| 1 |
1 января 2009 г.-31 декабря 2009 г. |
Изучение свойств и физиологической роли ингибиторов протеолитических ферментов различного происхождения |
| Результаты этапа: Изучение ингибиторов протеолитических ферментов, секретируемых мицелиальными грибами рода Trichoderma выявило различия в ингибирующей активности грибов разных видов.
Продолжались работы по разработке оптимальных условий выделения ингибитора коллагеназы из гепатопанкреаса камчатского краба.
Проводился анализ трансгенных растений табака и картофеля, полученных путем введения гена ингибитора сериновых протеиназ BWI-1a (ISP) из семян гречихи посредством агробактериальной трансформации листовых дисков. Все изученные ПЦР-положительные трансгенные растения демонстрировали в биотестах антибактериальную активность. Установлено, что наличие только одного гена ингибитора сериновых протеиназ обеспечивает достаточную защиту, по крайней мере, от двух бактериальных фитопатогенов: возбудителя бактериальной крапчатости томата Pseudomonas syringae pv. tomatoe и возбудителя бактериального рака томата Clavibacter michiganensis sbsp. michiganensis. Биотест, связанный с поражением бабочкой белокрылкой растений табака в теплице, также показал наличие защитного эффекта у трансгенных растений табака. Таким образом, в результате проведенной работы показана возможность получения устойчивых к бактериальным инфекциям и насекомым растений табака и картофеля путем введения только одного гена ингибитора сериновых протеиназ BWI-1a (ISP) из семян гречихи.
|
| 2 |
1 января 2010 г.-31 декабря 2010 г. |
Изучение свойств и физиологической роли ингибиторов протеолитических ферментов различного происхождения |
| Результаты этапа: Получены трансгенные растения арабидопсиса, содержащие встроенный ген ингибитора сериновых протеиназ BWI-1a из семян гречихи и проведено их сравнение с трансгенными растениями табака, содержащими тот же встроенный ген. Установлено, что ген ингибитора протеиназ BW1-1а из семян гречихи в течение длительного времени активно экспрессируется в тканях трансгенных растений табака и арабидопсиса, а также их семенного и вегетативного потомства и придает тканям трансгенных растений антибактериальную активность, свидетельствующую о синтезе функционального белка.
С целью установления пространственной структуры ингибитора сериновых протеиназ BW1-2с из семян гречихи методом гетероядерной спектроскопии ЯМР высокого разрешения на первом этапе работы был получен рекомбинантный аналог этого белка. Рекомбинантный белок получали путем экспрессии в клетках E. coli гена ингибитора BW1-2с из семян гречихи, синтезированного исходя из аминокислотной поледовательности этого белка.
С целью изучения взаимодействия изучаемых ингибиторов протеиназ из семян растений с протеиназами разнообразных патогенов из культурального фильтрата энтомопатогенного гриба Cordyceps militaris получена и очищена до электрофоретически гомогенного состояния новая секретируемая субтилизинподобная протеиназа. Изучены рН- и температурная зависимость активности фермента, а также его субстратная специфичность.
|
| 3 |
1 января 2011 г.-31 декабря 2011 г. |
Изучение свойств и физиологической роли ингибиторов протеолитических ферментов различного происхождения |
| Результаты этапа: Изучение ингибиторов протеолитических ферментов, секретируемых мицелиальными грибами рода Trichoderma выявило различия в ингибирующей активности грибов разных видов.
Продолжались работы по разработке оптимальных условий выделения ингибитора коллагеназы из гепатопанкреаса камчатского краба.
Проводился анализ трансгенных растений табака и картофеля, полученных путем введения гена ингибитора сериновых протеиназ BWI-1a (ISP) из семян гречихи посредством агробактериальной трансформации листовых дисков. Все изученные ПЦР-положительные трансгенные растения демонстрировали в биотестах антибактериальную активность. Установлено, что наличие только одного гена ингибитора сериновых протеиназ обеспечивает достаточную защиту, по крайней мере, от двух бактериальных фитопатогенов: возбудителя бактериальной крапчатости томата Pseudomonas syringae pv. tomatoe и возбудителя бактериального рака томата Clavibacter michiganensis sbsp. michiganensis. Биотест, связанный с поражением бабочкой белокрылкой растений табака в теплице, также показал наличие защитного эффекта у трансгенных растений табака. Таким образом, в результате проведенной работы показана возможность получения устойчивых к бактериальным инфекциям и насекомым растений табака и картофеля путем введения только одного гена ингибитора сериновых протеиназ BWI-1a (ISP) из семян гречихи.
Получены трансгенные растения арабидопсиса, содержащие встроенный ген ингибитора сериновых протеиназ BWI-1a (ISP) из семян гречихи и проведено их сравнение с трансгенными растениями табака, содержащими тот же встроенный ген. Установлено, что ген ингибитора протеиназ BW1-1а из семян гречихи в течение длительного времени активно экспрессируется в тканях трансгенных растений табака и арабидопсиса, а также их семенного и вегетативного потомства и придает тканям трансгенных растений антибактериальную активность, свидетельствующую о синтезе функционального белка.
С целью установления пространственной структуры ингибитора сериновых протеиназ BW1-2с из семян гречихи методом гетероядерной спектроскопии ЯМР высокого разрешения на первом этапе работы был получен рекомбинантный аналог этого белка. Рекомбинантный белок получали путем экспрессии в клетках E. coli гена ингибитора BW1-2с из семян гречихи, синтезированного исходя из аминокислотной поледовательности этого белка.
С целью изучения взаимодействия изучаемых ингибиторов протеиназ из семян растений с протеиназами разнообразных патогенов из культурального фильтрата энтомопатогенного гриба Cordyceps militaris получена и очищена до электрофоретически гомогенного состояния новая секретируемая субтилизинподобная протеиназа. Изучены рН- и температурная зависимость активности фермента, а также его субстратная специфичность.
Для повышения уровня экспрессии целевого гена ингибитора протеиназ BWI-1a из семян гречихи (ISP) в тканях трансгенных растений с помощью процедур молекулярного клонирования было создано 8 новых векторных конструкций с геном BWI-1a (ISP), несущих в качестве энхэнсера вставки фрагментов гена спидроина (белка паутины паука) в прямой и обратной ориентации и разном количестве. Четыре конструкции были введены в агробактериальные штаммы (A. tumefaciens pGV3810) и уже используются для трансформации ими растений табака.
Продолжение изучения антимикробной активности тканей трансгенных растений табака, несущих ген ингибитора протеиназ BWI-1a из семян гречихи (ISP) выявило их высокую активность по отношению к бактериям Pseudomonas syringae, Erwinia carotovora, Clavibacter michiganensis, Agrobacterium rhizogenes A4, Xanthomonas campestris. Показано сохранение трансгенной вставки и функциональной активности целевого гена в длительно поддерживаемых асептических растениях и каллусных культурах табака. Установлено, что препарат ингибитора BWI-2c из семян гречихи эффективно подавлял рост бактерий A. rhizogenes и Ps. syringae, что может указывать на его возможную защитную функцию по отношению к патогенным микроорганизмам.
Методом гетероядерной спектроскопии ЯМР высокого разрешения изучена пространственная структура ингибитора протеиназ BWI-2c из семян гречихи. Установлено, что структура ингибитора представляет собой α-спиральную шпильку, стабилизированную двумя дисульфидными связями и солевым мостом. Реактивный центр ингибитора расположен в петле, соединяющей две спирали.
|
