ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Проект направлен на разработку научных основ экологически обоснованной технологии применения новых высокоэффективных биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов и клеток микроорганизмов для биоразложения и биомониторинга миграции таких поллютантов, как фосфорорганические соединения (пестициды и продукты разложения отравляющих веществ в виде метилфосфоновой кислоты и ее эфиров) в загрязненных почвах различных климатических зон с разными физико-химическими характеристиками. Данный проект предполагает использование оригинального подхода, основанного на применении биодеструкторов (ферментов и микроорганизмов) в иммобилизованной форме, обеспечивающей их повышенную стабильность к негативному воздействию экотоксикантов, являющихся для них субстратами и/или продуктами реакций, катализируемых ими, в сравнении с их свободными формами. Основными фундаментальными задачами, на решение которых будет направлен проект, являются: 1) разработка научно-обоснованных подходов к созданию биокаталитических систем на основе иммобилизованных ферментов и клеток разных микроорганизмов, характеризующихся высокой каталитической и метаболической активностью, операционной стабильностью и позволяющих решать вопросы биоремидиации почв, загрязненных фосфорорганическими пестицидами и продуктами химической деградации фосфорорганических отравляющих веществ; 2) разработка теоретических основ экологически безопасной и эффективной технологии применения иммобилизованных биокатализаторов на основе ферментов и клеток различных микроорганизмов для биовосстановления почв, загрязненных фосфорорганическими соединениями; 3) разработка научных основ стратегии применения иммобилизованного биокатализатора на основе светящихся бактерий для биомониторинга процесса разложения фосфорорганических соединений и миграции данных поллютантов в почвах различных климатических зон; 4) разработка научной концепции пролонгированного биомониторинга присутствия фосфорорганических пестицидов в почве с помощью иммобилизованных биокатализаторов на основе гибридного фермента со свойствами рН-чувствительного флюоресцентного белка и органофосфатгидролазы; 5) выяснение основных закономерностей функционирования агрофитоценозов в почвах различных климатических зон, исходно содержащих фосфорорганические поллютанты и прошедших комплексную обработку, согласно разработанной технологии, комбинирующей применение иммобилизованных биокаталитических систем на основе ферментов и клеток разных микроорганизмов; 6) проведение исследований, направленных на оптимизацию физико-химических и эксплуатационных характеристик матриц на основе ряда синтетических и природных полимеров, которые будут использованы в качестве носителей иммобилизованных ферментов и клеток, в свою очередь способных к детоксикации или обнаружению (в составе соответствующих сенсорных систем) фосфорорганических поллютантов; 7) разработка таких носителей иммобилизованных биокатализаторов, которые могли бы совмещать функции как собственно носителей для иммобилизации клеток или ферментов, так и структураторов почв. Ожидается, что по окончании проекта в результате решения поставленных фундаментальных задач будут: разработаны новые иммобилизованные биокатализаторы на основе рекомбинантных ферментов, осуществляющих эффективный гидролиз пестицидов, метилфосфоновой кислоты и ее моно- и диэфиров, а также клеток-деструкторов фосфорсодержащих пестицидов и продуктов разложения таких веществ с помощью рационального выбора носителей и способов для иммобилизации ферментов и клеток; проведено обобщение экспериментальных результатов и теоретического анализа зависимости свойств нано- и микробиокатализаторов, которые будут разработаны в проекте, от разных факторов (физиологических особенностей клеток, оптимальных условий функционирования ферментов и т.д.) для решения проблем ремедиации почв; обеспечено гарантированное сохранение максимальной активности ферментов и, соответственно, жизнеспособности и метаболической активности клеток и микроорганизмов-биодеструкторов в иммобилизованном виде; определены технологические режимы применения вводимых в почвы иммобилизованных биокатализаторов и результативность их действия при использовании разных носителей для иммобилизации ферментов и клеток, влияющих на скорость их постепенного перехода в свободную форму из матрицы или, наоборот, в отсутствие выхода биообъектов из объема носителя; дана оценка эффективности действия разработанных иммобилизованных биокатализаторов в процессах деградации фосфорсодержащих соединений в условиях почв с различными физико-механическими и физико-химическими характеристиками при проведении их предварительной подготовки к биоремедиации (защелачивание, подкисление, обогащение питательными компонентами и др.) и без ее применения; определены условия организации биомониторинга миграции и биоразложения фосфорорганических поллютантов в почвах разных климатических зон с использованием иммобилизованного биокатализатора на основе клеток фотобактерий и принципиально нового иммобилизованного нанобиокатализатора на основе гибридных белков с активностью органофосфатгидролазы, катализирующей гидролиз широкого спектра фосфорорганических субстратов, и флуоресцентного белка с рН-чувствительной флуоресценцией; адаптированы ранее разработанные авторами макропористые носители (так называемые, полимерные криогели) иммобилизованных ферментов или клеток к тем требованиям, которые предъявляются к этим системам конкретными задачами данного проекта, а также проведена целенаправленная разработка новых вариантов таких носителей с набором характеристик, отвечающих указанным требованиям; проведены углубленные физико-химические и структурные исследования носителей иммобилизованных ферментов и клеток с целью нахождения корреляций «структура-свойства-функциональность», необходимых для прогнозирования применимости соответствующих иммобилизованных биокатазаторов в почвенных системах; разработаны технологии длительного применения стабильного иммобилизованного биокатализатора на основе клеток светящихся бактерий для контроля уровня экотоксичности продуктов, образующихся при биообработке почв с помощью вновь разработанных иммобилизованных биокатализаторов-деструкторов, а также динамики процесса биодеструкции фосфорорганических соединений; разработана научно-техническая документация (лабораторные регламенты на получение соответствующих иммобилизованных биокатализаторов, созданных в рамках проекта биокаталитических систем, а также на процессы, предусматривающие применение указанных систем), осуществлена подготовка и подача патентных заявок на выполненные новые разработки, подготовка научных публикаций. Все иммобилизованные биокатализаторы, которые планируется разработать, изучить и применить в проекте для биоразложения и биомониторинга фосфорсодержащих соединений (пестицидах и продуктов разложения отравляющих веществ, а именно, метилфосфоновой кислоты и ее эфиров) в почвах, являются абсолютно новыми. Запланированные научные исследования обладают несомненной патентной чистотой, а ожидаемые результаты – патентоспособностью.
Впервые в проекте было установлено, что клетки Rhodococcus ruber Ac-1413 способны разлагать не только продукты гидролиза фосфорорганических соединений, но и исходные вещества. Каталитические характеристики этих клеток в отношении Параоксона были исследованным впервые. На основе анализа геномов разных штаммов бактерий рода Rhodococcus, имеющихся в соответствующих базах данных, было теоретически обосновано наличие в клетках Rhodococcus ruber Ac-1413 фермента, по своим характеристикам и строению активного центра аналогичного органофосфатгидролазе, и установлена его локализация в клеточной стенке клеток Rhodococcus. Было разработано четыре лабораторных технологических регламента на получение биокатализаторов на основе иммобилизованных фермента и различных клеток микроорганизмов. На основе этой научно-технической документации были наработаны укрупнённые партии иммобилизованных биокатализаторов, разработанных на 1-ом году выполнения проекта, общей массой свыше 30 кг. Каждая партия, подтвержденная актом наработки, была охарактеризована и использовалась в дальнейших экспериментах. Были определены оптимальные условия функционирования разработанных нано- и микробиокатализаторов на основе фермента с органофосфатгидролазной активностью, а также клеток Pseudomonas sp.78Г, Rhodococcus ruber Ас-1413 и Aspegrillus niger F-679 в различных по химическому составу почвах, загрязненных фосфорорганическими пестицидами (паратионом, параоксоном, метилпаратионом, хлорпирифосом), их продуктами разложения или продуктами разложения отравляющих веществ (3,5,6-трихлор-2-пиридинол и метилфосфоновая кислота). Были определены функциональные характеристики нового биокатализатора на основе иммобилизованных клеток светящихся бактерий в условиях его использования для эффективного биомониторинга процесса разложения фосфорорганических соединений (ФОС) (пестицидов и продуктов разложения фосфорорганических отравляющих веществ) в почвах с различными физико-химическими характеристиками. В результате была создана методика применения нового биокатализатора, суммирующая информацию, необходимую для экологического мониторинга процесса разложения и миграции фосфорорганических соединений в почвах. С использованием биокатализатора на основе иммобилизованного гибридного белка со свойствами рН-чувствительного флуоресцентного зелёного белка и фермента органофосфатгидролазы была разработана функциональная система для проведения пролонгированного биомониторинга присутствия фосфорорганических пестицидов в почве. Были проведены исследования, в ходе которых были определены условия и основные приёмы комбинирования разработанных биокатализаторов на основе иммобилизованных фермента, гидролизующего разные фосфорорганические соединения, и клетки, осуществляющие разложение продуктов ферментативного гидролиза, для их совместного эффективного функционирования в процессах комплексной биоремедиации почв. Установлена необходимость использования ферментного биокатализатора совместно с биокатализатором на основе мицелиального гриба Aspegrillus niger F-679. В то же время показано, что биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток Pseudomonas sp.78Г и Rhodococcus ruber Ас-1413 могут применяться для разложения фосфорорганических соединений в почве без предварительной ферментативной обработки. Было исследовано функционирование фитоценозов в образцах почв, прошедших комплексную обработку, комбинирующую применение иммобилизованных биокаталитических систем на основе ферментов и клеток разных микроорганизмов (бактерий и мицелиальных грибов), с целью элиминирования фосфорорганических соединений. Установлено положительное влияние биокаталитической деградации фосфорорганических соединений на почвенные микроорганизмы и значительное снижение содержания пестицидов в растениях, произрастающих на почвогрунте с введенными в него высокими концентрациями различных ФОС. По итогам проделанной работы подготовлена и подана заявка на Патент РФ на изобретение.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2009 г.-31 декабря 2009 г. | Биоремедиация почв, загрязненных фосфорорганическими соединениями, основанная на применении иммобилизованных нано- и микробиокатализаторов |
Результаты этапа: Впервые получены гетерогенные иммобилизованные биокатализаторы на основе различных рекомбинантных белков с активностью фермента органофосфатгидролазы, и носителя в виде делигнифицированного целлюлозосодержащего сырья (опилки, рисовая солома), способных осуществлять гидролиз фосфорорганических пестицидов (хлорпирифоса, паратиона, метилпаратиона, параоксона) в модельных образцах почв, и изучены их свойства. Показана возможность получения биокатализаторов с активностью до 300 Ед/г, что в совокупности со свойствами носителя (биодеградируемость) позволяет ожидать их эффективного применения для биоремедиации почвогрунтов. Аналогов у данной разработки не обнаружено. Были получены гидрофобно-модифицированные опилки и проведена оценка их гидрофобно-гидрофильных свойств. Впервые показано, что «частичная» гидрофобизация опилок обеспечивает в материале сочетание гидрофильных и гидрофобных зон и позволяет организовать крупноячеистую гидрофобную полимерную пленку на внутренней поверхности пор матрицы, что наиболее благоприятно для проведения иммобилизации биокаталитических систем. Впервые разработаны биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов (бактерий Rhodococcus ruber Ac-1413 и Pseudomonas sp. 78Г, а также мицелиальных грибов Aspergillus niger F-679), являющихся активными деструкторами продуктов ферментативного гидролиза фосфорорганических пестицидов, с использованием различных носителей и способов иммобилизации (включение в супермакропористые гидрогели, сорбция на носителях из природных материалов). Определено влияние различных факторов (концентрации клеток и носителя, степени гидрофобизации носителя, времени проведения иммобилизации, типа носителя) на характеристики получаемых биокатализаторов (рН и температурный оптимум действия). Изучены основные особенности функционирования разработанных иммобилизованных биокатализаторов на основе клеток в системах, моделирующих почвогрунты. Кроме того, изучено влияние концентрации самих биокатализаторов и их субстратов, а также времени экспонирования на степень и скорость разложения продуктов ферментативного гидролиза фосфорорганических пестицидов и продуктов деструкции отравляющих веществ. Показана возможность биодеградации самого носителя (опилок) вследствие наличия у выбранного для работы мицелиального гриба Aspergillus niger F-679 активного целлюлолитического комплекса, состав которого, как было установлено в проекте, зависит от типа носителя, используемого для иммобилизации клеток, и условий их культивирования, в частности, рН среды. Разработаны способы получения иммобилизованного биокатализатора (варьированием условий подготовки клеток к иммобилизации, подбором условий включения клеток в матрицу носителя) и самого биокатализатора на основе светящихся бактерий для разработки систем биомониторинга фосфорсодержащих экотоксикантов. Показано, что иммобилизация положительно влияет на температурную стабильность биолюминесценции фотобактерий. Впервые установлены значения концентраций ряда фосфорорганических пестицидов, вызывающих снижение биолюминесценции клеток на 50% (EC50). Показана принципиальная возможность обнаружения фосфорорганических пестицидов с помощью полученных иммобилизованных клеток в почвогрунтах, ранее не исследовавшаяся для иммобилизованных клеток фотобактерий. Впервые была показана возможность использования иммобилизованных нано- (ферментных) и микро- (на основе клеток) биокатализаторов для последовательного разложения ФОС и продуктов их деградации. Таким образом, впервые была продемонстрирована возможность разработки научно-практических подходов к созданию комбинированных биокаталитических систем для комплексного разложения фосфорорганических пестицидов, а также фосфорорганических продуктов деструкции отравляющих веществ в условиях почв. | ||
2 | 1 января 2010 г.-31 декабря 2010 г. | Биоремедиация почв, загрязненных фосфорорганическими соединениями, основанная на применении иммобилизованных нано- и микробиокатализаторов |
Результаты этапа: Впервые в проекте было установлено, что клетки Rhodococcus ruber Ac-1413 способны разлагать не только продукты гидролиза фосфорорганических соединений, но и исходные вещества. Каталитические характеристики этих клеток в отношении Параоксона были исследованным впервые. На основе анализа геномов разных штаммов бактерий рода Rhodococcus, имеющихся в соответствующих базах данных, было теоретически обосновано наличие в клетках Rhodococcus ruber Ac-1413 фермента, по своим характеристикам и строению активного центра аналогичного органофосфатгидролазе, и установлена его локализация в клеточной стенке клеток Rhodococcus. Было разработано четыре лабораторных технологических регламента на получение биокатализаторов на основе иммобилизованных фермента и различных клеток микроорганизмов. На основе этой научно-технической документации были наработаны укрупнённые партии иммобилизованных биокатализаторов, разработанных на 1-ом году выполнения проекта, общей массой свыше 30 кг. Каждая партия, подтвержденная актом наработки, была охарактеризована и использовалась в дальнейших экспериментах. Были определены оптимальные условия функционирования разработанных нано- и микробиокатализаторов на основе фермента с органофосфатгидролазной активностью, а также клеток Pseudomonas sp.78Г, Rhodococcus ruber Ас-1413 и Aspegrillus niger F-679 в различных по химическому составу почвах, загрязненных фосфорорганическими пестицидами (паратионом, параоксоном, метилпаратионом, хлорпирифосом), их продуктами разложения или продуктами разложения отравляющих веществ (3,5,6-трихлор-2-пиридинол и метилфосфоновая кислота). Были определены функциональные характеристики нового биокатализатора на основе иммобилизованных клеток светящихся бактерий в условиях его использования для эффективного биомониторинга процесса разложения фосфорорганических соединений (ФОС) (пестицидов и продуктов разложения фосфорорганических отравляющих веществ) в почвах с различными физико-химическими характеристиками. В результате была создана методика применения нового биокатализатора, суммирующая информацию, необходимую для экологического мониторинга процесса разложения и миграции фосфорорганических соединений в почвах. С использованием биокатализатора на основе иммобилизованного гибридного белка со свойствами рН-чувствительного флуоресцентного зелёного белка и фермента органофосфатгидролазы была разработана функциональная система для проведения пролонгированного биомониторинга присутствия фосфорорганических пестицидов в почве. Были проведены исследования, в ходе которых были определены условия и основные приёмы комбинирования разработанных биокатализаторов на основе иммобилизованных фермента, гидролизующего разные фосфорорганические соединения, и клетки, осуществляющие разложение продуктов ферментативного гидролиза, для их совместного эффективного функционирования в процессах комплексной биоремедиации почв. Установлена необходимость использования ферментного биокатализатора совместно с биокатализатором на основе мицелиального гриба Aspegrillus niger F-679. В то же время показано, что биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток Pseudomonas sp.78Г и Rhodococcus ruber Ас-1413 могут применяться для разложения фосфорорганических соединений в почве без предварительной ферментативной обработки. Было исследовано функционирование фитоценозов в образцах почв, прошедших комплексную обработку, комбинирующую применение иммобилизованных биокаталитических систем на основе ферментов и клеток разных микроорганизмов (бактерий и мицелиальных грибов), с целью элиминирования фосфорорганических соединений. Установлено положительное влияние биокаталитической деградации фосфорорганических соединений на почвенные микроорганизмы и значительное снижение содержания пестицидов в растениях, произрастающих на почвогрунте с введенными в него высокими концентрациями различных ФОС. По итогам проделанной работы подготовлена и подана заявка на Патент РФ на изобретение. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".