ИСТИНА

Проект направлен на разработку научных основ экологически обоснованной технологии применения новых высокоэффективных биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов и клеток микроорганизмов для биоразложения и биомониторинга миграции таких поллютантов, как фосфорорганические соединения (пестициды и продукты разложения отравляющих веществ в виде метилфосфоновой кислоты и ее эфиров) в загрязненных почвах различных климатических зон с разными физико-химическими характеристиками. Данный проект предполагает использование оригинального подхода, основанного на применении биодеструкторов (ферментов и микроорганизмов) в иммобилизованной форме, обеспечивающей их повышенную стабильность к негативному воздействию экотоксикантов, являющихся для них субстратами и/или продуктами реакций, катализируемых ими, в сравнении с их свободными формами. Основными фундаментальными задачами, на решение которых будет направлен проект, являются: 1) разработка научно-обоснованных подходов к созданию биокаталитических систем на основе иммобилизованных ферментов и клеток разных микроорганизмов, характеризующихся высокой каталитической и метаболической активностью, операционной стабильностью и позволяющих решать вопросы биоремидиации почв, загрязненных фосфорорганическими пестицидами и продуктами химической деградации фосфорорганических отравляющих веществ; 2) разработка теоретических основ экологически безопасной и эффективной технологии применения иммобилизованных биокатализаторов на основе ферментов и клеток различных микроорганизмов для биовосстановления почв, загрязненных фосфорорганическими соединениями; 3) разработка научных основ стратегии применения иммобилизованного биокатализатора на основе светящихся бактерий для биомониторинга процесса разложения фосфорорганических соединений и миграции данных поллютантов в почвах различных климатических зон; 4) разработка научной концепции пролонгированного биомониторинга присутствия фосфорорганических пестицидов в почве с помощью иммобилизованных биокатализаторов на основе гибридного фермента со свойствами рН-чувствительного флюоресцентного белка и органофосфатгидролазы; 5) выяснение основных закономерностей функционирования агрофитоценозов в почвах различных климатических зон, исходно содержащих фосфорорганические поллютанты и прошедших комплексную обработку, согласно разработанной технологии, комбинирующей применение иммобилизованных биокаталитических систем на основе ферментов и клеток разных микроорганизмов; 6) проведение исследований, направленных на оптимизацию физико-химических и эксплуатационных характеристик матриц на основе ряда синтетических и природных полимеров, которые будут использованы в качестве носителей иммобилизованных ферментов и клеток, в свою очередь способных к детоксикации или обнаружению (в составе соответствующих сенсорных систем) фосфорорганических поллютантов; 7) разработка таких носителей иммобилизованных биокатализаторов, которые могли бы совмещать функции как собственно носителей для иммобилизации клеток или ферментов, так и структураторов почв. Ожидается, что по окончании проекта в результате решения поставленных фундаментальных задач будут: разработаны новые иммобилизованные биокатализаторы на основе рекомбинантных ферментов, осуществляющих эффективный гидролиз пестицидов, метилфосфоновой кислоты и ее моно- и диэфиров, а также клеток-деструкторов фосфорсодержащих пестицидов и продуктов разложения таких веществ с помощью рационального выбора носителей и способов для иммобилизации ферментов и клеток; проведено обобщение экспериментальных результатов и теоретического анализа зависимости свойств нано- и микробиокатализаторов, которые будут разработаны в проекте, от разных факторов (физиологических особенностей клеток, оптимальных условий функционирования ферментов и т.д.) для решения проблем ремедиации почв; обеспечено гарантированное сохранение максимальной активности ферментов и, соответственно, жизнеспособности и метаболической активности клеток и микроорганизмов-биодеструкторов в иммобилизованном виде; определены технологические режимы применения вводимых в почвы иммобилизованных биокатализаторов и результативность их действия при использовании разных носителей для иммобилизации ферментов и клеток, влияющих на скорость их постепенного перехода в свободную форму из матрицы или, наоборот, в отсутствие выхода биообъектов из объема носителя; дана оценка эффективности действия разработанных иммобилизованных биокатализаторов в процессах деградации фосфорсодержащих соединений в условиях почв с различными физико-механическими и физико-химическими характеристиками при проведении их предварительной подготовки к биоремедиации (защелачивание, подкисление, обогащение питательными компонентами и др.) и без ее применения; определены условия организации биомониторинга миграции и биоразложения фосфорорганических поллютантов в почвах разных климатических зон с использованием иммобилизованного биокатализатора на основе клеток фотобактерий и принципиально нового иммобилизованного нанобиокатализатора на основе гибридных белков с активностью органофосфатгидролазы, катализирующей гидролиз широкого спектра фосфорорганических субстратов, и флуоресцентного белка с рН-чувствительной флуоресценцией; адаптированы ранее разработанные авторами макропористые носители (так называемые, полимерные криогели) иммобилизованных ферментов или клеток к тем требованиям, которые предъявляются к этим системам конкретными задачами данного проекта, а также проведена целенаправленная разработка новых вариантов таких носителей с набором характеристик, отвечающих указанным требованиям; проведены углубленные физико-химические и структурные исследования носителей иммобилизованных ферментов и клеток с целью нахождения корреляций «структура-свойства-функциональность», необходимых для прогнозирования применимости соответствующих иммобилизованных биокатазаторов в почвенных системах; разработаны технологии длительного применения стабильного иммобилизованного биокатализатора на основе клеток светящихся бактерий для контроля уровня экотоксичности продуктов, образующихся при биообработке почв с помощью вновь разработанных иммобилизованных биокатализаторов-деструкторов, а также динамики процесса биодеструкции фосфорорганических соединений; разработана научно-техническая документация (лабораторные регламенты на получение соответствующих иммобилизованных биокатализаторов, созданных в рамках проекта биокаталитических систем, а также на процессы, предусматривающие применение указанных систем), осуществлена подготовка и подача патентных заявок на выполненные новые разработки, подготовка научных публикаций. Все иммобилизованные биокатализаторы, которые планируется разработать, изучить и применить в проекте для биоразложения и биомониторинга фосфорсодержащих соединений (пестицидах и продуктов разложения отравляющих веществ, а именно, метилфосфоновой кислоты и ее эфиров) в почвах, являются абсолютно новыми. Запланированные научные исследования обладают несомненной патентной чистотой, а ожидаемые результаты – патентоспособностью.

Впервые в проекте было установлено, что клетки Rhodococcus ruber Ac-1413 способны разлагать не только продукты гидролиза фосфорорганических соединений, но и исходные вещества. Каталитические характеристики этих клеток в отношении Параоксона были исследованным впервые. На основе анализа геномов разных штаммов бактерий рода Rhodococcus, имеющихся в соответствующих базах данных, было теоретически обосновано наличие в клетках Rhodococcus ruber Ac-1413 фермента, по своим характеристикам и строению активного центра аналогичного органофосфатгидролазе, и установлена его локализация в клеточной стенке клеток Rhodococcus. Было разработано четыре лабораторных технологических регламента на получение биокатализаторов на основе иммобилизованных фермента и различных клеток микроорганизмов. На основе этой научно-технической документации были наработаны укрупнённые партии иммобилизованных биокатализаторов, разработанных на 1-ом году выполнения проекта, общей массой свыше 30 кг. Каждая партия, подтвержденная актом наработки, была охарактеризована и использовалась в дальнейших экспериментах. Были определены оптимальные условия функционирования разработанных нано- и микробиокатализаторов на основе фермента с органофосфатгидролазной активностью, а также клеток Pseudomonas sp.78Г, Rhodococcus ruber Ас-1413 и Aspegrillus niger F-679 в различных по химическому составу почвах, загрязненных фосфорорганическими пестицидами (паратионом, параоксоном, метилпаратионом, хлорпирифосом), их продуктами разложения или продуктами разложения отравляющих веществ (3,5,6-трихлор-2-пиридинол и метилфосфоновая кислота). Были определены функциональные характеристики нового биокатализатора на основе иммобилизованных клеток светящихся бактерий в условиях его использования для эффективного биомониторинга процесса разложения фосфорорганических соединений (ФОС) (пестицидов и продуктов разложения фосфорорганических отравляющих веществ) в почвах с различными физико-химическими характеристиками. В результате была создана методика применения нового биокатализатора, суммирующая информацию, необходимую для экологического мониторинга процесса разложения и миграции фосфорорганических соединений в почвах. С использованием биокатализатора на основе иммобилизованного гибридного белка со свойствами рН-чувствительного флуоресцентного зелёного белка и фермента органофосфатгидролазы была разработана функциональная система для проведения пролонгированного биомониторинга присутствия фосфорорганических пестицидов в почве. Были проведены исследования, в ходе которых были определены условия и основные приёмы комбинирования разработанных биокатализаторов на основе иммобилизованных фермента, гидролизующего разные фосфорорганические соединения, и клетки, осуществляющие разложение продуктов ферментативного гидролиза, для их совместного эффективного функционирования в процессах комплексной биоремедиации почв. Установлена необходимость использования ферментного биокатализатора совместно с биокатализатором на основе мицелиального гриба Aspegrillus niger F-679. В то же время показано, что биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток Pseudomonas sp.78Г и Rhodococcus ruber Ас-1413 могут применяться для разложения фосфорорганических соединений в почве без предварительной ферментативной обработки. Было исследовано функционирование фитоценозов в образцах почв, прошедших комплексную обработку, комбинирующую применение иммобилизованных биокаталитических систем на основе ферментов и клеток разных микроорганизмов (бактерий и мицелиальных грибов), с целью элиминирования фосфорорганических соединений. Установлено положительное влияние биокаталитической деградации фосфорорганических соединений на почвенные микроорганизмы и значительное снижение содержания пестицидов в растениях, произрастающих на почвогрунте с введенными в него высокими концентрациями различных ФОС. По итогам проделанной работы подготовлена и подана заявка на Патент РФ на изобретение.