ИСТИНА

Содержание внутриклеточного АТФ является основным индикатором жизнеспособности клеток и их энергетического статуса. Наиболее чувствительным, быстрым и специфичным является метод биолюминесцентной АТФ-метрии. Однако, суспензии микроорганизмов могут содержать внеклеточный (или свободный) АТФ и внутриклеточный АТФ, который не доступен для люциферазы, поскольку фермент не проникает через мембрану внутрь клеток. Таким образом, для правильного определения внутриклеточного АТФ необходимо: 1) разрушить свободный АТФ, 2) высвободить внутриклеточный АТФ и перевести его в раствор – этот процесс принято называть экстракцией внутриклеточного АТФ. Для разрушения свободного АТФ наиболее щадящим и быстрым методом является кратковременная (15-20 мин) инкубация образца с добавкой раствора фермента, быстро разрушающего АТФ. В качестве такого фермента широко используется АТФаза из клубней картофеля – апираза. При такой обработке образца клетки микроорганизмов остаются интактными, в которых затем и определяется внутриклеточный АТФ методом биолюминесцентной АТФ-метрии. Метод основан на лизисе анализируемых клеток органическим растворителем, получении экстракта клеток и последующем измерении на люминометре ЛЮМ-1 интенсивности биолюминесценции, которая возникает при добавлении определенного объема экстракта к раствору АТФ-реагента (смесь фермента люциферазы светляков, субстрата люциферина, компонентов буферного раствора и стабилизаторов). Измерение биолюминесценции занимает 1-2 мин. Удаление примесного внеклеточного АТФ позволит снизить предел обнаружения АТФ и улучшить тем самым аналитические характеристики метода. Изучены физико-химические и биотехнологические свойства апиразы и найдены оптимальные условия ее применения для удаления внеклеточного АТФ, разработана методика использования апиразы для удаления свободного АТФ из культуральных жидкостей и клеточных суспензий на примере клеток E.coli Для измерения интенсивности биолюминесценции использован высокочувствительный люминометр ЛЮМ-1, имеющий связь с компьютером для регистрации и обработки результатов измерений. Время анализа - не более 15-20 мин, включая инкубацию образца Научно-техническая и практическая ценность работы Улучшены аналитические характеристики метода биолюминесцентной АТФ-метрии для анализа клеточных суспензий, а также снижена трудоемкость анализа. Метод востребован в санитарной микробиологии, пищевой, медицинской, фармацевтической промышленностях, биотехнологии, ветеринарии, научной деятельности и пр.

Разработана и оптимизирована методика удаления свободного АТФ из культуральных жидкостей и клеточных суспензий апиразой картофеля. Изучены физико-химические и биотехнологические свойства апиразы, найдены оптимальные условия ее применения. Разработана методика определения внутриклеточного АТФ биолюминесцентным методом, включающая следующие стадии анализа: удаление свободного АТФ апиразой, разрушение клеток диметилсульфоксидом и детекция АТФ в полученном экстракте. Концентрация внутриклеточного АТФ (на примере клеточной культуры E.coli штамм LE392) составила 2*10-18 М. Показана эффективность применения апиразы в биолюминесцентном анализе клеточных суспензий для удаления внеклеточного АТФ, что позволило получить хорошую корреляцию между количеством живых клеток и содержанием внутриклеточного АТФ, улучшить аналитические характеристики метода и значительно снизить трудоемкость анализа.