ИСТИНА

Многосубъединичная ДНК-зависимая РНК-полимераза (РНК-полимераза, РНКП) является ферментом, осуществляющим процесс транскрипции во всех живых организмах. Бактериальная РНКП является хорошей мишенью для действия антибиотиков. В настоящее время два специфичных ингибитора бактериальных РНКП используются в клинической практике как антибиотики - Рифампицин и Липиармицин (Фидаксомицин). Другие известные ингибиторы бактериальных РНКП, или их производные, также потенциально могут быть в будущем использованы в клинике в качестве антибиотиков. Данный проект посвящен изучению механизма действия специфического ингибитора бактериальной РНКП, антибиотика стрептолидигина. Стрептолидигин не ингибирует эукариотические РНКП, несмотря на то, что эукариотические РНКП имеют значительное структурное сходство с прокариотическими. Изучение механизма действия стрептолидигина представляет не только практический интерес с точки зрения разработки новых медицинских препаратов; но также и чисто фундаментальный интерес: так как стрептолидигин действует на активный центр фермента, его изучение полезно для фундаментального понимания механизма транскрипции. Ранее была получена кристаллическая структура комплекса стрептолидигина с Кор-ферментом РНКП T. thermophilus; а также с элонгационным комплексом РНКП T. thermophilus. Рентгеноструктурный анализ показал, что молекула антибиотика связывается вдоль F-мостовой спирали на расстоянии примерно 20 ангстрем от каталитических ионов магния активного центра, которые участвуют в механизме катализа всех реакций, осуществляемых РНКП. Структурный и биохимический анализ показал, что стрептолидигин при связывании замораживает подвижный домен активного центра, пусковую петлю, в прямой конформации. Ранее было показано, что пусковая петля необходима для осуществления катализа всех реакций, осуществляемых активным центром, таким образом объясняется ингибирование стрептолидигином каталитических реакций, осуществляемых РНКП. В связывании стрептолидигина в активном центре РНКП участвуют две крупнейшие субъединицы РНКП - B и B’. Сайт связывания стрептолидигина находится с «ДНК-стороны» F-мостовой спирали: стрептолольная часть молекулы стрептолидигина взаимодействует с доменом, который был назван STL1 (B538–552; здесь и далее нумерация по E. coli), а также с доменом STL2 (B557–576) и с N-концевойl частью F-мостовой спирали (B’769–788). А группы остатка тетрамовой кислоты стрептолидигина взаимодействуют с центральной частью F-мостовой спирали (B’789–795) и с упорядоченным сегментом пусковой петли. Ацетамидная группа остатка тетрамовой кислоты стрептолидигина и остаток аспарагиновой кислоты B’D792 F-мостовой спирали критичны для связывания стрептолидигина. В данной работе мы впервые показали, что для связывания стрептолидигина с РНК-полимеразой необходим некаталитический ион Mg2+, который образует комплекс с остатком аспарагиновой кислоты B’792 F-мостовой спирали активного центра фермента и с ацетамидной группой стрептолидигина. Различная чувствительность различных бактериальных РНК-полимераз к стрептолидигину может быть объяснена тем, что у некоторых организмов в этом положении вместо аспарагиновой кислоты находится аспарагин, который гораздо хуже координирует ион Mg2+. В данной работе впервые установлена роль некаталитических ионов Mg2+ в функционированиии РНК-полимеразы, и, на основе этого, предложены новые пути модификации существующих и разработки новых ингибиторов транскрипции.

Механизм воздействия стрептолидигина на активный центр РНКП был исследован с помощью искуственно собранных элонгационных комплексов (ECs). Эти комплексы были собраны с использованием РНКП Thermus aquaticus и полностью комплементарных друг другу искусственно синтезированных олигонуклеотидов матричной и нематричной ДНК, а также РНК. Мы анализировали кинетику присоединения нуклеотида в присутствии различных концентраций стрептолидигина в элонгационном комплексе EC1, который содержит цепь РНК длиной 13 нуклеотидов. Стрептолидигин был преинкубирован с EC в течение 10 минут, прежде чем инициировать реакцию добавлением нуклеотида (NTP) вместе с ионами Mg2+. При низких концентрациях стрептолидигина мы наблюдали очевидное разделение кинетической кривой на две фазы - быструю и медленную. При более высоких концентрациях стрептолидигина разделение на быструю и медленную фракции было менее очевидно, и кинетика может быть описана уравнением одиночной экспоненты. Далее мы проверили эффекты различных концентраций стрептолидигина на гидролиз фосфодиэфирной связи - реакции, которая также катализируется активным центром РНК-полимеразы. Как видно на рисунке 1, панель D, в данном случае в присутствии стрептолидигина также происходило разделение на чувствительную (медленную) и резистентную (быструю) фракции. Интересно, что концентрация стрептолидигина, которая требуется для ингибирования половины элонгационных комплексов для процесса гидролиза была примерно в 8 раз ниже, чем в процессе присоединения нуклеотида. Скорость гидролиза фосфодиэфирной связи значительно ниже скорости присоединения нуклеотида. Мы предположили, что после начала реакции, инициированной добавлением реагентов, стрептолидигину требуется время для того, чтобы проявить свою ингибиторную активность, что может объяснить более успешное ингибирование стрептолидигином медленной реакции гидролиза. Для того, чтобы проверить эту гипотезу мы анализировали ингибирование удлинения РНК мутантными РНК-полимеразами (B’H936A/R933A и B’M932A), у которых значительно снижена скорость образования фосфодиэфирной связи. Аминокислотные остатки B’H936/R933 пусковой петли участвуют в катализе синтеза фосфодиэфирной связи посредством стабилизирования переходного состояния реакции. Аминокислотный остаток B’M932 пусковой петли взаимодействует с основанием нуклеотида, присоединенного к активному центру во время реакции, и стабилизирует пусковую петлю в сложенной конформации, что требуется для катализа. Соответственно, замена на аланин либо аминокислотных остатков B’H936/R933, либо B’M932, резко снижает скорость присоединения нуклеотида, хотя и посредством различных механизмов. Ни один из этих аминокислотных остатков не участвует в связывании стрептолидигина. Мы предположили, что после добавления Mg2+ и нуклеотида, у стрептолидигина должно быть достаточно времени чтобы ингибировать элонгационные комплексы до того, как реакция начнется. Действительно, как показано на таблице 1, концентрация полуингибирования стрептолидигином присоединения нуклеотида мутантными РНК-полимеразами B’H936A/R933A и B’M932A была в 15-20 раз ниже, чем для РНК-полимеразы дикого типа. Так как известно, что данные мутации снижают скорости реакций посредством разных механизмов, результат позволяет предположить, что именно низкая скорость мутантных РНК-полимераз приводит к их чувствительности к стрептолидигину. Отметим также корреляцию между ингибиторным эффектом стрептолидигина и скоростями реакций. Вышеописанные результаты позволяют предположить, что процесс ингибирования стрептолидигином начинается только после добавления реагентов. Единственный общий компонент, который был добавлен для того, чтобы инициировать реакции присоединения нуклеотида и гидролиза фосфодиэфирной связи - это Mg2+. Мы выдвинули гипотезу, что Mg2+ необходим для связывания стрептолидигина с РНК-полимеразой. Согласно этому предположению, когда Mg2+ добавляется вместе с нуклеотидом, у стрептолидигина недостаточно времени для того, чтобы связаться со всеми элонгационными комплексами с РНК-полимеразой дикого типа до того, как реакция уже пройдет, таким образом и образуются быстрые и медленные фракции элонгационных комплексов. Согласно этой гипотезе можно предположить, что преинкубация элонгационных комплексов с Mg2+ и стрептолидигином перед добавлением нуклеотидов привело бы к более эффективному ингибированию. Для того, чтобы проверить это предположение мы преинкубировали элонгационные комплексы с РНК-полимеразой дикого типа со стрептолидигином и Mg2+ перед добавлением нуклеотида (такой же эксперимент невозможно провести для реакции гидролиза фосфодиэфирной связи, потому что добавление Mg2+ инициировало бы реакцию). Действительно, кинетика в присутствии даже небольших концентраций стрептолидигина может быть описано уравнением одиночной экспоненты. Соответственно, когда стрептолидигин преинубировали вместе с Mg2+, концентрация полуингибирования была в 15 раз ниже по сравнению с оной, когда Mg2+ добавлялся вместе с нуклеотидом. Поэтому мы сделали заключение, что связывание стрептолидигина с РНК-полимеразой требует ион Mg2+. Мы попытались напрямую визуализировать связывается ли Mg2+ со стрептолидигином. У стрептолидигина есть определенный спектр поглощения в УФ-области. Мы показали, что происходят четкие изменения в спектре стрептолидигина при титровании Mg2+. Вместе с описанными выше результатами это позволяет предположить, что стрептолидигин может хелировать Mg2+ и наблюдаемое изменение спектра стрептолидигина связяно с присоединением к нему иона Mg2+. Принципиальное открытие этой работы - это то, что требуется Mg2+ для того, чтобы стрептолидигин осуществил ингибирование РНК-полимеразы. В данной работе впервые показано, что для действия низкомолекулярного ингибитора РНК-полимеразы требуется дополнительный агент. Например, ингибитор Тагетитоксин также связывается в районе активного центра, и известно, что он хелирует Mg2+; но для его действия не требуется добавления Mg2+ извне, в то время, как кинетика добавления нуклеотида в присутствии тагетитоксина не похожа на соответствующую кинетику в присутствии стрептолидигина. Кажущееся сродство стрептолидигина к Mg2+, значение которого можно вывести из наших экспериментов по титрованию, составляет около 1mM, что близко к концентрации Mg2+ в бактериальной клетке. Однако похоже, что РНК-полимераза также имеет детерминанты связывания данного иона Mg2+. Стрептолидигин связывается слишком далеко от каталитических ионов магния активного центра, и непохоже, что они могут влиять на его действие. Однако, при внимательном изучении структуры элонгационного комплекса со связанным стрептолидигином можно обнаружить неиденцифицированную ранее область электронной плотности между гидроксилом остатка тетрамовой кислоты стрептолидигина и остатком аспарагиновой кислоты B’D792 F-мостовой спирали, которая может соответствовать Mg2+. Это наблюдение согласуется с тем фактом, что аналог стретолидигина тирандамицин, у которого отсутствует ацетамидная группа, является значительно более слабым ингибитором, чем стрептолидигин. Также, есть некоторые другие наблюдения, указывающие на важную роль остатка B’792 в связывании стрептолидигина. Мутация B’D792G приводит к резистентности к стрептолидигину. Более того, РНК-полимеразы, которые имеют аспарагиновую кислоту в позиции B’792 (включая РНК-полимеразы T. thermophilus и T. aquaticus) гораздо более чувствительны к стрептолидигину, чем РНК-полимеразы, которые имеют аспарагин в этой позиции (включая РНК-полимеразу E. coli). Кроме того, замена аспарагина на аспарагиновую кислоту (B’N792D) в РНК-полимеразе E. coli приводит к значительному возрастанию чувствительности фермента к стрептолидигину. Обобщая все эти факты, мы предполагаем, что посредством иона Mg2+ происходит соединение B’N792D и стрептолидигина, что приводит к тому, что стрептолидигин прочно связывается с ферментом. Этот факт также открывает новые горизонты в изучении роли некаталитических ионов Mg2+ в функционировании/ингибировании фермента.