| Результаты этапа: Мы обнаружили, что при стимуляции часть МСК сохранялась в исходном (базальном) состоянии. В клетках этого кластера повышена экспрессия генов, связанных с окислительным фосфорилированием и синтезом АТФ, а также кодирующих рибосомальные белки, что указывает на их высокую синтетическую активность и активный аэробный метаболизм. В каждой из интегрированных пар массивов выявлялись кластеры, характерные для соответствующего направления дифференцировки. С помощью анализ “траекторий развития” мы впервые обнаружили, что во всех трех парах массивов присутствовал кластер, в который клетки переходили из базального состояния, и в котором происходило дальнейшее разветвление траекторий дифференцировки. Мы установили, что кластер клеток в инициированном состоянии совпадал у всех трех пар массивов. Таким образом, в каждом из проанализированных направлений дифференцировки происходит формирование кластера, в который МСК переходят из базального состояния, и именно в этом кластере происходит разделение дальнейших траекторий развития, что подтверждает нашу гипотезу о том, что дифференцировку МСК предваряет приобретение этими клетками особого состояния “инициации”, в котором они совершают дальнейшее коммитирование в том или ином направлении дифференцировки.. Для выявления инициированного состояния МСК in vivo мы отработали методику локальной симпатической денервации одного из парных жировых депо мыши. Наилучшие результаты показало локальное введение гуанетидина в одно из парных эпидидимальных жировых депо после вскрытия брюшной полости. У этих животных в контрольных депо выявлялись симпатические волокна, а в депо, куда вводили гуанетидин, в ткани окрашивались лишь отдельные точки, не выстроенные в цельные волокна.
На данном этапе выполнения проекта мы проанализировали влияние таких цАМФ-мобилизующих гормонов, как норадреналин, серотонин или ПТГ, на повышение уровня внутриклеточного Ca2+ в МСК жировой ткани под влиянием аденозина, норадреналина, серотонина, дофамина, гистамина, ангиотензина II, ПТГ, ГАМК и глутамат (Ca-мобилизующий сигнал). Норадреналин вызывал повышение доли клеток, отвечающих повышением концентрации Са2+ в цитоплазме на аденозин, ПТГ и ангиотензин II. ПТГ приводил к увеличению доли клеток, отвечающих повышением концентрации Са2+ в цитоплазме, на аденозин, ГАМК и ПТГ. Серотонин вызывал увеличение доли МСК, отвечающих повышением концентрации Са2+ в цитоплазме на норадреналин и ПТГ. Последовательная стимуляция МСК норадреналином и затем ангиотензином II, вызывала повышение экспрессии мРНК адипонектина. Преинкубация МСК с норадреналином с последующей обработкой клеток аденозином, напротив, привела к снижению экспрессии маркеров адипогенной дифференцировки. Последовательная стимуляция МСК норадреналином и затем ПТГ, не влияла на экспрессию мРНК адипонектина. Для повышения точности и воспроизводимости количественного анализа результатов адипогенной дифференцировки нами был разработан алгоритм подсчета доли клеток с липидными каплями с применением моделей глубокого обучения. Разработанные алгоритмы обеспечивают эффективный и воспроизводимый анализ адипогенной дифференцировки МСК, в том числе прижизненный.
Мы впервые в России разработали собственные подходы по аннотации клеточных типов в образцах scRNAseq с применением искусственного интеллекта. Мы использовали архитектуру трансформер (pytorch-tabnet) для создания собственного инструмента – scAdam. При помощи пакетов scanpy, anndata, pytorch, pandas, numpy и scipy мы адаптировали tabnet для работы с форматом anndata, характерным для датасетов scRNA-seq в языке программирования Python. Мы сравнили инструмент scAdam c 7 другими методами автоматической аннотации клеточных типов: CellTypist, scGPT, TOSICA, Azimuth, Symphony, Scanvi и Seurat на 4 массивах данных и установили, что модели scAdam превосходят другие методы автоматической аннотации по сбалансированной точности. Используя разработанные подходы мы выявили семь функционально различных подтипов зрелых адипоцитов (N = 24056 клеток) в массивах данных транскриптомов одиночных ядер клеток подкожной жировой ткани, названные scAd1-7 (subcutaneous Adipocyte). Эти данные существенно расширяют существующие представления о физиологии жировой ткани.
На данном этапе проекта мы впервые обнаружили, что в МСК из надкостницы по сравнению с МСК жировой ткани выше уровень экспрессии проостеогенных SATB2, HOXA10, RUNX2 и CREB5. При этом в МСК жировой ткани выше уровень экспрессии антиостеогенного траскрипционного фактора TWIST2. При воздействии ПТГ на МСК из надкостницы происходит повышение экспрессии регуляторов остеогенеза RUNX2, SATB2, KAT6A, CREB1, SATB2 и KAT6B. Воздействие ПГТ на МСК жировой ткани приводит к снижению экспрессии как активаторов (WWTR1, SMAD1), так и ингибиторов остеогенеза (TWIST2). Мы показали, что контрольные МСК жировой ткани и надкостницы существенно различаются по активности ингибиторов остеогенеза (STAT1 и TWIST2). При воздействии ПТГ на МСК жировой ткани повышается активность проостеогенного DLX3 и падает активность активатора остеогенеза SMAD5. ПТГ в МСК жировой ткани снижает активность ингибиторов остеогенеза (STAT1 и TWIST2). При этом ПТГ не влияет на активность транскрипционных регуляторов остеогенеза на МСК надкостницы.
На модели неконтактного сокультивирования мы показали, что МСК, предварительно обработанные ПТГ стимулируют остеогенную дифференцировку МСК, которым не добавляли этот гормон.
С целью выбора линии-продуцента для последующего анализа влияния ПТГ на способность секретома МСК стимулировать остеогенную дифференцировку мы сравнили секреторную активность 3 линий иммортализованных МСК и выбрали линю МСК, секретом которых обладал наибольшей способностью стимулировать остеогенез.
Для оценки влияния ПТГ на продукцию белковых факторов, регулирующих остеогенез, мы наработали кондиционированную среду МСК выбранной линии-продуцента, из которой подготовили образцы пептидов для проведения протеомного анализа на следующем этапе проекта. 8. Нами была протестирована кинетика набухания и высвобождения секретома МСК гидрогелей, напечатанных в виде стандартной сетки 1×1 см из образцов с концентрацией коллагена 2%, 4% и 7%. Мы установили, что в качестве носителя секретома оптимальной является комбинация 4% концентрации коллагена и низкотемпературная заморозка, что позволяет сохранить макроструктуру и контролируемое набухание. Протестированные гидрогели не влияли на морфологию и жизнеспособность культивируемых фибробластов человека.
|
