированию новой научной школы. При этом в Проекте предусмотрена возможность реализации не только главной заявленной задачи, но и задач второй очереди, которые, тем не менее, обладают также высокой научной значимостью. Результаты, полученные в ходе выполнения Проекта помимо их научной значимости будут обладать большим практическим потенциалом в форме разработки медицинского изделия – заплаты стенки кишечника, которая позволит более эффективно проводить хирургическое лечение хронических воспалительных заболеваний кишечника, поэтому в Проекте предусмотрена подача заявок на патенты. Междисциплинарные научные направления, по которым будет вестись Проект, очень актуальны для усовершенствования образовательного процесса в университетах, тем более, что в заявке на этот проект участвуют молодые специалисты, в т.ч. аспиранты и студенты, поэтому в Проекте предусмотрена разработка курса лекций и задачи для практикума.
ФИЦ Биотехнологии РАН | Соисполнитель |
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 августа 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Получение бактериального алдьгината и исследование его свойств |
Результаты этапа: | ||
2 | 1 января 2018 г.-30 июня 2018 г. | Получение бактериального алдьгината и исследование его свойств |
Результаты этапа: | ||
3 | 1 июля 2018 г.-30 июня 2019 г. | Получение бактериального алдьгината и исследование его свойств |
Результаты этапа: Конкретными научными результатами научно-исследовательской работы по этапу 2 "Разработка технологических основ создания биоинженерного биофильма на основе бактериальных альгинатов" (01.08.2018-30.06.2019 г.) является Промежуточный отчёт о НИР, включающий 12 разделов по числу пунктов Плана работ научного исследования Соглашения № 17-74-20104 от 01.08.2017 г. Далее по каждому из разделов будет приведено краткое описание Достигнутых конкретных научных результатов в отчетном периоде. 2.1.1. Описание методики инкапсулирования пробиотических бактерий в гидрогель на основе бактериальных альгинатов. Пробиотические бактерии L. plantarum 8P-A3 и B. longum MC-42 культивируют в 1% бактериальном альгинате (образец АЛГ_К3), смешанным с MRS-бульоном как основной питательной средой, как на полужидкой среде без перемешивания при 37°С в течение 96 часов. Полученный раствор альгината натрия, содержащий MRS-бульон и пробиотические бактерии, перемешивают в биоинкубаторе с перемешивающим элементом при 50 об/мин в течение 15 мин до достижения равномерного распределения бактериальной биомассы по объему среды, после чего гелируют путем добавления 50 мМ раствора хлорида кальция. Разработанный метод позволяет получать гидрогель бактериального альгината, содержащий в случае L. plantarum 8P-A3 - 2,5×107 КОЕ/мл бактерий, а в случае B. longum MC-42 - 3,4×106 КОЕ/мл бактерий. 2.1.2. Описание методики инкапсулирования в композитную полимерную конструкцию антибактериальных веществ. Были разработаны методы загрузки в композитную полимерную конструкцию антибактериальных веществ: антибиотика левофлоксацина и противобактериального терапевтического белка лизоцима для их пролонгированного высвобождения. Инкапсулирование низкомолекулярного антибактериального ЛВ, левофлоксацина, в композиционную полимерную конструкцию проводят путем его загрузки в полимерный материал подложки и микросфер на стадии их изготовления. На первой стадии левофлоксацин загружают в пористые подложки полимерной конструкции на стадии их изготовления при помощи модифицированного метода выщелачивания. Для этого смешивают растворы ПОБВ и левофлоксацина в хлороформе, для чего к 8 мл раствора ПОБВ в хлороформе в концентрации 24 мг/мл добавляют 0,1 мл раствора левофлоксацина в хлороформе в концентрации 200 мг/мл. Полученный совместный раствор ПОБВ и левофлоксацина в хлороформе смешивают с порошком бикарбоната аммония (с размером частиц соли в диапазоне 90-300 мкм в соотношении 10:1 по массе) и тщательно перемешивают шпателем. Смесь помещают в стеклянную чашку Петри диаметром 5 см и оставляют при комнатной температуре до полного испарения органического растворителя в течение 3-х часов. После этого форму помещают в горячую дистиллированную воду (60°С) до полного прекращения газообразования, промывают дистиллированной водой 5 раз и высушивают при 37°C в течение суток. На втором этапе загружают левофлоксацин в пористые микросферы конструкции на стадии их изготовления при помощи метода «водная фаза/масляная фаза/водная фаза» (W/O/W), с последующим вымыванием порообразователя. В качестве пороборазователя используют водный раствор карбоната аммония. К 20 мл хлороформенного раствора ПОБ в концентрации 42 мг/мл добавляют 1 мл раствора левофлоксацина в хлороформе в концентрации 102 мг/мл, после чего гомогенизируют с 6,6 мл 5%-го (вес/об.) водного раствора карбоната аммония. Полученный коллоид по каплям добавляют в 210 мл 1%-го (вес./об.) раствора поливинилового спирта при постоянном перемешивании на верхнеприводной мешалке при скорости 750 об/мин. После полного испарения хлороформа частицы отделяют от эмульгатора (ПВС) путем осаждения и промывки дистиллированной водой. Для полного выхода порообразователя, микросферы инкубируют в горячей дистиллированной воде (60°С). Эффективность загрузки определяют методом УФ-спектроскопии по остаточному содержанию левофлоксацина при растворении полученных подложки и микросфер в хлороформе, предварительно построив калибровочную кривую по раствору ЛВ в различных известных концентрациях в растворе ПОБВ против раствора ПОБВ в хлороформе без ЛВ по поглощения растворов при максимуме поглощения левофлоксацина при λ=287 нм. Инкапсулирование лизоцима проводят с использованием метода сорбции на пористой подложке и пористых микросферах за счет ионного взаимодействия катионного белка лизоцима со слабо отрицательно заряженной поверхностью ПОБ и ПОБВ, разработанного нами ранее. Для этого используют пористую подложку с уже нанесенными на нее микросферами. На первой стадии проводят обработку подложки с микросферами 133 мМ NaOH. После отмывки подложки с нанесенными на них микросферами проводят их ионизацию путем диализа против 0,125 фосфатно-солевого буфера. Для загрузки лизоцима в конструкцию сливают буферный раствор, а к подложкам с нанесенными на них микросферами добавляют 5 мл раствора лизоцима в концентрации 1,19 мг/мл, полученного после диализа против 0,125 фосфатно-солевого буфера. Инкубируют 1 час. при перемешивании на мультиротаторе при 15 об./мин при +4ºС. В результате была получена композиционная полимерная конструкция, содержащая в полимерном материале подложки и микросфер 1% (вес.) лизоцима. После чего проводят пропитку подложки с нанесенными на нее микросферами раствором альгината натрия и его гелирование in situ, т.е. получение самой конструкции. Для этой процедуры конструкцию на основе ПОБ/ПОБВ помещают в 1% раствор бактериального альгината натрия, а емкость с ней в эксикатор, где создавают отрицательное давление для вымещения воздуха из пор микросфер и подложки и замещения их раствором альгината. После чего к полученному раствору добавляют 0,1 мл 50 мМ раствора CaCl2 для гелирования альгината. 2.1.3. Описание модели повреждения стенки кишечника. Операции проводят на крысах линии Вистар весом 250-400 г. Проводят наркотизацию Золетилом 50 в дозе 10 мг/кг в сочетании с Рометаром в дозе 6 мг/кг внутримышечно. Повреждение кишечника моделируют на участки кишечника примерно на 1 см после его выхода из слепой кишки. После надреза кожи производят лапаротомию и выведение выбранного участка толстого кишечника из брюшной полости с его фиксацией при помощи двух зажимов Кохера, модифицированных нами при помощи обмотки медицинской ватой с формированием углублений на этом ватном валике на каждой из сторон для предотвращения повреждения серозно-мышечной ткани кишечника при непосредственном захвате. Повреждение толстого кишечника проводят хирургическими глазными ножницами по центру между двумя зажимами Кохера шириной в 3-4 мм. Перед непосредственной имплантацией в толстый кишечник полимерных конструкций проводят экспериментальное механико-химическое локальное повреждение слизистой кишечника при помощи ваты, обмотанной вокруг шпателя в месте разреза, смоченной в 1% растворе 2,4,6-тринитробензолсульфониевой кислоты в 50% этаноле. Разработанный метод позволяет имплантировать полимерные конструкции различной формы: трубки длиной 15-20 мм и диаметром в 5 мм, а также пластины-заплаты длиной 15-20 мм и шириной 5 мм. При наложении швов для закрытия поврежденного участка в толстом кишечнике используют модифицированный сквозной шов Ламбера, накладываемый крест на крест по 3 стежка. При завершении операции трубка или заплата фиксируется краевыми швами на стенку толстого кишечника, затем брюшную стенку и кожу закрывают поперечными швами. Все крысы получают жидкое углеводно-белковое питание, которое начинают вводить за 2 недели до операции. Через 3, 7 и 14 суток животных умервщляют путем перенаркотизации и проводят релапоротомию для получения биологического материала. Пробы для определения бактериального состава в кишечной микробиоте крыс отбирают из кала и путем соскоба со слизистой и замораживают при -80 ºС, а для взятия проб для гистологической оценки регенерации кишечной стенки вырезают участки стенки кишечника в области имплантации и фиксируют их в забуференном формалине. 2.1.4. Результаты исследования жизнеспособности и роста пробиотических бактерий в гидрогеле на основе бактериальных альгинатов; Пробиотические бактерии L. plantarum 8P-A3 и B. longum MC-42 равномерно растут и распределяются в толще гидрогеля, выраженной миграции бактерий из альгинатного гидрогеля не происходит. Гибели клеток не происходило, количество клеток увеличивается более чем в 11-15 раз за 96 часов культивирования. Значительной разницы в росте бактерий в водорослевом и бактериальном альгинате не наблюдалось. 1.1.5. Результаты исследования воздействия антибактериальных веществ на жизнеспособность пробиотических бактерий, инкапсулированных в гидрогель на основе бактериальных альгинатов; Пробиотические бактерии B. longum MC-42 были чувствительны ко всем используемым нами антибактериальным веществам: антибиотикам (левофлоксацину, пеннициллину, стрептомицину) и противобактериальному терапевтическому белку лизоцима, а L. plantarum 8P-A3 – только к антибиотикам (левофлоксацину, пеннициллину, стрептомицину), а к лизоциму оказались нечувствительны. Было показано, что как бактериальный, так и водорослевый альгинаты надежно защищают пробиотические бактерии от действия антибиотиков левофлоксацина, пеннициллина, стрептомицина и антибактериального белка лизоцима (для B. longum MC-42), т.к. подавления их роста не наблюдалось. 2.1.6. Результаты исследования механических свойств бактериального альгината, не содержащего и содержащего пробиотические бактерии; Исследование методом реометрии механических свойств гидрогелей из полученного бактериального альгината после культивирования в нем пробиотических бактерий показало, что после культивирования L. plantarum 8P-A3 в бактериалном альгинате комплексный модуль составил 0,76 кПа при 0,80 кПа в контроле, тогда как в водорослевом альгинате - 0,26 кПа при 0,52 кПа в контроле. Культивирование B. longum MC-42 практически не изменяет механические свойства водорослевого и бактериального альгинатного гидрогеля. 2.1.7. Результаты исследования воздействия пробиотических бактерий на физико-химические свойства бактериального альгината, их содержащего. Исследование с помощью методов вискозиметрии, ИК-спектроскопии, термогравиметрии методов молекулярной массы, термофизических свойств и гидрофильности гидрогелей из полученных бактериальных альгинатов после культивирования в них пробиотических бактерий показало, что культивирование бактерий приводит к изменению физико-химических свойств бактериального и водорослевого альгината. После культивирования L. plantarum 8P-A3 в бактериальном альгинате молярное содержание остатков гулуроновой кислоты составило 33 моль% при 40 моль% в контроле, молекулярная масса – 520 кДа при 570 кДа в контроле, потеря массы при нагреве – 46,2% при 42,9% в контроле, водопоглощение – на 364% при 393% в контроле. Физико-химические свойства бактериального альгината после культивирования в нем B. longum MC-42 практически не отличались от контроля. После культивирования L. plantarum 8P-A3 в водорослевом альгинате молярное содержание остатков гулуроновой кислоты составило 2 моль% (после культивирования B. longum MC-42 – 3 моль%) при 20 моль% в контроле, молекулярная масса – 270 кДа (после культивирования B. longum MC-42 – 410 кДа) при 680 кДа в контроле, потеря массы при нагреве – 61,1% (после культивирования B. longum MC-42 – 59,6%) при 40,7% в контроле, водопоглощение – на 108% (после культивирования B. longum MC-42 – 197%) при 230% в контроле. 2.1.8. Результаты исследования высвобождения антибактериальных веществ из композитной полимерной конструкции. Время полувысвобождения низкомолекулярного ЛВ, левофлоксацина, из композиционной полимерной конструкции составляет 5,9 сут., а время полувысвобождения терапевтического белка лизоцима из композиционной полимерной конструкции составляет 12,4 сут. Высвобождение как низкомолекулярного левофлоксацина, так и высокомолекулярного лизоцима происходит с заданной кинетикой по механизму диффузии. 2.1.9. Результаты исследования биосовместимости in vitro пористой подложки полимерной конструкции. Исследование биосовместимости in vitro пористой подложки полимерной конструкции на культуре мезенхимальных стволовых клеток (МСК) показало, что пористая подложка полимерной конструкции поддерживает стабильный долговременный рост МСК в течение 21 сут., тогда как на культуральном пластике рост клеток прекращался к 14 сут., а затем наблюдалось падение числа клеток. Число клеток на полимерной конструкции превышает количество клеток на культуральном пластике на 7-ой день культивирования в 5,0 раз, на 14-ый день – в 3,2 раза, на 21-ый день – в 6,8 раз. 2.1.10. Результаты исследования цитотоксичности полученного бактериального альгината. Исследование цитотоксичности полученного бактериального альгината на культуре клеток (фибробластов) in vitro показало, что гидрогель на основе коммерческого водорослевого альгината обладает выраженной цитотоксичностью, в его присутствии рост фибробластов подавлен в несколько раз. Бактериальные же альгинаты значительно превосходят водорослевый по этому показателю, но наблюдаются различия между свободным и капсулярным его видами. Свободный бактериальный альгинат обладал хотя и меньшей, чем водорослевый, но довольно выраженной цитотоксичностью на всех сроках культивирования клеток (от 83% до 58%), тогда как для капсулярного альгината небольшая цитотоксичность (78%) проявилась лишь на 3-ьи сутки культивирования, на других сроках она не была статистически достоверна. 2.2. Заявка на патент. Уведомление о создании РИД «Биоинженерная конструкция на основе бактериального альгината и пробиотических бактерий и способ ее получения» № 24-2019 от 08.04.2019 г. Уведомление о создании РИД приведено в Приложении 1 к Дополнительным материалам к Отчету за 2-ой этап. 2.3. Публикации в рецензируемых российских и зарубежных научных изданиях, индексируемых в базах данных «Сеть науки» (Web of Science) и «Скопус» (Scopus). 1) Akoulina E., Dudun A., Bonartsev A., Bonartseva G., Voinova V. Effect of bacterial alginate on growth of mesenchymal stem cells. International Journal of Polymeric Materials and Polymeric Biomaterials, 2018, 68(1-3), 115-118, doi: 10.1080/00914037.2018.1525730. Scopus (SJR = 0.489), WoS (IF 2.127). 2) Bonartsev A.P., Zharkova I.I., Voinova V.V., Kuznetsova E.S., Zhuikov V.A., Makhina T.K., Myshkina V.L., Potashnikova D.M., Chesnokova D.V., Khaydapova D.D., Bonartseva G.A., Shaitan K.V. Poly(3-hydroxybutyrate)/poly(ethylene glycol) scaffolds with different microstructure: the effect on growth of mesenchymal stem cells. 3 Biotech, 2018, 8, 328, doi: 10.1007/s13205-018-1350-8. Scopus (SJR = 0.511), WoS (IF 1.497). 3) Zhuikov V., Rusakov A., Useinov A., Akulina E., Voinova V. Biodegradation of poly(3-Hydroxybutyrate) and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxy-4-methylvalerate) films by porcine pancreatic lipase. Key Engineering Materials, 2018, 779, 57-63, doi: 10.4028/www.scientific.net/KEM.779.57. Scopus (SJR = 0.18). 4) Бонарцев А.П., Бонарцева Г.А., Воинова В.В., Кирпичников М.П., Шайтан К.В. Лекарственные системы на основе поли-3-оксиалканоатов: их микро- и наноструктура. Вестник РГМУ (рубрика «Мнения», тематический номер «Наномедицина»), 2018, №6, 130-134 doi: 10.24075/vrgmu.2018.083. Более подробно материалы Отчета за 2-ой этап Проекта представлены в в файле с Дополнительными материалами к Отчету с полной его версией, содержащей рисунки, таблицы, полный список литературы на 102 стр. | ||
4 | 30 июня 2019 г.-30 июня 2020 г. | Разработка биоинженерного биофильма и исследование его эффективности для регенерации тканей стенки кишечника |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".