ИСТИНА

Разработка метода и макета набора для определения концентрации окисленной формы никотинамиадениндинуклеотида НАД+ в организме в норме и патологии

Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) is a major coenzyme responsible for several thousand reactions in the body. The reaction of reducing the oxidized form of NAD+ to reduced NADH is the main source of energy in the body. Three molecules of ATP are then formed from one NADH molecule, which is also widely used to maintain the body's homeostasis. Current data indicate that with aging and the occurrence of pathologies in the body, the level of NAD+ in the body decreases. Therefore, the development and implementation of a method for determining NAD+ in various tissues, including blood, is fully consistent with the policy of the Russian Government Party on the development of technologies and the implementation of methods for personalized medicine Study design For quantitative determination of NAD+ it is necessary to use a biochemical reaction that a) provides specific reduction of NAD+ to NADH b) this reaction should be irreversible for quantitative conversion of the coenzyme from the oxidized to the reduced form c) involves the use of a highly sensitive method for detecting NADH Currently, more than 25 FDGs have been isolated and characterized from various sources, but wild-type enzymes do not fully meet the optimal conditions for assay performance, since for practical use, the enzyme must be highly stable both during storage and use. It is known that there are a large number of proteases in the blood and other tissues that can inactivate the enzyme. Also, the enzyme must have high temperature stability for its storage at a temperature of +4 °C (The FDG from Candida boidinii yeast currently used by Evonik (former Degussa) is stored in 50% glycerol at -20 °C. For rapid analysis, the enzyme must have low Michaelis constants. Natural enzymes do not meet all of the above requirements. Therefore, when implementing the project, a bioinformatics search for FDG with properties closest to the required ones will be performed, and then, using protein engineering methods, the enzyme properties will be optimized to meet the analysis requirements. Another critical point for the use of FDG is the cost of its production. Even the use of methanol-utilizing microorganisms does not allow obtaining an enzyme with a low cost. To obtain a cheap FDG drug, a recombinant strain of E. coli will be created - a superproducer of the target enzyme. For this, the gene structure, expression system and cultivation conditions will be optimized. In preparative cultivation in a fermenter, approaches to obtaining a high-density cell culture will be used. Obtaining thermostable FDG will allow creating a process of isolation and purification without chromatographic stages. All this, according to our calculations, will allow obtaining an enzyme with a cost 10 times lower than FDG preparations available on the market.

- Анализ литературы, выбор фермента со свойствами наиболее близкими для проведения анализа. Оптимизация свойств биокатализатора под задачи анализа: повышение температурной и операционной стабильности, улучшение его каталитических параметров как с НАД+, так и со вторым субстратом формиатом - Создание рекомбинантного штамма – суперпродуцента фермента для проведения определения НАД+ в биологических образцах - Создание процесса культивирования штамма-продуцента и разработка метода препаративного получения биокатализатора - оптимизация условий проведения анализа

Коллектив исполнителей обладает всеми компетенциями и знаниями для успешного выполнения проекта. Исполнители являются признанными специалистами в области биоинформатики, структурной биологии (депонировано более 15 структур белков), компьютерного моделирования биологических молекул, клонирование генов, высоэффективная экспрессия рекомбинантных белков, белковая инженерия с помощью рационального дизайна. У коллектива авторов имеется основное оборудование для проведения работ на первых этапах. Для выполнения работ на последних этапах из средств проекта будет закуплено дополнительное оборудование (ферментеры, плашечный спектрофлуориметр). Подтверждением высокой квалификации исполнителей являются их публикации в высокорейтинговых журналах (12 в Q1 за последние 5 лет) и патенты РФ (всего 22, 3 в 2023 и 2024 гг.)

1.Рекомбинантная формиатдегидрогеназа с повышенной температурной и операционной стабильностью, с улучшенными каталитическими параметрами как с НАД+, так и со вторым субстратом формиатом 2.Рекомбинантный штамм E.coli - суперпродуцент рекомбинантной формиатдеигдрогеназы 3. Процесс культивирования штамма-суперпродуцента и метод препаративного получения фермента 4. Оптимизированные условия проведения реакции восстановления НАД+ в НАДН